Summary
Dessa protokoll ger den metod som används för att bedöma enzymatisk aktivitet hos enskilda medlemmar av proteinet argininmetyltransferas (PRMT) i celler. Detaljerade riktlinjer för bedömning av PRMT verksamhet med hjälp av endogena och exogena biomarkörer, metyl-arginin erkänna antikroppar och inhibitor verktyg föreningar beskrivs.
Abstract
Proteinmetyltransferaser (PRMTs) katalyserar överföringen av en metylgrupp till argininrester av substratproteiner. PRMT-familjen består av nio medlemmar som kan monomethylate eller symmetrically/asymmetrically dimetylate arginin rester. Flera antikroppar som känner igen olika typer av arginin metylering av olika proteiner finns tillgängliga; tillhandahålla verktyg för utveckling av BIOMARKÖR-analyser för PRMT-aktivitet. PRMT-antikroppsbaserade analyser är utmanande på grund av överlappande substrat och motivbaserade antikroppsspecifikationer. Dessa frågor och den experimentella inställningen för att undersöka arginin metylering bidragit av enskilda PRMTs diskuteras. Genom noggrant urval av de representativa substrat som är biomarkörer för åtta av nio PRMTs utformades en panel av PRMT-aktivitetsanalyser. Här rapporteras protokollen för cellulära analyser kvantitativt mäta enzymatiska verksamhet av enskilda medlemmar av PRMT familjen i celler. Fördelen med de beskrivna metoderna är deras enkla prestanda i alla labb med cellkultur och fluorescerande västerländska fläckar. Substrat specificitet och valda antikroppar tillförlitlighet var helt validerade med knockdown och överuttryck metoder. Förutom detaljerade riktlinjer för analysbiomarkörer och antikroppar tillhandahålls också information om användningen av en insamling av inhibitorverktygsföreningar för PRMTs.
Introduction
Arginin metylering är en viktig post-translationell modifiering som reglerar protein-protein och protein-RNA interaktioner, vilket spelar en viktig roll i olika cellulära processer såsom pre-mRNA splitsning, DNA-skador, transkription svar och tillväxtfaktormedierad transduktion1,2. Arginin är metylerat med protein argininmetyltransferaser (PRMTs) vilket resulterar i monometyl arginin (Rme1), asymmetriskt dimetyllarginin (Rme2a) eller symmetriskt dimetyllarginin (Rme2s)3. Baserat på metyleringstypen klassificeras PRMTs i tre grupper: typ I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 och 8), som katalyserar mono- och asymmetrisk dimetylering; Typ II (PRMT5 och PRMT9), som katalyserar mono- och symmetrisk dimetylering. och typ III (PRMT7), som endast kan monomeetylat arginin3.
På grund av ett växande antal kommersiellt tillgängliga arginin metyleringsspecifika antikroppar, PRMT verksamhet kan mätas med hjälp av västra blotting. Fluorescerande-baserade västra fläck är den föredragna tekniken framför chemiluminescent detektion på grund av ett större dynamiskt omfång och linjäritet, högre känslighet och möjliggör multiplexering4. För att kvantifiera proteinmetyleringsnivåerna krävs normalisering av metyleringssignalen till totala proteinnivåer. Genom att välja antikroppar för totalt och metylerat protein som odlas i olika värdarter (t.ex. mus och kanin) kan sekundära antikroppar märkta med olika fluorforer användas och signalen för båda antikropparna kan bestämmas i samma provband. Metyl-arginin antikroppar utvecklades för att identifiera och karakterisera monomethylerade, asymmetriskt eller symmetriskt dimetylerade proteiner där metyl-arginin finns i ett specifikt sammanhang. Eftersom majoriteten av PRMTs metylat glycin- och argininrika motiv inom sina substrat5, flera antikroppar höjdes för peptiderna som innehåller monometyl eller asymmetriska, symmetriska dimetyl-arginin-glycinrepetitioner såsom D5A12, ASYM24 eller ASYM25 respektive SYM11. Andra metyl-arginin antikroppar genererades mot ett peptid bibliotek som innehåller asymmetrisk, symmetrisk dimetyl- och monomethyl arginin i ett upprepat sammanhang som underlättar upptäckten av metyl-arginin i dessa särskilda sammanhang6. Det finns också ett ökande antal antikroppar som känner igen specifikt argininmärke på ett enda protein som möjliggör selektiv detektion av metylering såsom histon H4R3me2a eller BAF155-R1064me2a.
Det finns flera kommersiellt tillgängliga PRMT-hämmare, som kan användas som verktyg för PRMT-cellulära analyser. Men inte alla av dem kännetecknas grundligt för selektivitet och off-target effekter och vissa bör användas med försiktighet. Structural Genomic Consortium har i samarbete med akademiska laboratorier och läkemedelspartners utvecklat väl karakteriserade potenta, selektiva och cellgenomsläppliga PRMT-hämmare (kemiska sonder) som kan användas utan begränsningar av forskarsamhället. Information om dessa hämmare finns på https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics och https://www.chemicalprobes.org/. Kemiska sonder är småmolekylhämmare med in vitro IC 50 eller Kd < 100 nM, över 30-faldig selektivitet över proteiner i samma familj och betydande cellulär aktivitet vid 1 μM. Dessutom har varje kemisk sond en nära kemisk analog som är inaktiv mot det avsedda målet7,8,9,10,11,12.
Målet med detta protokoll är att mäta cellulär aktivitet hos enskilda PRMT-familjemedlemmar med hjälp av fluorescerande western blot-metoden. Här ges detaljerad information om validerade analysbiomarkörer, antikroppar och potenta cellaktiva hämmare samt värdefulla strategier för framgångsrik analysimplementering.
