Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62418
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Structural Genomics Consortium, University of Toronto, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

Summary

פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.

Abstract

מתילטרנספראז חלבונים (PRMTs) מזרזים את העברת קבוצת מתיל לשאריות ארגינין של חלבוני מצע. משפחת PRMT מורכבת מתשעה חברים שיכולים לעשות מונומטילט או שאריות ארגינין סימטריות/א-סימטריות. מספר נוגדנים המזהים סוגים שונים של מתילציה ארגינין של חלבונים שונים זמינים; לפיכך, מתן כלים לפיתוח מבחני סמנים ביולוגיים של פעילות PRMT. מבחנים מבוססי נוגדנים PRMT מאתגרים בשל מצעים חופפים וספציפי נוגדנים מבוססי מוטיב. נושאים אלה ואת ההתקנה הניסיונית לחקור את מתילציה ארגינין שנתרם על ידי PRMTs בודדים נדונים. באמצעות הבחירה הקפדנית של המצעים הייצוגיים שהם סמנים ביולוגיים לשמונה מתוך תשעה PRMTs, תוכנן פאנל של מבחני פעילות PRMT. כאן, הפרוטוקולים עבור מבחנים תאיים כמותי מדידת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים של משפחת PRMT בתאים מדווחים. היתרון של השיטות המתוארות הוא הביצועים הפשוטים שלהם בכל מעבדה עם תרבות תאים ויכולות כתם מערביות פלואורסצנטיות. הספציפיות של המצע ואמינות הנוגדנים שנבחרו אומתו במלואן עם גישות של הפלה ודיכוי יתר. בנוסף להנחיות מפורטות של סמנים ביולוגיים ונוגדנים לבדיקה, מסופק גם מידע על השימוש באוסף תרכובות של כלי מעכבים עבור PRMTs.

Introduction

מתילציה ארגינין הוא שינוי פוסט-תרגום חשוב המסדיר אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-RNA, ובכך ממלא תפקיד חשוב בתהליכים תאיים שונים כגון שחבור טרום-mRNA, נזק ל- DNA, תגובת שעתוק ותת-תזוזה בתיווך גורמיגדילה 1,2. ארגינין הוא מתילציה על ידי חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) וכתוצאה מכך מונומתיל ארגינין (Rme1), דימתילרגינין אסימטרי (Rme2a), או דימתילרגינין סימטרי (Rme2s)3. בהתבסס על סוג המתילציה, PRMTs מסווגים לשלוש קבוצות: סוג I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 ו- 8), אשר מזרז דימתילציה מונו ואסימטרית; סוג II (PRMT5 ו- PRMT9), אשר מזרז דימתילציה מונו וסימטרית; וסוג III (PRMT7), אשר יכול רק מונומתילאט ארגינין3.

בשל מספר גדל והולך של נוגדנים ספציפיים מתילציה ארגינין זמין מסחרית, פעילות PRMT ניתן למדוד באמצעות סופג המערבי. כתם מערבי מבוסס פלואורסצנטי הוא הטכניקה המועדפת על פני זיהוי chemiluminescent בשל טווח דינמי גדול יותר ליניאריות, רגישות גבוהה יותר, ומאפשרמולטיפלקסים 4. כדי לכמת את רמות המתילציה של החלבון, נדרשת נורמליזציה של אות המתילציה לרמות החלבון הכוללות. על ידי בחירת הנוגדנים לחלבון כולל ומתילציה שגדל במינים מארחים שונים (למשל, עכבר וארנב), ניתן להשתמש בנוגדנים משניים המסומנים בפלואורופורים שונים ואת האות לשני הנוגדנים ניתן לקבוע באותה רצועת מדגם. נוגדנים מתיל ארגינין פותחו כדי לזהות ולאפיין monomethylated, א-סימטרי, או חלבונים דימתילציה סימטרית שבו מתיל ארגינין נמצא בהקשר מסוים. מאז רוב PRMTs מתילאט גליצין- ומוטיבים עשירים ארגינין בתוך המצעים שלהם5, מספר נוגדנים הועלו עבור פפטידים המכילים monomethyl או אסימטרי, סימטרי דימתיל ארגינין-גליצין חוזר כגון D5A12, ASYM24, או ASYM25, ו SYM11, בהתאמה. נוגדנים אחרים מתיל ארגינין נוצרו נגד ספריית פפטיד המכילה דימתיל אסימטרי, סימטרי ומונומתיל ארגינין בהקשר חוזר המאפשר זיהוי של מתיל ארגינין בהקשרים מסוימים אלה6. יש גם מספר גדל והולך של נוגדנים המזהים סימן ארגינין ספציפי על חלבון יחיד המאפשר זיהוי סלקטיבי של מתילציה כגון histone H4R3me2a או BAF155-R1064me2a.

ישנם מספר מעכבי PRMT זמינים מסחרית, אשר יכול לשמש ככלים עבור מבחנים סלולריים PRMT. עם זאת, לא כולם מאופיינים ביסודיות סלקטיביות ואפקטים מחוץ ליעד וחלקם יש להשתמש בזהירות. הקונסורציום הגנומי המבני, בשיתוף עם מעבדות אקדמיות ושותפי פארמה, פיתח מעכבי PRMT חזקים, סלקטיביים וחוטמים לתאים (בדיקות כימיות) הניתנים לשימוש ללא הגבלות על ידי הקהילה המדעית. מידע על מעכבים אלה ניתן למצוא על https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics https://www.chemicalprobes.org/. בדיקות כימיות הן מעכבי מולקולה קטנה עם במבחנה IC50 או Kd < 100 nM, סלקטיביות פי 30 על חלבונים באותה משפחה, ופעילות תאית משמעותית ב 1 מיקרומטר. בנוסף, לכל בדיקה כימית יש אנלוגי כימי קרוב שאינו פעיל נגד היעד המיועד7,8,9,10,11,12.

מטרת פרוטוקול זה היא למדוד את הפעילות הסלולרית של בני משפחת PRMT בודדים בשיטת הכתם המערבי הפלואורסצנטי. כאן מסופקים מידע מפורט על סמנים ביולוגיים מאומתים, נוגדנים ומעכבים חזקים הפעילים בתאים, כמו גם אסטרטגיות יקרות ערך ליישום מוצלח של מבחני אחריות.

Protocol

1. פולחן וציפוי תאים

הערה: תאי תרבות עם מדיה מומלצת ולבדוק באופן שגרתי לזיהום mycoplasma. תאי HEK293T , MCF7 ו- C2C12 נבחרו כדוגמאות מאחר שקווי תא אלה שימשו בהצלחה בהמחאות PRMT.