Protocol
1. Cellodling och plätering
OBS: Odlingsceller med rekommenderat medium och testa rutinmässigt för mykoplasmaförorening. HEK293T-, MCF7- och C2C12-celler valdes som exempel eftersom dessa cellinjer framgångsrikt användes i PRMT-analyser.
- Kultur HEK293T, MCF7 och C2C12 i DMEM kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), penicillin (100 U mL−1),och streptomycin (100 μg mL−1)i 10 cm vävnadskulturbehandlade (TC) rätter.
- För PRMT8-analysen, odla PRMT1-inducerbara knockdown HEK293T-celler i media som innehåller doxycyklin (2 μg/ml) i 3 dagar före analysstart.
- För att plätera cellerna, ta bort och kassera media från plattan.
- Tillsätt 10 ml PBS (utan Ca+2 och Mg+2 joner) för att tvätta celler och kassera lösningen.
- Tillsätt 1 ml Trypsin-EDTA (0,25%), inkubera i 1 min vid rumstemperatur (RT) och kassera sedan lösningen. Inkubera tills cellerna blir runda och lossna från plattan. Tryck på plattan för att vid behov ta bort celler. För svårbådande celler, såsom C2C12, inkubera plattan i 1-2 minuter vid 37 °C.
OBS: Undvik cellexponering för trypsinlösning under längre perioder (>10 min) eftersom det minskar cellens livskraft. - Tillsätt 1 ml förvärmt medium på plattan och försiktigt pipettceller upp och ner för att bryta upp cellklumpar. Överför celler till ett 15 ml-rör och tillsätt 3-5 ml media.
- För att mäta cellnummer, blanda 10 μL celler med 10 μL trypanblått och överför 10 μL till hemocytometer eller använd någon annan cellräkningsmetod.
- Späd ut cellerna till rekommenderad celltäthet och sätt 500 μL/brunn i 24-brunns TC-plattor(tabell 1). För endogena analyser (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 och PRMT9), flytta till steg 3.1.
2. Celltransfektion
- För exogena analyser (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfekta HEK293T-celler med rekommenderad mängd DNA (tabell 2). HEK293T-celler är lätta att transfektera så att alla transfection reagens kan användas, enligt tillverkarens instruktioner.
3. Sammansatt behandling
OBS: Överskrid inte 0,1% slutlig dimetylsulfoxidkoncentration (DMSO) i odlingsmedier. Håll samma DMSO-koncentration i varje brunn. De selektiva PRMT-hämmarna (kemiska sonder) och deras närbesläktade inaktiva analoger finns i tabell 3.
- För endogena analyser (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 och PRMT9), ta bort media från celler och ersätt med 500 μL media med förening eller DMSO ensam (kontroll).
OBS: Det tar vanligtvis 2 dagar att observera över 80% minskning av R metyleringsnivåer. - För exogena analyser (PRMT3, PRMT6, PRMT8), ta bort media 4 h efter transfection, tillsätt 500 μL media med förening eller DMSO ensam (kontroll) och inkubera i 20-24 h.
4. Celllyatberedning
- Ta bort alla medier från brunnar, tvätta med 100 μL PBS för att avlägsna restmedier och tillsätt 60 μL lysbuffert (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM etylendiaminetetraacetic syra (EDTA), 10 mM MgCl2,0,5% Triton X-100, 12,5 U mL−1 benzonase, komplett EDTA-fri proteashämmarcocktail) till varje brunn.
- Inkubera i mindre än 1 minut vid RT och gunga plattan för att fördela lysbufferten över cellerna. Tillsätt sedan 3 μL natriumdiddecylsulfat (SDS) till en slutlig koncentration på 1 % och blanda genom att försiktigt skaka. Överför lysat till mikrocentrifugrör och håll det på is.
OBS: Tillsätt benzonas och proteinhämmarcocktail fräsch före användning. Tillsats av benzonas hydrolyserar snabbt nukleinsyror vilket minskar celllystviskositeten.
- Inkubera i mindre än 1 minut vid RT och gunga plattan för att fördela lysbufferten över cellerna. Tillsätt sedan 3 μL natriumdiddecylsulfat (SDS) till en slutlig koncentration på 1 % och blanda genom att försiktigt skaka. Överför lysat till mikrocentrifugrör och håll det på is.
- Bestäm proteinkoncentrationen av proverna med BCA Protein Assay Kit eller använd någon annan metod som tolererar 1% SDS i lösning.
- Tillsätt 2 μL lysat- och proteinstandarder (0, 1, 2, 4 och 8 μg/ml BSA i lysbuffert) i brunnarna på den 96-brunnsfria plattan.
- Blanda reagens A med reagens B vid 50:1-förhållande och tillsätt 200 μL per brunn. Inkubera i 20 min vid 37 °C och läs av absorbansen.
- Justera proteinkoncentrationen med lysbufferten så att den är lika stor över proverna.
- Tillsätt 20 μL 4x lastbuffert till 60 μL celllyat och värm vid 95 °C i 5 minuter. Efter värmedenaturering kan lysatesna lagras vid -20 °C.
5. Västerländsk fläckanalys
- Ladda 5-20 μg totalt celllyat för analys av histonproteiner och 20-100 μg för andra proteiner till en 4-12% Bis-Tris proteingel.
- Kör gelén i MOPS SDS löpbuffert (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7,7) i ca 2 h vid 100 V eller tills färgfronten når botten av gelén.
- Om du utför en våt överföring, montera överföringssmörgåsen i iskall Tris-Glycine överföringsbuffert (25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% v/ v metanol och 0,05% w / v SDS).
- Placera svampar, filterpapper, PVDF-membran och gel enligt tillverkarens instruktioner. Aktivera PVDF-membranet genom att blötlägga i metanol och jämviktsgel i överföringsbuffert i 30 s före montering.
OBS: Använd rekommenderat PVDF western blotting membran eftersom det har låg autofluorescens och lämplighet för låg molekylvikt proteiner, såsom histoner (Table of Materials).
- Placera svampar, filterpapper, PVDF-membran och gel enligt tillverkarens instruktioner. Aktivera PVDF-membranet genom att blötlägga i metanol och jämviktsgel i överföringsbuffert i 30 s före montering.
- Överför proteiner från gelén till PVDF-membranet i Tris-Glycine överföringsbuffert vid 70 V i 1,5 h på is.
- Blockmembran i 30 min i blockeringsbuffert (5% w/v mjölk i fosfatbuffrad saltlösning, PBS). Skölj med tvättbuffert (PBST: 0,1 % v/v Tween-20 i PBS) och inkubera med primära antikroppar i BSA-lösning (5 % BSA i PBST) över natten vid 4 °C (tabell 3).
OBS: För längre förvaring, filtersterilisera BSA-lösningen, tillsätt 0,02% w/v natriumazid och håll vid 4 °C. - Tvätta membranet 3 x 5 min med PBST. Inkubera sedan med get-anti-kanin (IR800) och åsneantimus (IR680) antikroppar i rekommenderad blockeringsbuffert(Materialförteckning, tabell 3)i 30 min vid RT och tvätta 3 x 5 min med PBST.
- Läs signalen på en fluorescerande western blot imager vid 800 och 700 nm. Använd helst instrumentet som möjliggör avbildning av starka och svaga band tydligt i en enda bild med hög känslighet och dynamiskt omfång, högt signal-till-brusförhållande, en varning när en bildmättnad uppnås samt multiplexering av två fluorescerande färger i samma provband.
- Bestäm bandintensiteter för western blot-analys med lämplig programvara för fluorescerande västerländsk avbildning.
Representative Results
Exempel på västerländska fläckar för cellulära analyser av enskilda PRMTs presenteras nedan. Analysdetaljer sammanfattas också i tabell 4.
PRMT1-analys
PRMT1 är den främsta bidragsgivaren till histon 4 arginin 3 asymmetrisk dimetylering (H4R3me2a) icellerna 13. Vid förlust av PRMT1-aktivitet ökar de globala Rme1- och Rme2-nivåerna avsevärt13. Som visas i figur 1A och 1Bkan flera antikroppar användas för att övervaka globala förändringar i Rme1, Rme2a, Rme2s samt H4R3me2a. En betydande minskning av de globala nivåerna för Rme2a och H4R3me2a och ökningar av Rme1 och Rme2s kan observeras efter 3 dagars PRMT1-knockdown (figur 1A,B). Cellinjer skiljer sig åt i basal H4R3me2a-signal, för att underlätta övervakning av förlusten av PRMT1-aktivitet kan cellinjer som MCF7 med höga basala metyleringsnivåer användas (figur 1C). Den optimala tiden för att observera effekten av PRMT1-hämning, t.ex. vid behandling med typ I PRMT-hämmare MS0238, är 2 dagar (Figur 1D, 1E). Längre behandling resulterar i minskad cell livskraft och tillväxt.
PRMT3-analys
För prmt3 cellulära analys, inga selektiva biomarkör proteiner som metylering ändringar kunde detekteras i västra fläcken vid PRMT3 knockdown eller överuttryck. PRMT3 visade sig asymmetriskt dimetylera H4R3 in vitro14, men märket deponeras främst av PRMT1, och därför utformades en exogen analys med överuttryckt PRMT3. I överensstämmelse med in vitro-fynd ledde överuttryck av PRMT3 av vildtyp men inte dess katalytiska mutant (E338Q) till en ökning av H4R3me2a-nivåerna (Figur 2A). HEK293T-celler användes eftersom de har låg basal metylering av detta märke (Figur 1C). Analysen validerades vidare med PRMT3 selektiv hämmare SGC7077, vilket hämmade PRMT3-beroende H4R3 asymmetrisk metylering(figur 2B).
PRMT4-analys
PRMT4 dimetylerar asymmetriskt BAF155 vid arginin 106415. Eftersom antikroppen som detekterar BAF165-R1064me2a är kommersiellt tillgänglig kan PRMT4-aktiviteten i celler övervakas av western blot genom att upptäcka förändringarna i R1064me2a-märkesnivåerna. Förlusten av PRMT4-protein eller hämning av katalytisk aktivitet med den selektiva PRMT4-hämmaren TP-06410resulterar i en minskning av BAF165-R1064me2a-nivåerna(figur 3). En 2-dagars behandling är vanligtvis tillräcklig för att ta bort det mesta av metyleringssignalen.
PRMT5-analys
PRMT5 ansvarar för majoriteten av protein arginin symmetrisk dimetylering. Det har tidigare rapporterats att de olika SMN-komplexa proteinerna, inklusive SmBB' är PRMT5-substrat16. PRMT5-aktivitet kan övervakas genom att titta på förändringar i globala nivåer av symmetrisk arginin dimetylering eller symmetrisk dimetylering av SmBB" proteiner. Knockdown av PRMT5, men inte PRMT1, 3, 4, 6 och 7 resulterar i en minskning av globala Rme2s nivåer(figur 4A). I de flesta cellinjer undertryckte behandlingen av celler med PRMT5 selektiva hämmare LLY-28311 och GSK591 i 2-3 dagar de flesta smbb'rme2s-signalen (figur 4B). De flesta celler är känsliga för PRMT5-hämning, vilket resulterar i en minskning av cellproliferation och celldöd med långvarig hämmarexponering.