  1. תרבות HEK293T, MCF7, ו C2C12 ב DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS), פניצילין (100 U mL-1),ו סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם mL-1) ב 10 ס"מ רקמה תרבות מטופלים (TC) מנות.
  2. עבור הבדיקה PRMT8, לגדול PRMT1 בלתי ניתן להריסה HEK293T תאים במדיה המכילה דוקסיציקלין (2 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 3 ימים לפני תחילת הבדיקה.
  3. כדי צלחת התאים, להסיר ולהשליך מדיה מהצלחת.
  4. הוסף 10 מ"ל של PBS (ללא Ca+2 ו מ"ג+2 יונים) כדי לשטוף תאים ולהשליך את הפתרון.
  5. הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%), דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן להשליך את הפתרון. דגירה עד שהתאים הופכים עגולים ומתנתקים מהצלחת. הקש על הצלחת כדי לסייע בניתוק תאים, במידת הצורך. לתאים שקשה לנסות, כגון C2C12, דגירה את הצלחת במשך 1-2 דקות ב 37 °C (69 °F).
    הערה: הימנע מחשיפה לתאים לפתרון טריפסין לפרקי זמן ארוכים יותר (>10 דקות) מכיוון שהוא יפחית את הכדאיות של התאים.
  6. הוסף 1 מ"ל של מדיה מראש לצלחת, ותאי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי פירוק גושים התא. מעבירים תאים לצינור של 15 מ"ל ומוסיפים 3-5 מ"ל של מדיה.
  7. כדי למדוד את מספר התא, לערבב 10 μL של תאים עם 10 μL של כחול Trypan ולהעביר 10 μL כדי hemocytometer או להשתמש בכל שיטת ספירת תאים אחרת.
  8. לדלל תאים לצפיפות התא המומלצת ולשים 500 μL / גם לתוך צלחות TC 24-גם(טבלה 1). עבור מבחנים אנדוגניים (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ו- PRMT9), עבור לשלב 3.1.

2. העברת תאים

  1. עבור מבחנים אקסוגניים (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfect HEK293T תאים עם הכמות המומלצת של DNA (טבלה 2). קל לבצע חילוף של תאי HEK293T כך שניתן יהיה להשתמש בכל מגיב של transfection, בהתאם להוראת היצרן.

3. טיפול מורכב

הערה: אין לחרוג מריכוז דימתיל סולפוקסיד (DMSO) סופי של 0.1% במדיית התרבות. שמרו על אותו ריכוז DMSO בכל באר. מעכבי PRMT סלקטיביים (בדיקות כימיות) ואנלוגיות לא פעילות הקשורות קשר הדוק שלהם ניתן למצוא בטבלה 3.

  1. עבור מבחנים אנדוגניים (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ו- PRMT9), הסר מדיה מתאים והחלף ב- 500 μL של מדיה ב- DMSO או ב- DMSO בלבד (בקרה).
    הערה: זה בדרך כלל לוקח 2 ימים כדי לבחון מעל 80% ירידה ברמות מתילציה R.
  2. עבור מבחנים אקסוגניים (PRMT3, PRMT6, PRMT8), הסר מדיה 4 שעות לאחר transfection, להוסיף 500 μL של מדיה עם מורכב או DMSO לבד (שליטה), ואת הדגירה עבור 20-24 שעות.

4. הכנת lysate התא

  1. הסר את כל המדיה מבארות, לשטוף עם 100 μL של PBS כדי להסיר מדיה שיורית, ולהוסיף 60 μL של מאגר תמוגה (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 10 mM MgCl2, 0.5% טריטון X-100, 12.5 U mL-1 בנזונז, להשלים קוקטייל מעכבי פרוטאז ללא EDTA) לכל באר.
    1. דגירה במשך פחות מ 1 דקות ב RT, נדנדה את הצלחת כדי להפיץ את מאגר תמוגה על התאים. לאחר מכן להוסיף 3 μL של 20% w / v נתרן דודכיל סולפט (SDS), כדי סופי 1 % ריכוז, ומערבבים על ידי רועד בעדינות. מעבירים את lysate לצינורות מיקרוצנטריפוגה ושומרים אותו על הקרח.
      הערה: יש להוסיף קוקטייל מעכבי בנזונז וחלבון טרי לפני השימוש. התוספת של בנזונאס במהירות הידרוליזה חומצות גרעין אשר מפחית צמיגות ליזלת התא.
  2. לקבוע את ריכוז החלבון של הדגימות באמצעות ערכת Assay חלבון BCA או להשתמש בכל שיטה אחרת אשר סובל 1% SDS בתמיסה.
    1. הוסף 2 μL של ליזלת ותקני חלבון (0, 1, 2, 4, ו 8 מיקרוגרם / מ"ל של BSA במאגר תמוגה) לתוך בארות של צלחת 96-היטב ברור.
    2. מערבבים ריאגנט A עם ריאגנט B ביחס של 50:1 ומוסיפים 200 μL לבאר. דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולקרוא את הספיגה.
  3. להתאים את ריכוז החלבון עם מאגר תמוגה כדי להיות שווה על פני הדגימות.
  4. הוסף 20 μL של מאגר טעינה 4x ל 60 μL של ליזלת תאים וחום ב 95 °C (65 °F) במשך 5 דקות. לאחר פירוק חום, lysates ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

5. ניתוח כתמים מערבי

  1. טען 5-20 מיקרוגרם של ליסט התאים הכולל לניתוח חלבוני היסטון ו-20-100 מיקרוגרם לחלבונים אחרים לתוך ג'ל חלבון ביס-טריס 4-12%.
  2. הפעל את הג'ל במאגר ריצה MOPS SDS (50 MM MOPS, בסיס טריס 50 מ"מ, 0.1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7.7) במשך כ 2 שעות ב 100 V או עד חזית הצבע מגיע לתחתית הג'ל.
  3. אם אתם מבצעים העברה רטובה, הרכיבו את כריך ההעברה במאגר העברת טריס-גליצין קר כקרח (25 mM Tris, 192 מ"מ גליצין, 20% v/v מתנול ו-0.05% w/v SDS).
    1. מניחים ספוגים, נייר סינון, קרום PVDF וג'ל בהתאם להוראות היצרן. הפעל קרום PVDF על ידי השרייה במתנול וג'ל שיווי משקל במאגר העברה במשך 30 שניות לפני ההרכבה.
      הערה: השתמש בקרום סופג PVDF המערבי המומלץ שכן יש לו שפעת אוטומטית נמוכה והתאמה לחלבונים במשקל מולקולרי נמוך, כגון היסטונים (שולחן החומרים).
  4. מעבירים חלבונים מהג'ל לקרום PVDF במאגר העברת טריס-גליצין ב-70 וולט למשך 1.5 שעות על הקרח.
  5. חסום קרום למשך 30 דקות בחסימת חיץ (5% חלב עם אגירה פוספטית, PBS). יש לשטוף עם חיץ כביסה (PBST: 0.1% v/v Tween-20 ב-PBS), ולהדגיר עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת אלבומין סרום שור (BSA) (5% BSA ב-PBST) לילה ב-4°C(טבלה 3).
    הערה: לאחסון ארוך יותר, יש לחטא את פתרון BSA במסנן, להוסיף 0.02% עם נתרן אזיד ולשמור על 4 °C (60 °F).
  6. לשטוף קרום 3 x 5 דקות עם PBST. ואז דגירה עם עז נגד ארנב (IR800) וחמור נגד עכבר (IR680) נוגדנים במאגר חסימה מומלץ(שולחן החומרים, טבלה 3)במשך 30 דקות ב RT ולשטוף 3 x 5 דקות עם PBST.
  7. קרא את האות על תמונה כתם מערבי פלואורסצנטי ב 800 ו 700 ננומטר. רצוי להשתמש בכלי המאפשר הדמיה רצועות חזקות ועמימות בבירור בתמונה אחת עם רגישות גבוהה וטווח דינמי, יחס אות לרעש גבוה, אזהרה כאשר מגיעים לרוויה בתמונה, כמו גם ריבוי של שני צבעים פלואורסצנטיים באותה רצועה לדוגמה.
  8. קבע את עוצמות הרצועה עבור ניתוח כתמים מערביים באמצעות תוכנה מתאימה להדמיה מערבית פלואורסצנטית.

Representative Results

להלן דוגמאות לתוצאות כתם מערביות עבור מבחנים סלולריים של PRMTs בודדים. פרטי מבחנים מסוכמים גם בטבלה 4.

מבחני PRMT1
PRMT1 הוא התורם העיקרי היסטון 4 ארגינין 3 דימתילציה אסימטרית (H4R3me2a) בתאים13. עם אובדן פעילות PRMT1, רמות Rme1 ו- Rme2s גלובליות להגדיל באופן משמעותי13. כפי שמוצג באיור 1A ו-1B, ניתן להשתמש במספר נוגדנים כדי לעקוב אחר שינויים גלובליים ב- Rme1, Rme2a, Rme2s, כמו גם ב- H4R3me2a. ניתן לראות ירידה משמעותית ברמות Rme2a ו-H4R3me2a העולמיות ועליות ברמות Rme1 ו-Rme2s לאחר 3 ימים של הפלת PRMT1 (איור 1A, B). קווי תאים שונים באות הבסיסי H4R3me2a, ולכן, כדי להקל על ניטור אובדן פעילות PRMT1, ניתן להשתמש בקווי תאים כגון MCF7 עם רמות מתילציה בסיסיות גבוהות (איור 1C). הזמן האופטימלי להתבונן בהשפעה של עיכוב PRMT1, למשל על טיפול עם סוג I PRMT מעכב MS0238, הוא 2 ימים (איור 1D, 1E). טיפול ארוך יותר גורם לכדאיות וצמיחה מופחתת של התאים.

מבחני PRMT3
עבור הבדיקה התאית PRMT3, אין חלבונים סמן ביולוגי סלקטיבי אשר שינויי מתילציה יכול להיות מזוהה כתם המערבי על הפלת PRMT3 או overexpression. PRMT3 הוכח באופן א-סימטרי דימתילאט H4R3 במבחנה14, עם זאת, הסימן מופקד בעיקר על ידי PRMT1, ולכן בדיקה אקסוגנית עם PRMT3 מוגזם תוכנן. בהתאם לממצאי הפריה חוץ גופית, הפשטת יתר של PRMT3 מסוג פראי אך לא המוטנט הקטליטי שלו (E338Q) הובילה לעלייה ברמות H4R3me2a (איור 2A). נעשה שימוש בתאי HEK293T מכיוון שיש להם מתילציה בסיסית נמוכה של סימן זה (איור 1C). ההסמכה אומתה עוד יותר עם מעכב סלקטיבי PRMT3 SGC7077, אשר עיכב מתילציה אסימטרית PRMT3 תלויה PRMT3 (איור 2B).

מבחני PRMT4
PRMT4 דימתילטים א-סימטריים BAF155 בארגינין 106415. מאז הנוגדן גילוי BAF165-R1064me2a זמין מסחרית, פעילות PRMT4 בתאים ניתן לפקח על ידי כתם מערבי על ידי גילוי השינויים ברמות סימן R1064me2a. אובדן חלבון PRMT4 או עיכוב של פעילות קטליטית עם מעכב סלקטיבי PRMT4, TP-06410, תוצאות ירידה ברמות BAF165-R1064me2a (איור 3). טיפול של יומיים הוא בדרך כלל מספיק כדי להסיר את רוב אות מתילציה.

מבחני PRMT5
PRMT5 אחראי על רוב החלבון ארגינין דימתילציה סימטרית. בעבר דווח כי החלבונים המורכבים השונים של SMN, כולל SmBB', הם מצעי PRMT516. ניתן לעקוב אחר פעילות PRMT5 על ידי התבוננות בשינויים ברמות הגלובליות של דימתילציה סימטרית של ארגינין או דימתילציה סימטרית של חלבוני SmBB. הפלת PRMT5, אך לא PRMT1, 3, 4, 6 ו- 7 גורמת לירידה ברמות Rme2s העולמיות (איור 4A). ברוב קווי התאים, הטיפול בתאים עם מעכבי PRMT5 סלקטיביים LLY-28311 ו- GSK591 במשך 2-3 ימים דיכא את רוב האות SmBB'Rme2s (איור 4B). רוב התאים רגישים לעיכוב PRMT5, וכתוצאה מכך לירידה בהתפשטות התאים ומוות התאים עם חשיפה ממושכת למעכבים.