PRMT6-analys
det har rapporterats att PRMT6 är den främsta bidragsgivaren till histon H3 arginin 2 asymmetrisk dimetylering (H3R2me2a) i celler17. I HEK293T celler, PRMT6 knockdown i 3 dagar var inte tillräckligt för att observera en betydande minskning av H3R2me2a nivåer. Överuttryck av vild typ PRMT6 men inte dess katalytiska mutant (V86K/D88A) ökar dock nivåerna av H3R2me2a, liksom H3R8me2a och H4R3me2a (Figur 5A). Det finns flera hämmare som hämmar PRMT6-aktivitet med olika styrka och selektivitet: selektiv, allosterisk PRMT6-hämmare SGC687018,PRMT-typ I-hämmare MS0238och PRMT4/6-hämmare MS0499. Alla dessa hämmade PRMT6 beroende H3R2 (Figur 5B), liksom H4R3 och H3R8 asymmetrisk dimetylering (data visas inte).
PRMT7-analys
PRMT7 monometylater arginin 469 i både konstituerande och inducerbara former av HSP70 (HSPA8 respektive HSPA1/6)12. Även om det inte finns några kommersiellt tillgängliga antikroppar, som detekterar HSP70-R469me1 nivåer, kan märket detekteras med pan monometyl antikroppar. Förlusten av PRMT7-protein eller hämning av katalytisk aktivitet med den selektiva PRMT7-hämmaren SGC302712resulterar i minskade nivåer av HSP70-R469me1 (Figur 6A, B). SGC3027 är en cellpermeabel prodrog, som i celler omvandlas genom reduktaser till PRMT7 selektiv hämmare SGC8158, därför cellulär styrka kan skilja sig mellan cellinjer. Flera cancercellslinjer uttrycker inducerbara HSP70-isoformer på höga nivåer, och metylering kan vara svår att upptäcka på grund av ett överlappande ospecificerat band av nukleärt ursprung (Figur 6C). För prmt7 cellulär analys rekommenderas därför cellinjer som uttrycker mestadels HSPA8 såsom C2C12, eller eftersom HSP70 lokaliserar främst i cytoplasman, bestämma HSP70-R469me1 nivåer i den cytoplasma fraktionen av föredragna cellinjer.
PRMT8-analys
PRMT8 är den enda PRMT med ett vävnadsbegränsat uttrycksmönster - till stor del uttryckt i hjärnan19. Den delar 80% sekvens likhet och har en liknande substrat preferens som PRMT119. Det skiljer sig från PRMT1 främst vid N-ändstationen, där myristoylation resulterar i associering av PRMT8 medplasmamembranet 20. Det har rapporterats att PRMT8 tillsammans med PRMT1 metylater RNA-bindande protein EWS21. Eftersom PRMT8-aktiviteten är låg i icke-neuronala cellinjer och EWS också kan metyleras av PRMT1, utvecklades en analys där PMRT8 samuttrycks tillsammans med EWS i PRMT1 knockdown-celler. Eftersom PRMT1 är en viktig gen och dess långsiktiga förlust resulterar i celldöd, används ett inducerbart system där PRMT1 slås ner i 3 dagar innan användning i PRMT8-analysen användes (figur 7A). Samuttryck av PRMT8 av vildtyp, men inte katalytiskt inaktiv mutant (E185Q), tillsammans med EWS resulterade i ökade nivåer av EWS asymmetrisk dimetylering (Figur 7B). Flera asymmetriska dimetyllarginin antikroppar testades och metylering upptäcktes endast med Asym25 antikroppar. Analysen validerades vidare med en selektiv kemisk sond av PRMT typ I, MS0238, som minskade prmt8-beroende asymmetrisk dimetylering av exogena EWS (Figur 7B). Även om MS023 är mycket potent när det gäller att hämma PRMT8 i in vitro-analyser, krävs höga koncentrationer av MS023 i celler för att se metyleringshämning21.
PRMT9-analys
PRMT9 visade sig symmetriskt dimetylat SAP145 vid arginin 50822. Tyvärr kan inga kommersiellt tillgängliga antikroppar känna igen märket. För PRMT9-analysen användes antikroppar som var vänligt begåvade av Dr. Yanzhong Yang (Beckman Research Institute of City of Hope). När den är överuttryckt är vild typ men inte R508K mutant SAP145 metylerad av PRMT9 (Figur 8A). Analysen utformades för att övervaka nivåerna av endogena SAP145-R508me2s och validerades med Compound X, en prototyp PRMT9-hämmare (pågående arbete, ännu inte publicerat), vilket kraftigt hämmar PRMT9 in vitro med nanomolär styrka. Förening X minskade SAP145-R508me2s nivåer på ett dosberoende sätt (figur 8B).