מבחני PRMT6
דווח כי PRMT6 הוא התורם העיקרי היסטון H3 ארגינין 2 דימתילציה אסימטרית (H3R2me2a) בתאים17. בתאי HEK293T, הפלת PRMT6 במשך 3 ימים לא הספיקה כדי לצפות בירידה משמעותית ברמות H3R2me2a. עם זאת, דיכוי יתר של סוג פראי PRMT6 אך לא המוטנט הקטליטי שלו (V86K/D88A) מגביר את רמות H3R2me2a, כמו גם H3R8me2a ו- H4R3me2a (איור 5A). ישנם מספר מעכבים המעכבים פעילות PRMT6 עם עוצמה וסלקטיביות שונות: סלקטיבי, מעכב PRMT6 אלוסטרי SGC687018, PRMT סוג אני מעכב MS0238, ו PRMT4/6 מעכב MS0499. כל אלה מעכבים PRMT6 תלוי H3R2 (איור 5B), כמו גם H4R3 ו H3R8 דימתילציה אסימטרית (נתונים לא מוצגים).

מבחני PRMT7
PRMT7 מונומטילates ארגינין 469 הן בצורות מכוננות והן בצורות בלתי ניתנות להשבכה של HSP70 (HSPA8 ו- HSPA1/6, בהתאמה)12. אמנם אין נוגדנים זמינים מסחרית, אשר לזהות רמות HSP70-R469me1, הסימן ניתן לזהות עם נוגדני pan monomethyl. אובדן חלבון PRMT7 או עיכוב של פעילות קטליטית עם מעכב סלקטיבי PRMT7, SGC302712, תוצאות בירידה ברמות של HSP70-R469me1 (איור 6A, B). SGC3027 הוא prodrug חדיר לתאים, אשר בתאים מומר על ידי רדוקטאזים למעכב סלקטיבי PRMT7 SGC8158, ולכן העוצמה הסלולרית עשויה להיות שונה בין קווי התא. מספר קווי תאים סרטניים מבטאים צורות HSP70 בלתי ניתנות להכנעה ברמות גבוהות, וקשה לזהות מתילציה עקב רצועה לא ספציפית חופפת ממוצא גרעיני(איור 6C). לכן, עבור ה- PRMT7 cellular assay, קווי תאים המבטאים בעיקר HSPA8 כגון C2C12 מומלצים, או מאז HSP70 לוקליזציות בעיקר ציטופלסמה, לקבוע HSP70-R469me1 רמות בחלק הציטופלסמי של קווי תאים מועדפים.

מבחני PRMT8
PRMT8 הוא PRMT רק עם דפוס ביטוי מוגבל רקמה - לידי ביטוי בעיקר במוח19. הוא חולק דמיון רצף של 80% ויש לו העדפת מצע דומה לזו של PRMT119. זה שונה PRMT1 בעיקר ב N-terminus, שם תוצאות myristoylation בשיתוף של PRMT8 עם קרום הפלזמה20. דווח כי PRMT8 יחד עם PRMT1 מתילאטים RNA מחייב חלבון EWS21. מאז פעילות PRMT8 הוא נמוך בקווי תאים שאינם עצביים EWS יכול גם להיות מתילציה על ידי PRMT1, מבחני שבו PMRT8 הוא coexpressed יחד עם EWS בתאי הפלה PRMT1 פותחה. מכיוון ש-PRMT1 הוא גן חיוני וההפסד ארוך הטווח שלו גורם למוות של תאים, מערכת בלתי ניתנת להכנעה שבה PRMT1 נופל במשך 3 ימים לפני השימוש ב-PRMT8 assay נוצל (איור 7A). ביטוי משותף של PRMT8 מסוג פראי, אך לא מוטנט לא פעיל קטליזה (E185Q), יחד עם EWS הביא לרמות גבוהות יותר של דימתילציה אסימטרית EWS (איור 7B). מספר נוגדנים דימתילרגינין אסימטרי נבדקו ואת מתילציה זוהה רק עם נוגדן Asym25. הבדיקה אומתה עוד יותר עם בדיקה כימית סלקטיבית מסוג PRMT I, MS0238, אשר הפחיתה דימתילציה אסימטרית תלוית PRMT8 של EWS אקסוגני(איור 7B). למרות MS023 הוא חזק מאוד עיכוב PRMT8 במבחנות במבחנה, בתאים ריכוזים גבוהים של MS023 נדרשים לראות עיכוב מתילציה21.

מבחני PRMT9
PRMT9 הוצג לדימתילאט SAP145 באופן סימטרי בארגינין 50822. למרבה הצער, אין נוגדנים זמינים מסחרית יכולים לזהות את הסימן. לבדיקת PRMT9, נעשה שימוש בנוגדנים שהוענקו בחביבות על ידי ד"ר יאנדז'ונג יאנג (מכון המחקר בקמן של עיר התקווה). כאשר מוגזם, סוג פראי אך לא מוטנט R508K SAP145 הוא מתילציה על ידי PRMT9 (איור 8A). ההסמכה נועדה לפקח על רמות SAP145-R508me2s אנדוגני ואומתה עם תרכובת X, מעכב PRMT9 אב טיפוס (עבודה בתהליך, עדיין לא פורסם), אשר מעכב בעוצמה PRMT9 במבחנה עם עוצמה ננומולרית. תרכובת X הורידה את רמות SAP145-R508me2s באופן תלוי מינון (איור 8B).

Figure 1
איור 1. מבחני PRMT1 סלולריים. (A) נפילת PRMT1 גורמת לירידה של דימתילציה ארגינית אסימטרית גלובלית (Rme2a) ורמות גבוהות יותר של דימתילציה ארגינית סימטרית (Rme2s) ומונומתילציה (Rme1). יעילות ההפלה PRMT1 מוצגת בלוח B.(B)PRMT1 נוקאאוט מקטין דימתילציה אסימטרית של histone H4R3 (H4R3me2a). (C) רמות הבסיס H4R3me2a שונות על פני קווי תא שונים. (ד)סוג I PRMT מעכב MS023 מקטין את רמות H4R3me2a באופן תלוי מינון. תאי MCF7 טופלו ב-MS023 במשך יומיים. (E) הגרף מייצג את ההתאמה הלא ליניארית של עוצמות אותות H4R3me2a מנורמלות להיסטון H4 הכוללת. MS023 IC50 = 8.3 nM (n = 1). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. מבחני PRMT3 סלולריים. (A)ההגזמה של סוג פראי (WT) אך לא מוטציה קטליטי E338Q של PRMT3 מגבירה את רמות H4R3me2a בתאי HEK293T. תאים היו transfected עם דגל מתויג PRMT3 עבור 24 h. (B) PRMT3 מעכב סלקטיבי, SGC707, מקטין ECTOPIC PRMT3 תלוי H4R3 demethylation אסימטרי אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. מבחני PRMT4 סלולריים. (A) PRMT4 תוצאות הפלה בירידה של BAF155-R1064 דימתילציה ארגינין אסימטרי (תאי HEK293T). מעכבסלקטיבי PRMT4, TP-064, מקטין את רמות BAF155-R1064Rme2a. תאי HEK293T טופלו עם תרכובת במשך 2 ימים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. מבחנים סלולריים PRMT5. (A) נפילת PRMT5 גורמת לירידה ברמות דימתילציה ארגינין סימטריות גלובליות (תאי MCF7). (B)מעכבי PRMT5 סלקטיבי GSK591 ו LLY-283, להקטין SmBB' סימטרי ארגינין דימתילציה (ירוק), בעוד רמות הכולל של SmBB' להישאר ללא שינוי (אדום). תאי MCF7 טופלו בתרכובות במשך יומיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. מבחני PRMT6 סלולריים. (A)ההגזמה של סוג פראי (WT) אך לא V86K/D88A מוטציה קטליטי PRMT6 מגביר H4R3me2a, H3R2me2a, ו H3R8me2a רמות בתאי HEK293T. תאים הודבקו עם PRMT6 מתויג בדגל עבור 24 h. ( (B) PRMT6 מעכב סלקטיבי (SGC6870), מעכב סוג PRMT I (MS023), ומעכב PRMT4/6 (MS049) להקטין את רמות H3R2me2a תלוי PRMT6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. מבחני סלולר PRMT7. (A) PRMT7 תוצאות הסתרה בירידה של מונומתילציה HSP70-R469 (תאי HCT116). (B)מעכבי PRMT7 סלקטיביים, SGC3027, מקטין HSP70-R469 monomethylation בתאי C2C12. התאים טופלו עם תרכובת במשך 2 ימים. (C) זיהוי של HSP70-R469 מתילציה של HSP70 בלתי ניתן לתכלית (HSPA1/6) עם נוגדני arginine מונומתיל פאן (Rme1) יכול להיות קשה בשל רצועה לא ספציפית חופפת ממוצא גרעיני. מומלץ למדוד את רמות המתילציה HSP70 בשבר הציטופלסמי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7. מבחני סלולר PRMT8. (A)מתילציה PRMT8 של EWS ניתן לזהות כאשר פעילות PRMT1 מעוכבת על ידי הפלה. תאי HEK293T הועברו עם וקטור הפלה PRMT1 בלתי ניתן להעברה. לאחר 3 ימים של טיפול דוקסיציקלין, רמות PRMT1 הופחתו באופן דרסטי. (B) כאשר PRMT1 הוא הפיל, EWS אקסוגני הוא דימתילציה א-סימטרית על ידי סוג פראי מוגזם PRMT8 אבל לא מוטנט קטליטי (E185Q) של PRMT8. מתילציה הוא ירד על ידי ריכוז גבוה של מעכב סוג PRMT אני (MS023). HEK293T PRMT1תאי KD היו במשותף עם סוג פראי PRMT8 מתויג בדגל או מוטציה קטליטית ו- GFP מתויג EWS וטופלו MS023 עבור 20 שעות.

Figure 8
איור 8. מבחני PRMT9 סלולריים. (A) סוג פראי אך לא מוטציית R508K SAP145 הוא מתילציה על ידי PRMT9. תאי HEK293T הודבקו בתגית GFP SAP145 למשך יום אחד. (B)אב הטיפוס מעכב PRMT9 (תרכובת X) מקטין PRMT9 תלוי R508 דימתילציה סימטרית של SAP145 באופן תלוי מינון. תאי HEK293T טופלו עם המתחם במשך 2 ימים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

PRMT תאים צפיפות לכל מ"ל
PRMT1 MCF7 1 x 105
PRMT3 HEK293T 2 x 105
PRMT4 HEK293T 1 x 105
PRMT5 MCF7 1 x 105
PRMT6 HEK293T 2 x 105
PRMT7 C2C12 1 x 105
PRMT8 HEK293T (PRMT1 KD)* 2 x 105
PRMT9 HEK293T 2 x 105
* לטפל בתאים עם דוקסיציקלין (2 מיקרוגרם / מ"ל) 3 ימים לפני הציפוי עבור PRMT8 בדיקה

שולחן 1. סוגי תאים וצפיפויות המומלצים עבור מבחני PRMT.

PRMT מיקרוגרם DNA/24-באר אדג'ין (תוסף) # הערות נוספות
PRMT3 0.5 דגל-PRMT3 164695
או 0.5 דגל-PRMT3 (E338Q) 164696
PRMT6 0.5 דגל-PRMT6 164697
או 0.5 דגל-PRMT6(V86K/D88A) 164698
PRMT8 0.05 EWS-GFP 164701
0.45 PRMT8-דגל 164699
או 0.45 PRMT8 (E185Q)-דגל 164700
PRMT9 0.05 SAP145-GFP נה מתנה מד"ר יאנדז'ונג יאנג, מכון המחקר בקמן של עיר התקווה
או 0.05 SAP145-R508K-GFP
0.45 וקטור ריק

שולחן 2. ריכוז הדנ"א המומלץ לניסוי טרנס-פליטה.

PRMT נוגדן בדיקה כימית (פעילות התא IC50) שליטה שלילית
PRMT1 H4R3me2a (1:2000) MS023 - סוג PRMT I MS094
Rme1 (1:1000) (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, בהתאמה)
Rme2s (1:2000)
Rme2a (1:2000)
Rme2a (ASYM24, 1:3000)
Rme2a (ASYM25, 1:2000)
H4 (1:2000)
B-אקטין (1:500 )
PRMT3 H4 (1:2000) SGC707 (IC50 = 91 nM) XY-1
H4R3me2a (1:2000)
דגל (1:5000)
PRMT4 BAF155 (1:200) TP-064 (IC50 = 43 nM) TP064N
BAF155-R1064me2a (1:3000) סקי-73 (IC50 = 540 ננומטר)* סקי-73N*
PRMT5 אנטי SmBB' (1:100) LLY-283 (IC50 = 30 ננומטר) LLY-284
Rme2s (#13222, 1:2000) GSK591 (IC50 = 56 nM) SGC2096
PRMT6 H4R3me2a (1:2000) SGC6870 (IC50 = 0.9 מיקרומטר) SGC6870N
H4 (1:2000) MS023 - סוג PRMT I MS094
H3R2me2a ( 1:2000) (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, בהתאמה)
H3R8me2a (1:2000) MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 ננומטר, בהתאמה) MS049N
H3 ( 1:5000)
דגל ( 1:5000)
PRMT7 Rme1 (1:1000) SGC3027 (IC50 = 1300 nM) * SGC3027N*
Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8 GFP (1:3000) MS023 (50 מיקרומטר) MS094
Rme2a (ASYM25,1:2000)
דגל (1:5000)
PRMT9 SAP145 (1:1000)
SAP145-R508me2s - מתנה מסוג ד"ר ינדז'ונג יאנג, מכון המחקר בקמן של עיר התקווה (1:1000) (PIMID: 25737013)
נוגדנים משניים עז נגד ארנב IgG-IR800 (1:5000)
חמור נגד עכבר IgG-IR680 (1:5000)
*- נוגדן מזהה HSPA8, HSPA1 ו- HSPA6 (נבדק עם חלבונים מתויגים GFP overexpressed), * prodrug – IC50 עשוי להיות שונה בין קווי תאים שונים