Figur 1. PRMT1 cellulär analys. (A) PRMT1 knockdown resulterar i en minskning av global asymmetrisk arginin dimetylering (Rme2a) och ökade nivåer av symmetrisk arginin dimetylering (Rme2s) och monomethylation (Rme1). PRMT1 knockdown effektivitet presenteras i panel B. (B) PRMT1 knockdown minskar asymmetrisk dimetylering av histon H4R3 (H4R3me2a). c)Basal H4R3me2a-nivåerna skiljer sig åt mellan olika cellinjer. (D) Typ I PRMT-hämmare MS023 minskar H4R3me2a-nivåerna på ett dosberoende sätt. MCF7 celler behandlades med MS023 i 2 dagar. (E) Diagrammet representerar den ickelinitära passformen hos H4R3me2a-signalintensiteter normaliserade till total histon H4. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. PRMT3 cellulär analys. (A) Överuttryck av vilda typer (WT) men inte E338Q katalytisk mutant av PRMT3 ökar H4R3me2a nivåer i HEK293T celler. Celler transfected med FLAG-märkt PRMT3 för 24 h. (B) PRMT3 selektiv hämmare, SGC707, minskar ectopic PRMT3 beroende H4R3 asymmetrisk demetylering Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. PRMT4 cellulär analys. (A) PRMT4 knockdown resulterar i en minskning av BAF155-R1064 asymmetrisk arginin dimetylering (HEK293T celler). (B) PRMT4 selektiv hämmare, TP-064, minskar BAF155-R1064Rme2a nivåer. HEK293T celler behandlades med förening i 2 dagar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. PRMT5 cellulär analys. (A) PRMT5 knockdown resulterar i en minskning av globala symmetriska arginin dimetylering nivåer (MCF7 celler). (B) PRMT5 selektiva hämmare GSK591 och LLY-283, minska SmBB' symmetrisk arginin dimetylering (grön), medan totala nivåer av SmBB' förblir oförändrade (röda). MCF7 celler behandlades med föreningar i 2 dagar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5. PRMT6 cellulär analys. (A) Överuttryck av vild typ (WT) men inte V86K/D88A katalytisk mutant PRMT6 ökar H4R3me2a, H3R2me2a och H3R8me2a nivåer i HEK293T celler. Cellerna transfected med FLAG-märkt PRMT6 för 24 h. (B) PRMT6 selektiv hämmare (SGC6870), PRMT typ I inhibitor (MS023) och PRMT4/6 hämmare (MS049) minska PRMT6 beroende H3R2me2a nivåer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6. PRMT7 cellulär analys. (A) PRMT7 knockout resulterar i en minskning av HSP70-R469 monomethylation (HCT116 celler). (B) PRMT7 selektiva hämmare, SGC3027, minskar HSP70-R469 monomethylation i C2C12 celler. Cellerna behandlades med förening i 2 dagar. (C) Detektion av HSP70-R469 metylering av inducible HSP70 (HSPA1/6) med pan monomethyl arginin antikroppar (Rme1) kan vara svårt på grund av ett överlappande ospecificerat band av nukleärt ursprung. Det rekommenderas att mäta HSP70 metyleringsnivåer i cytoplasmic fraktionen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7. PRMT8 cellulär analys. (A) PRMT8 metylering av EWS kan detekteras när PRMT1 aktivitet hämmas av knockdown. HEK293T celler omvandlades med en inducerad PRMT1 knockdown vektor. Efter 3 dagar av doxycyklin behandling, PRMT1 nivåer minskade drastiskt. (B) När PRMT1 slås ner, är exogen EWS asymmetriskt dimetylerad av överuttryckt vild typ PRMT8 men inte katalytisk mutant (E185Q) av PRMT8. Metyleringen minskas med en hög koncentration av PRMT typ I-hämmare (MS023). HEK293T PRMT1KD-celler var samtransfekterade med FLAG-märkt PRMT8 vild typ eller katalytisk mutant och GFP-märkt EWS och behandlas med MS023 för 20 h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 8. PRMT9 cellulär analys. (A) Vild typ men inte R508K mutant SAP145 är metylerad av PRMT9. HEK293T celler transfected med GFP-märkta SAP145 för 1 dag. (B) Prototypen PRMT9-hämmare (Compound X) minskar PRMT9-beroende R508-symmetrisk dimetylering av SAP145 på ett dosberoende sätt. HEK293T celler behandlades med föreningen i 2 dagar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| PRMT (prmt) | Celler | Densitet per ml |
| PRMT1 | MCF7 (olika) | 1 x 105 |
| PRMT3 | HEK293T (på 293 T) | 2 x 105 |
| PRMT4 (prmt4) | HEK293T (på 293 T) | 1 x 105 |
| PRMT5 (prmt5) | MCF7 (olika) | 1 x 105 |
| PRMT6 (prmt6) | HEK293T (på 293 T) | 2 x 105 |
| PRMT7 (prmt7) | C2C12 (på 2C12) | 1 x 105 |
| PRMT8 (prmt8) | HEK293T (PRMT1 KD)* | 2 x 105 |
| PRMT9 (prmt9) | HEK293T (på 293 T) | 2 x 105 |
| *behandla celler med doxycyklin (2 μg/ml) 3 dagar före plätering för PRMT8-analys | ||
Tabell 1. Celltyper och densiteter som rekommenderas för PRMT-analyser.
| PRMT (prmt) | μg DNA/24-brunn | Addgene (1997 # | Ytterligare anteckningar |
| PRMT3 | 0.5 FLAGGA-PRMT3 | 164695 | |
| eller 0,5 FLAG-PRMT3 (E338Q) | 164696 | ||
| PRMT6 (prmt6) | 0.5 FLAGGA-PRMT6 | 164697 | |
| eller 0,5 FLAG-PRMT6(V86K/D88A) | 164698 | ||
| PRMT8 (prmt8) | 0.05 EWS-GFP | 164701 | |
| 0.45 PRMT8-FLAGGA | 164699 | ||
| eller 0.45 PRMT8(E185Q)-FLAGGA | 164700 | ||
| PRMT9 (prmt9) | 0.05 SAP145-GFP | Na | gåva från Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope |
| eller 0,05 SAP145-R508K-GFP | |||
| 0.45 tom vektor |
Tabell 2. Den DNA-koncentration som rekommenderas för transfection experiment.
| PRMT (prmt) | antikropp | Kemisk sond (Cellaktivitet IC50) | Negativ kontroll |
| PRMT1 | H4R3me2a (1:2000) | MS023 -PRMT typ I | MS094 |
| Rme1 (1:1000) | (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM) | ||
| Rme2s (1:2000) | |||
| Rme2a (1:2000) | |||
| Rme2a (ASYM24, 1:3000) | |||
| Rme2a (ASYM25, 1:2000) | |||
| H4 (1:2000) | |||
| B-aktin (1:500 ) | |||
| PRMT3 | H4 (1:2000) | SGC707 (IC50 = 91 nM) | XY-1 (på 1) |
| H4R3me2a (1:2000) | |||
| FLAGGA (1:5000) | |||
| PRMT4 (prmt4) | BAF155 (1:200) | TP-064 (IC50 = 43 nM) | TP064N (på andra) |
| BAF155-R1064me2a (1:3000) | SKI-73 (IC50 = 540 nM)* | SKI-73N* | |
| PRMT5 (prmt5) | anti-SmBB" (1:100) | LLY-283 (IC50 = 30 nM) | LLY-284 (på 284) |
| Rme2s (#13222, 1:2000) | GSK591 (IC50 = 56 nM) | SGC2096 | |
| PRMT6 (prmt6) | H4R3me2a (1:2000) | SGC6870 (IC50 = 0,9 μM) | SGC6870N (på 19770)-09-0 |
| H4 (1:2000) | MS023 -PRMT typ I | MS094 | |
| H3R2me2a ( 1:2000) | (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM) | ||
| H3R8me2a (1:2000) | MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM) | MS049N (på 049N) | |
| H3 ( 1:5000) | |||
| FLAGGA ( 1:5000) | |||
| PRMT7 (prmt7) | Rme1 (1:1000) | SGC3027 (IC50 = 1300 nM) * | SGC3027N* |
| Hsp/Hsc70 (1:2000)* | |||
| PRMT8 (prmt8) | GFP (1:3000) | MS023 (50 μM) | MS094 |
| Rme2a (ASYM25,1:2000) | |||
| FLAGGA (1:5000) | |||
| PRMT9 (prmt9) | SAP145 (1:1000) | ||
| SAP145-R508me2s -snäll gåva från Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope (1:1000) (PIMID: 25737013) | |||
| Sekundära antikroppar | get-anti-kanin IgG-IR800 (1:5000) | ||
| åsna antimus IgG-IR680 (1:5000) | |||
| *- antikroppen känner igen HSPA8, HSPA1 och HSPA6 (testad med överuttryckta GFP-märkta proteiner), *prodrog – IC50 kan skilja sig mellan olika cellinjer | |||
Tabell 3. Rekommenderade antikroppar och PRMT kemiska sond/negativa kontrollverktyg föreningar.
| PRMT (prmt) | Biomarkör | Avläsning av analys | Validering av analys | Rekommenderad cellinje | Ref. | ||||||||
| PRMT1 | H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a | H4R3me2a nivåer normaliserade till totala H4 globala Rme1, Rme2a eller Rme2s nivåer normaliserade till B-aktin. | Knockdown av PRMT1 minskade basala H4R3me2a och globala Rme2a nivåer och ökade globala Rme1 och Rme2s nivåer i celler (Fig.1A, B). PRMT Typ I kemisk sond MS023 minskade nivåerna av H4R3me2a på ett dosberoende sätt (Fig. 1D). | Cellerna skiljer sig åt i basala H4R3me2a-nivåer (Bild 1C). MCF7-celler har höga basala H4R3me2a-nivåer vilket gör det bättre för analyser som övervakar minskningen av PRMT1-aktivitet. | 8 | ||||||||
| PRMT3 | H4R3me2a (på 4R3me2a) | H4R3me2a metyleringsnivåer orsakade av exogen FLAGG-märkt PRMT3 WT eller katalytisk E338Q mutant (bakgrund) normaliserad till total histon H4 | Överuttryck av vild typ PRMT3 men inte dess katalytiska mutant (E338Q) ökade H4R3me2a (Fig. 2A). PRMT3 selektiv hämmare SGC707 minskad PRMT3 beroende ökning av H4R3me2a nivåer (Fig. 2B) | HEK293T-celler har låga basala H4R3me2a-nivåer (Fig 1C), vilket är att föredra för övervakning av exogen PRMT3-aktivitet | 7 | ||||||||
| PRMT4 (prmt4) | BAF155-R1064me2a | BAF155-R1064me2a nivåer normaliserade till totalt BAF155 | PRMT4 knockdown minskade asymmetrisk dimetylering av BAF155 (Bild 3A). 2 dagars behandling med PRMT4 selektiv kemisk sond (TP-064) minskade asymmetrisk dimetylering av BAF155 (Fig. 3B). | Valfri cellinje | 10 | ||||||||
| PRMT5 (prmt5) | SmBB'-Rme2s | SmBB'-Rme2s nivåer detekteras med pan Rme2s antikroppar (CST) normaliserade till totalt SmBB" | Knockdown av PRMT5 resulterade i minskade SmBB symmetriska dimetyleringsnivåer (Fig. 4A). 2 dagars behandling med PRMT5 selektiva kemiska sonder, GSK591 och LLY285, minskade SmBB'-Rme2s nivåer (Fig. 4B). | Valfri cellinje | 11 | ||||||||
| PRMT6 (prmt6) | H4R3me2a (på 4R3me2a) H3R2me2a (på andra) H3R8me2a (på 3R8me2a) |
H4R3me2a, H3R2me2a eller H3R8me2a metyleringsnivåer ökas med exogena FLAG-märkta PRMT6 WT men inte katalytiska V86K,D88A mutant (bakgrund) normaliserade till total histone H4 respektive H3 | Överuttryck av vild typ PRMT6 men inte dess katalytiska mutant (V86K,D88A) ökade H3R2me2a, H3R8me2a och H4R3me2a nivåer (Fig. 5A). Allosteric PRMT6-hämmare (SGC6870), PRMT typ I-hämmare MS023 , PRMT4/6-hämmare MS049 minskade PRMT6 beroende ökning av H3R2me2a-nivåerna (Fig. 5B). | HEK293T-celler har låga basala H4R3me2a-, H3R2me2a- och H3R8me2a-nivåer, vilket är att föredra för övervakning av exogen PRMT6-aktivitet | 8,9 | ||||||||
| PRMT7 (prmt7) | HSP70-R469me1 | HSP70-Rme1 metyleringsnivåer normaliserade till totalt HSP70 | PRMT7 knockout eller knockdown minskade HSP70 monomethylation (Bild 6A). 2 dagars behandling med PRMT7 selektiv kemisk sond SGC3027 minskade PRMT7 beroende HSP70 monomethylation på ett dosberoende sätt (Fig. 6B). | C2C12, HT180 Flera cancercellslinjer uttrycker en inducerbar form av HSP70 vars metyleringssignal överlappar ett ospecificerat protein av nukleärt ursprung (Fig. 6C). I det här fallet rekommenderar vi att du analyserar HSP70 metyleringsnivåer i den cytoplasmatiska fraktionen. |
12 | ||||||||
| PRMT8 (prmt8) | EWS-Rme2a (olika) | Exogena GFP-märkta EWS metylering nivåer orsakas av exogena FLAG-märkta PRMT8 WT eller E185Q katalytisk mutant (bakgrund), normaliserad till totala GFP signal i PRMT1 KO celler. | Överuttryck av den vilda typen PRMT8 men inte katalytisk E185Q mutant metylerad ektopisk EWS endast i PRMT1 KD-celler (Bild 7A). PRMT typ I kemisk sond MS023 hämmade asymmetrisk dimetylering av exogena EWS av PRMT8 (Fig. 8B). | HEK293T PRMT1 KD (inducible). PRMT1 knockdown resulterar i celldöd därför rekommenderar vi att du använder ett inducerbart system. |
8 | ||||||||
| PRMT9 (prmt9) | SAP145-R508me2s | PRMT9-beroende SAP145-symmetrisk dimetylering vid R508 normaliserad till SAP145 | Förlusten PRMT9 men inte PRMT5 leder till minskad symmetrisk dimetylering av SAP145. GFP-märkt SAP145 WT men inte SAP145mut (R508K) metylerades av PRMT9 (Bild 8A). 2-dagars behandling med Copound X, prototypen PRMT9-hämmare, minskade SAP145-R508me2s nivåer på ett dosberoende sätt Fig 8B). | Valfri cellinje | 21 | ||||||||
Tabell 4. PRMT-analyssammanfattning.
Discussion
Här beskrivs de detaljerade cellulära analysprotokollen för medlemmar av PRMT-familjen som använder fluorescerande västerländska blottningsmetoder. Unika substrat för vilka förändringarna i arginin metylering lätt kan detekteras vid individuell PRMT förlust eller katalytisk hämning och kan inte kompenseras av andra familjemedlemmar valdes. Vissa proteiner är metylerade av flera PRMTs21,23, vilket tyder på en överlappning i substrat specificitet där vissa PRMTs bidrar endast en liten mängd cellulära märke i ett givet protein substrat24,25,26,27, till exempel bidrar både PRMT8 och PRMT1 till metylering av EWS. Därför krävde varje analys noggrann validering av substrat och antikroppar med knockdown och/eller överuttrycksexperiment och ytterligare validering med väl karakteriserade selektiva hämmare. PRMT-specifika substrat identifierades för vilka metyleringsmärke förändringar kunde detekteras inom 2-3 dagar efter PRMT förlust/hämning för att undvika sammansatta effekter av minskad cell livskraft och spridning som indirekt kan påverka metyl-arginin mark nivåer. Även om det var möjligt att hitta unika substrat för PRMT1, 4, 5, 7 och 9; För PRMT3, 6 och 8 måste man använda sig av funktionssätt. Flera arginin metyl-specifika antikroppar testades för olika cellulära mål, men ingen kunde upptäcka betydande förändringar inom 3 dagar efter PRMT3 och PRMT6 knockdown; Därför utvecklades biomarköranalyser med hjälp av extopiskt uttryckta enzymer tillsammans med katalytiskt inaktiva mutanter, som fungerade som en kontroll för baslinjen substrat metylering. PRMT8 är en nära PRMT1 homolog och delar liknande substrat preferenser. Eftersom en PRMT8 selektiv biomarkör inte kunde identifieras, utvecklades en analys i PRMT1 knockdown celler, där PRMT8 uttrycktes tillsammans med EWS. PRMT1 är också ett stort enzym som ansvarar för H4R3 asymmetrisk metylering, därför, att använda H4R3me2a som biomarkör för PRMT3 och PRMT6 cellulära analyser, celler med låg basala H4R3me2a nivåer valdes samt katalytiskt inaktiva mutanter användes som bakgrundskontroll. Även om endogena analyser föredras, visar exogena analyser ovärderliga för att testa cellulär styrka hos flera selektiva PRMT-hämmare7,8,9. Med växande kunskap om PRMT-biologi förväntar vi oss att förbättra analyserna genom att hitta mer specifika biomarkörproteiner för PRMT3, PRMT6 och PRMT8.
Användningen av validerade antikroppar och lämpliga kontroller är avgörande för PRMT-analysprestandan. Alla antikroppar som rekommenderas här har validerats grundligt genom knockdown och överuttryck experiment, men batch-till-batch skillnader, särskilt när det gäller polyklonala antikroppar, kan fortfarande påverka deras prestanda. Därför är det viktigt att använda genetiska metoder och kemiska sonder tillsammans med deras nära besläktade negativa kontroller för att bekräfta analysens tillförlitlighet. För PRMT-analyser som kräver proteinöveruttryck är det dessutom viktigt att använda katalytiskt inaktiva mutanter tillsammans med vildprotein för att bestämma de basala metyleringsnivåerna.