שולחן 3. נוגדנים מומלצים ותרכובות בדיקה כימית PRMT / כלי בקרה שליליים.

PRMT סמן ביולוגי קריאת אסאיי אימות בדיקה קו תא מומלץ שופט, שופט.
PRMT1 H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a רמות H4R3me2a מנורמלות לסך כל רמות Rme1, Rme2a או Rme2s הגלובליות של H4 מנורמלות ל- B-actin. הפלה של PRMT1 ירד H4R3me2a הבסיס ורמות Rme2a גלובליות ורמות Rme1 ו Rme2s גלובליות מוגברות בתאים (איור.1A, B). PRMT סוג I בדיקה כימית MS023 ירד רמות H4R3me2a באופן תלוי מינון (איור 1D). התאים שונים ברמות H4R3me2a הבסיסיות (איור 1C). לתאי MCF7 יש רמות גבוהות של H4R3me2a בסיסיות מה שהופך אותו לעדיף עבור מבחני ניטור הירידה בפעילות PRMT1. 8
PRMT3 H4R3me2a H4R3me2a רמות מתילציה הנגרמת על ידי דגל אקסוגני מתויג PRMT3 WT או מוטציה קטליטי E338Q (רקע) מנורמל H4 histone הכולל דיכוי יתר של PRMT3 מסוג פראי אך לא המוטנט הקטליטי שלו (E338Q) הגדיל את H4R3me2a (איור 2A). PRMT3 מעכב סלקטיבי SGC707 ירד PRMT3 תלוי עלייה ברמות H4R3me2a (איור. 2B) לתאי HEK293T יש רמות H4R3me2a בסיסיות נמוכות (איור 1C), מה עדיף לניטור פעילות PRMT3 אקסוגנית 7
PRMT4 BAF155-R1064me2a רמות BAF155-R1064me2a מנורמלות לסך הכל BAF155 הפלת PRMT4 ירדה דימתילציה אסימטרית של BAF155 (איור 3A). טיפול של יומיים עם בדיקה כימית סלקטיבית PRMT4 (TP-064) ירד דימתילציה אסימטרית של BAF155 (איור 3B). כל קו תא 10
PRMT5 SmBB'-Rme2s רמות SmBB'-Rme2s זוהו עם נוגדני Rme2s פאן (CST) מנורמל לסך SmBB' הפלת PRMT5 הביאה לירידה ברמות הדימתילציה הסימטריות של SmBB (איור 4A). טיפול של יומיים עם בדיקות כימיות סלקטיביות PRMT5, GSK591 ו LLY285, ירד SmBB'-Rme2s רמות (איור. 4B). כל קו תא 11
PRMT6 H4R3me2a
H3R2me2a
H3R8me2a		 H4R3me2a, H3R2me2a או H3R8me2a רמות מתילציה מוגברות על ידי דגל אקסוגני מתויג PRMT6 WT אבל לא קטליטי V86K, מוטציה D88A (רקע) מנורמל כדי H4 היסטון הכולל או H3, בהתאמה דיכוי יתר של סוג פראי PRMT6 אך לא מוטציה קטליטי שלה (V86K,D88A) גדל H3R2me2a, H3R8me2a ו H4R3me2a רמות (איור. 5A). מעכב PRMT6 אלוסטריק (SGC6870), מעכבי PRMT מסוג I MS023 , מעכב PRMT4/6 MS049 ירד PRMT6 תלוי עלייה ברמות H3R2me2a (איור. 5B). לתאי HEK293T יש רמות נמוכות של H4R3me2a, H3R2me2a ו- H3R8me2a, אשר עדיף לניטור פעילות PRMT6 אקסוגני 8,9
PRMT7 HSP70-R469me1 רמות מתילציה HSP70-Rme1 מנורמלות לסך הכל HSP70 נוקאאוט או הפלה של PRMT7 הפחיתו את המונומטילציה של HSP70 (איור 6A). טיפול של יומיים עם בדיקה כימית סלקטיבית PRMT7 SGC3027 ירד PRMT7 תלוי HSP70 monomethylation באופן תלוי מינון (איור. 6B). C2C12, HT180
מספר קווי תאים סרטניים מבטאים צורה בלתי ניתנת להמחה של HSP70 שאות מתילציה שלו חופף לחלבון לא ספציפי ממוצא גרעיני (איור 6C). במקרה זה, אנו ממליצים לנתח את רמות המתילציה HSP70 בשבר הציטופלסמי.		 12
PRMT8 EWS-Rme2a רמות מתילציה EWS מתויגות על ידי EXOGENOUS GFP הנגרמות על ידי מוטציה קטליטית PRMT8 WT או E185Q מתויגת בדגל אקסוגני (E185Q), מנורמלת לאות GFP כולל בתאי PRMT1 KO. הפרזה יתר של סוג פראי PRMT8 אבל לא קטליטי E185Q מוטציה מתילציה חוץ רחמית EWS רק בתאי PRMT1 KD (איור. 7A). PRMT סוג I בדיקה כימית MS023 מעוכבת דימתילציה אסימטרית של EWS אקסוגני על ידי PRMT8 (איור. 8B). HEK293T PRMT1 KD (בלתי ניתן להכנעה).
נפילת PRMT1 גורמת למוות תאי ולכן אנו ממליצים להשתמש במערכת בלתי ניתנת להזנה.		 8
PRMT9 SAP145-R508me2s דימתילציה סימטרית תלויה ב-PRMT9 של SAP145 ב-R508 מנורמלת ל-SAP145 ההפסד PRMT9 אך לא PRMT5 מוביל לירידה בדימתילציה סימטרית של SAP145. SAP145 WT שתייגת GFP אך לא SAP145mut (R508K) היה מתילציה על ידי PRMT9 (איור 8A). טיפול של יומיים עם Copound X, אב הטיפוס מעכב PRMT9, ירד רמות SAP145-R508me2s באופן תלוי מינון תאנה 8B). כל קו תא 21

שולחן 4. סיכום מבחני PRMT.

Discussion

כאן מתוארים פרוטוקולי הבדיקה הסלולרית המפורטים לבני משפחת PRMT המשתמשים בשיטות סופגות מערביות פלואורסצנטיות. מצעים ייחודיים שעבורם ניתן לזהות בקלות את השינויים במתילציה של ארגינין על אובדן PRMT בודד או עיכוב קטליטי ולא ניתן לפצות אותם על ידי בני משפחה אחרים נבחרו. חלבונים מסוימים מתילציה על ידי PRMTs מרובים21,23, מציע חפיפה ספציפית מצע שבו כמה PRMTs לתרום רק כמות קטנה של סימן הסלולר במצע חלבון נתון24,25,26,27, למשל, הן PRMT8 ו PRMT1 לתרום מתילציה של EWS. לכן, כל בדיקה דרשה אימות יסודי של מצעים ונוגדנים עם ניסויי הפלה ו/או דיכוי יתר ואימות נוסף עם מעכבים סלקטיביים מאופיינים היטב. PRMT מצעים ספציפיים זוהו אשר שינויים סימן מתילציה ניתן לזהות בתוך 2-3 ימים לאחר PRMT הפסד / עיכוב, כדי למנוע השפעות הרכבה של הכדאיות התא מופחת התפשטות שעלולה להשפיע בעקיפין על רמות סימן מתיל ארגינין. למרות שניתן היה למצוא מצעים ייחודיים עבור PRMT1, 4, 5, 7 ו- 9; עבור PRMT3, 6, ו 8 הרווח של גישת פונקציה היה צריך להיות מועסק. מספר נוגדנים ספציפיים למתיל ארגינין נבדקו למטרות תאיות שונות, אך אף אחד מהם לא הצליח לזהות שינויים משמעותיים בתוך 3 ימים מהפלת PRMT3 ו- PRMT6; לכן, מבחני סמנים ביולוגיים פותחו באמצעות אנזימים מבוטאים חוץ רחמית יחד עם מוטנטים לא פעילים קטליטית, אשר שימשו כפקד על מתילציה מצע הבסיס. PRMT8 הוא הומולוג PRMT1 קרוב וחולק העדפות מצע דומות. כמו סמן ביולוגי סלקטיבי PRMT8 לא ניתן היה לזהות, הבדיקה בתאי ההפלה PRMT1 פותחה, שם PRMT8 הובע במשותף יחד עם EWS. PRMT1 הוא גם אנזים מרכזי האחראי על מתילציה אסימטרית H4R3, ולכן, להשתמש H4R3me2a כמו סמן ביולוגי עבור PRMT3 ו PRMT6 מבחנים הסלולר, תאים עם רמות נמוכות הבסיסית H4R3me2a נבחרו, כמו גם מוטציות לא פעילים קטליטי שימשו כבקרת רקע. למרות מבחנים אנדוגניים עדיפים, מבחנים אקסוגניים להוכיח לא יסולא בפז לבדיקת העוצמה התאית של מספר מעכבי PRMT סלקטיבי7,8,9. עם הידע הגובר של ביולוגיה PRMT, אנו מצפים לשפר את מבחני על ידי מציאת חלבונים סמנים ביולוגיים ספציפיים יותר עבור PRMT3, PRMT6, ו PRMT8.

השימוש בנוגדנים מאומתים ובקרות מתאימות הם קריטיים לביצועי מבחני PRMT. כל הנוגדנים המומלצים כאן קיבלו תוקף יסודי על ידי ניסויי הפלה ודיכוי יתר, עם זאת, הבדלי אצווה לאצווה, במיוחד במקרה של נוגדנים פוליקלונליים, עדיין עשויים להשפיע על הביצועים שלהם. לכן, חיוני להשתמש בשיטות גנטיות ובדיקות כימיות יחד עם הבקרות השליליות הקשורות קשר הדוק שלהם כדי לאשר את אמינות הבדיקה. בנוסף, עבור מבחני PRMT הדורשים ביטוי יתר של חלבון, חיוני להשתמש במוטנטים לא פעילים קטליטית יחד עם חלבון מסוג בר כדי לקבוע את רמות המתילציה הבסיסית.

אוסף זה של מבחנים כמותיים ליצירת פרופיל הפעילות של PRMTs בתאים יכול להיות שימושי באופן נרחב עבור הקהילה המדעית שכן ניתן ליישם אותו במהירות ובקלות עם ציוד מינימלי ומומחיות טכנית מוגבלת, הכוללת רק טכניקות בסיסיות של culturing תאים ו fluorescent המערבי סופג. הנוגדנים המומלצים ובדיקות כימיות עבור PRMTs יכולים לשמש גם עבור בדיקות פרופיל חלבון מבוסס פעילות (ABPP) כדי לקבוע את ההתאמה של בדיקה ABPP נתון, לפקח על מעורבות היעד, ולהעריך את ההשפעות מחוץ ליעד באמצעות פורמט ABPP תחרותי. גישות פיתוח מבחני הדיון כאן יכולות גם להיות מעודנות עבור משפחות אנזימים אחרות כגון ליצין חלבון-מתילטרנספראזים ואצטילטרנספראזים.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או אינטרסים סותרים אחרים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

קונסורציום הגנומיקה המבנית הוא ארגון צדקה רשום (לא: 1097737) שמקבל כספים מ- AbbVie, באייר AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, גנום קנדה באמצעות מכון גנומיקה באונטריו [OGI-196], האיחוד האירופי ו- EFPIA באמצעות היוזמה לתרופות חדשניות 2 התחייבות משותפת [מענק EUbOPEN 875510], ינסן, מרק KGaA (aka EMD בקנדה ובארה"ב), פייזר, טקדה וקרן Wellcome [106169/ZZ14/Z