Denna samling av kvantitativa analyser för profilering av PRMTs verksamhet i celler kan vara i stort sett användbar för forskarsamhället eftersom den snabbt och enkelt kan genomföras med minimal utrustning och begränsad teknisk expertis, som endast omfattar grundläggande cellodling och fluorescerande västerländska blotting-tekniker. De rekommenderade antikropparna och kemiska sonderna för PRMTs kan också användas för aktivitetsbaserade proteinprofileringsanalyser (ABPP) för att fastställa lämpligheten hos en viss ABPP-sond, övervaka målengagemang och bedöma effekter utanför målet med hjälp av det konkurrenskraftiga ABPP-formatet. De analysutvecklingsmetoder som diskuteras här kan också extrapoleras för andra enzymfamiljer som proteinlyin-metyltransferaser och acetyltransferaser.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra motstridiga intressen att deklarera.
Acknowledgments
Structural Genomics Consortium är en registrerad välgörenhetsorganisation (nr: 1097737) som får medel från AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada genom Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU och EFPIA genom det gemensamma företaget Innovative Medicines Initiative 2 [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (även känd som EMD i Kanada och USA), Pfizer, Takeda och Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
| 24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
| Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
| anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
| anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
| anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
| anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
| anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
| anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
| anti-GFP | Clontech | 632381 | |
| anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
| anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
| anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
| anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
| anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
| anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
| anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
| anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
| anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
| anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
| anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
| anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
| anti-Rme1 | CST | 8015 | |
| anti-Rme2a | CST | 13522 | |
| anti-Rme2s | CST | 13222 | |
| anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
| anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
| anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
| anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
| benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
| BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
| C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
| donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
| doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
| EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| FBS | Wisent | 80150 | |
| glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
| goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
| HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
| Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
| Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
| MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
| Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
| PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
| PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
| penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
| SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
| skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
| Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
| Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
| Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
| trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |
References
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine Methylation: The Coming of Age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bedford, M. T., Richard, S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function. Molecular Cell. 18 (3), 263-272 (2005).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. The Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S.
- Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Science Reports. 3, 1311 (2013).
- Kaniskan, H. U., et al. A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3). Angewandte Chemie International Edition. 54 (17), 5166-5170 (2015).
- Eram, M. S., et al. A Potent, Selective, and Cell-Active Inhibitor of Human Type I Protein Arginine Methyltransferases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 772-781 (2016).
- Shen, Y., et al. Discovery of a Potent, Selective, and Cell-Active Dual Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 4 and Protein Arginine Methyltransferase 6. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (19), 9124-9139 (2016).
- Nakayama, K., et al. TP-064, a potent and selective small molecule inhibitor of PRMT4 for multiple myeloma. Oncotarget. 9 (26), 18480-18493 (2018).
- Bonday, Z. Q., et al. LLY-283, a Potent and Selective Inhibitor of Arginine Methyltransferase 5, PRMT5, with Antitumor Activity. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (7), 612-617 (2018).
- Szewczyk, M. M., et al. Pharmacological inhibition of PRMT7 links arginine monomethylation to the cellular stress response. Nature Communications. 11 (1), 2396 (2020).
- Goulet, I., Gauvin, G., Boisvenue, S., Cote, J. Alternative splicing yields protein arginine methyltransferase 1 isoforms with distinct activity, substrate specificity, and subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 33009-33021 (2007).
- Siarheyeva, A., et al. An allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3. Structure. 20 (8), 1425-1435 (2012).
- Stefansson, O. A., Esteller, M. CARM1 and BAF155: an example of how chromatin remodeling factors can be relocalized and contribute to cancer. Breast Cancer Research. 16 (3), 307 (2014).
- Pesiridis, G. S., Diamond, E., Van Duyne, G. D. Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21347-21359 (2009).
- Guccione, E., et al. Methylation of histone H3R2 by PRMT6 and H3K4 by an mLL complex are mutually exclusive. Nature. 449 (7164), 933-937 (2007).
- Yudao Shen,, L, F., et al. A First-in-class, Highly Selective and Cell-active Allosteric Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6). BioRxiv. , 1-21 (2020).
- Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Identification of proteins interacting with protein arginine methyltransferase 8: the Ewing sarcoma (EWS) protein binds independent of its methylation state. Proteins. 72 (4), 1125-1137 (2008).
- Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S., Bedford, M. T. PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family. Journal of Biological Chemistry. 280 (38), 32890-32896 (2005).
- Kim, J. D., Kako, K., Kakiuchi, M., Park, G. G., Fukamizu, A. EWS is a substrate of type I protein arginine methyltransferase, PRMT8. International Journal of Molecular Medicine. 22 (3), 309-315 (2008).
- Yang, Y., et al. PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145. Nature Communications. 6, 6428 (2015).
- Rakow, S., Pullamsetti, S. S., Bauer, U. M., Bouchard, C. Assaying epigenome functions of PRMTs and their substrates. Methods. 1175, 53-65 (2020).
- Musiani, D., et al. Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity. Science Signaling. 12 (575), (2019).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and Computational Approaches for the Large-Scale Analysis of Protein Arginine Methylation by Mass Spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Shishkova, E., et al. Global mapping of CARM1 substrates defines enzyme specificity and substrate recognition. Nature Communications. 8, 15571 (2017).
- Pawlak, M. R., Banik-Maiti, S., Pietenpol, J. A., Ruley, H. E. Protein arginine methyltransferase I: substrate specificity and role in hnRNP assembly. Journal of Cellular Biochemistry. 87 (4), 394-407 (2002).