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm TC dishes Greiner bio-one 664160
24-well TC plates Greiner bio-one 662160
4–12% Bis-Tris Protein Gels ThermoFisher Scientiffic NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF membrane Millipore-Sigma 10600021
anti-Asym 24 Millipore-Sigma 07-414
anti-Asym 25 Millipore-Sigma 09-814
anti-B-actin Santa Cruz Biotechnologies sc-47778
anti-BAF155 Santa Cruz Biotechnologies sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a Millipore-Sigma ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000) Millipore-Sigma F4799
anti-GFP Clontech 632381
anti-H3 Abcam ab10799
anti-H3R2me2a Millipore-Sigma 04-848
anti-H3R8me2a Rockland 600-401-I67
anti-H4 Abcam ab174628
anti-H4R3me2a Active Motif 39705
anti-Hsp/Hsc70 Enzo ADI-SPA-820
anti-PRMT1 Millipore-Sigma 07-404
anti-PRMT3 Abcam ab191562
anti-PRMT4 Bethyl #A300-421A
anti-PRMT5 Abcam ab109451
anti-PRMT6 Abcam ab47244
anti-PRMT7 Abcam ab179822
anti-Rme1 CST 8015
anti-Rme2a CST 13522
anti-Rme2s CST 13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) 09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) Abcam ab56800
anti-SAP145-R508me2s kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
anti-SmBB’ Santa Cruz Biotechnologies sc-130670
benzonase PRODUCED IN-HOUSE
BSA Millipore-Sigma A7906
C2C12 gift from Dr. Stephane Richard, McGill University
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Millipore-Sigma 11873580001
DMEM Wisent 319-005-CL
DMSO Bioshop DMS666.100
donkey anti-mouse IgG-IR680 Licor 926-68072
doxycycline Millipore-Sigma D9891
EDTA Bioshop EDT111.500
FBS Wisent 80150
glycine Bioshop GLN002.5
goat-anti-rabbit IgG-IR800 Licor 926-32211
HEK293T gift from Dr. Sam Benchimol, York University
Image Studio Software ver 5.2 Licor
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) ThermoFisher Scientiffic NP0007
MCF7 ATCC® HTB-22™
NaCl Bioshop SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer ThermoFisher Scientiffic NP0001
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) Licor 927-40000 Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001
Odyssey CLX Imaging System Licor model number 9140
PBS (tissue culture) Wisent 311-010-CL
PBS (western blot) Bioshop PBS405.4
penstrep Wisent 450-201-EL
Pierce™ BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientiffic 23225
SDS Bioshop SDS001.1
skim milk powder Bioshop SKI400.500
TC20 automated cell counter Biorad 1450102
Tripsin-EDTA (0.25%) Wisent 325-043-EL
Tris Bioshop TRS003.5
Tritton X-100 Bioshop TRX506
trypan blue GIBCO 15250-061
Tween-20 Bioshop TWN510.500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine Methylation: The Coming of Age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  2. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  3. Bedford, M. T., Richard, S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function. Molecular Cell. 18 (3), 263-272 (2005).
  4. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. The Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
  5. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  6. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Science Reports. 3, 1311 (2013).
  7. Kaniskan, H. U., et al. A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3). Angewandte Chemie International Edition. 54 (17), 5166-5170 (2015).
  8. Eram, M. S., et al. A Potent, Selective, and Cell-Active Inhibitor of Human Type I Protein Arginine Methyltransferases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 772-781 (2016).
  9. Shen, Y., et al. Discovery of a Potent, Selective, and Cell-Active Dual Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 4 and Protein Arginine Methyltransferase 6. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (19), 9124-9139 (2016).
  10. Nakayama, K., et al. TP-064, a potent and selective small molecule inhibitor of PRMT4 for multiple myeloma. Oncotarget. 9 (26), 18480-18493 (2018).
  11. Bonday, Z. Q., et al. LLY-283, a Potent and Selective Inhibitor of Arginine Methyltransferase 5, PRMT5, with Antitumor Activity. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (7), 612-617 (2018).
  12. Szewczyk, M. M., et al. Pharmacological inhibition of PRMT7 links arginine monomethylation to the cellular stress response. Nature Communications. 11 (1), 2396 (2020).
  13. Goulet, I., Gauvin, G., Boisvenue, S., Cote, J. Alternative splicing yields protein arginine methyltransferase 1 isoforms with distinct activity, substrate specificity, and subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 33009-33021 (2007).
  14. Siarheyeva, A., et al. An allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3. Structure. 20 (8), 1425-1435 (2012).
  15. Stefansson, O. A., Esteller, M. CARM1 and BAF155: an example of how chromatin remodeling factors can be relocalized and contribute to cancer. Breast Cancer Research. 16 (3), 307 (2014).
  16. Pesiridis, G. S., Diamond, E., Van Duyne, G. D. Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21347-21359 (2009).
  17. Guccione, E., et al. Methylation of histone H3R2 by PRMT6 and H3K4 by an mLL complex are mutually exclusive. Nature. 449 (7164), 933-937 (2007).
  18. Yudao Shen,, L, F., et al. A First-in-class, Highly Selective and Cell-active Allosteric Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6). BioRxiv. , 1-21 (2020).
  19. Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Identification of proteins interacting with protein arginine methyltransferase 8: the Ewing sarcoma (EWS) protein binds independent of its methylation state. Proteins. 72 (4), 1125-1137 (2008).
  20. Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S., Bedford, M. T. PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family. Journal of Biological Chemistry. 280 (38), 32890-32896 (2005).
  21. Kim, J. D., Kako, K., Kakiuchi, M., Park, G. G., Fukamizu, A. EWS is a substrate of type I protein arginine methyltransferase, PRMT8. International Journal of Molecular Medicine. 22 (3), 309-315 (2008).
  22. Yang, Y., et al. PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145. Nature Communications. 6, 6428 (2015).
  23. Rakow, S., Pullamsetti, S. S., Bauer, U. M., Bouchard, C. Assaying epigenome functions of PRMTs and their substrates. Methods. 1175, 53-65 (2020).
  24. Musiani, D., et al. Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity. Science Signaling. 12 (575), (2019).
  25. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and Computational Approaches for the Large-Scale Analysis of Protein Arginine Methylation by Mass Spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  26. Shishkova, E., et al. Global mapping of CARM1 substrates defines enzyme specificity and substrate recognition. Nature Communications. 8, 15571 (2017).
  27. Pawlak, M. R., Banik-Maiti, S., Pietenpol, J. A., Ruley, H. E. Protein arginine methyltransferase I: substrate specificity and role in hnRNP assembly. Journal of Cellular Biochemistry. 87 (4), 394-407 (2002).

Tags

ביולוגיה גיליון 174
שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szewczyk, M. M., Vu, V.,… More

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative Methods to Study Protein Arginine Methyltransferase 1-9 Activity in Cells. J. Vis. Exp. (174), e62418, doi:10.3791/62418 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter