Summary
Qui descriviamo un sistema di induzione organoide retinica ottimizzato, adatto a varie linee di cellule staminali pluripotenti umane per generare tessuti retinici con elevata riproducibilità ed efficienza.
Abstract
Le malattie degenerative della retina sono le principali cause di cecità irreversibile senza un trattamento efficace. Le cellule staminali pluripotenti che hanno il potenziale per differenziarsi in tutti i tipi di cellule retiniche, anche nei tessuti mini-retinici, hanno enormi promesse per i pazienti con queste malattie e molte opportunità nella modellazione delle malattie e nello screening farmacologico. Tuttavia, il processo di induzione dalle hPSC alle cellule retiniche è complicato e richiede molto tempo. Qui, descriviamo un protocollo di induzione retinica ottimizzato per generare tessuti retinici ad alta riproducibilità ed efficienza, adatti a varie cellule staminali pluripotenti umane. Questo protocollo viene eseguito senza l'aggiunta di acido retinoico, che avvantaggia l'arricchimento dei fotorecettori del cono. Il vantaggio di questo protocollo è la quantificazione della dimensione EB e della densità di placcatura per migliorare significativamente l'efficienza e la ripetibilità dell'induzione retinica. Con questo metodo, tutte le principali cellule retiniche appaiono sequenzialmente e ricapitolano le fasi principali dello sviluppo retinico. Faciliterà le applicazioni a valle, come la modellazione delle malattie e la terapia cellulare.
Introduction
Le malattie degenerative della retina (NDI), come la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e la retinite pigmentosa (RP), sono caratterizzate dalla disfunzione e dalla morte delle cellule fotorecettrici e in genere portano a una perdita irreversibile della vista senza modi efficaci per curare1. Il meccanismo alla base di queste malattie è in gran parte sconosciuto in parte a causa della mancanza di modelli di malattie umane2. Negli ultimi decenni, sono stati compiuti progressi significativi nella medicina rigenerativa attraverso la tecnologia delle cellule staminali. Molti ricercatori, noi compresi, hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), possono differenziarsi in tutti i tipi di cellule retiniche, anche mini-tessuti retinici attraverso vari approcci di differenziazione3,4,5,6,7,8,9,10, 11, fornendo un enorme potenziale nella modellazione delle malattie e nella terapia cellulare12,13,14.
Tuttavia, il processo di induzione dalle hPSC alle cellule retiniche è altamente complicato e richiede tempo con bassa ripetibilità, che richiede ricercatori con una ricca esperienza e competenze elevate. Durante il complesso e dinamico processo di induzione, una serie di fattori influenzerà la resa dei tessuti retinici15,16,17. Inoltre, diversi metodi di induzione spesso variano considerevolmente nei tempi e nell'espressione robusta dei marcatori retinici, il che potrebbe confondere la raccolta del campione e l'interpretazione dei dati3. Pertanto, sarebbe richiesto un protocollo semplice di differenziazione retinica dalle hPSC con una guida passo-passo.
Qui, sulla base dei nostri studi pubblicati18,19,20,21,viene descritto un protocollo di induzione retinica ottimizzato per generare organoidi retinici (RO) con ricchi fotorecettori a cono da hPSC, che non richiede l'integrazione di acido retinoico (RA). Questo protocollo si concentra sulla descrizione del metodo multi-step per generare retina neurale e RPE. La formazione di EB è la parte essenziale della fase iniziale di induzione. Sia le dimensioni che la densità di placcatura degli EB sono ottimizzate quantitativamente, il che migliora scientificamente la resa dei tessuti retinici e promuove la ripetibilità. Nella seconda parte dell'induzione, le vescicole ottiche (OV) si auto-organizzano nella cultura dell'aderenza e le RO si formano nella cultura della sospensione; i corsi di tempo e le efficienze di questa parte variano considerevolmente nelle diverse linee hPSC. La maturazione e la specificazione delle cellule retiniche nei RIO si verificano principalmente nella fase intermedia e tardiva dell'induzione. Senza l'aggiunta di RA, è possibile produrre fotorecettori maturi con coni e aste ricchi.
Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere quantitativamente e dettagliare ogni passaggio per i ricercatori inesperti da ripetere. Varie linee hPSC sono state indotte con successo in RO da questo protocollo con una robusta resa di tessuti retinici ricchi di coni e un'elevata ripetibilità. Le RO derivate da HPSC con questo protocollo possono ricapitolare le fasi principali dello sviluppo retinico in vivoe sopravvivere a lungo termine, il che facilita le applicazioni a valle, come la modellazione delle malattie, lo screening farmacologico e la terapia cellulare.
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Protocol
1. Cultura ed espansione delle hPSC
- Cultura HPSC
- Rivestire due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con matrice extracellulare (ECM, matrice qualificata hESC). Preparare 50 mL di una soluzione ECM contenente 8-12 μg/mL di ECM nel Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco. In 49 mL di DMEM, aggiungere 1 mL della soluzione stock ECM scongelata (50x). Aggiungere 1 mL di soluzione ECM a ciascun pozzettino di una piastra a 6 pozzetti. Incubarlo per 1 ora in un incubatore a 37 °C e 5% CO2.
- Preparare il mezzo di manutenzione hPSC (MM) secondo le istruzioni del produttore.
- MM preriscaldo a temperatura ambiente (RT) per 30 min.
- Scongelare una fiala criogenica di hPSC (hiPSC o hESC) (circa 1 x 106) da un serbatoio di azoto liquido mediante incubazione a bagnomaria a 37 °C per 30 s.
- Esponi la fiala e disinfettala con cura usando uno spray alcool disinfettante al 75%. Mettilo in un armadietto di biosicurezza.
- Trasferire la sospensione cellulare dal flaconcino a un tubo da 15 mL, aggiungere 5 mL di MM preriscaldato goccia a goccia al tubo utilizzando una pipetta da 5 mL. Nel frattempo, agitare delicatamente il tubo per frullare le hPSC .
- Centrifugare il tubo a 170 x g per 5 min. Rimuovere la maggior parte del surnatante usando con cura una pipetta da 1 mL e lasciare circa 50 μL di surnatante per evitare di perdere le cellule.
- Aggiungere 1 mL di MM al tubo e risuscievole il pellet tubando delicatamente su e giù una o due volte con una pipetta da 1 mL.
NOTA: La sopravvivenza di singole cellule di hPSC è bassa. Piccoli grumi cellulari con 3-5 cellule sono preferiti per mantenere le hPSC che crescono in colonie. - Rimuovere l'ECM dai pozzi preverniciati (fase 1.1.1), aggiungere 1,5 ml di MM a ciascun pozzo e quindi distribuire 0,5 ml di sospensione cellulare per pozzo.
- Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le hPSC e mettere la piastra in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO2. Non spostare la piastra per almeno 24 ore per promuovere l'aderenza cellulare.
- Cambia MM a giorni alterni e passa le hPSC quando la confluenza ha raggiunto circa l'80%.
- Passaggio di hPSC
NOTA: il mantenimento dello stato indifferenziato nelle hPSC è piuttosto critico per ulteriori applicazioni. Nelle condizioni aderenti, le hPSC crescono in colonie con un bordo ben definito. Le cellule dovrebbero essere attraversate quando la confluenza di hPSC raggiunge circa l'80%.- Osservare le cellule al microscopio. Contrassegnare e rimuovere meccanicamente le cellule differenziate chiaramente visibili (<5%) prima di passare.
- Preparare la piastra rivestita in ECM come descritto al punto 1.1.1.
- MM preriscaldante e 1x tampone fosfato soluzione salina (PBS) senza Ca2+ e Mg2+ a RT.
- Preriscaldere la soluzione di EDTA da 0,5 mM (in 1x PBS) a bagnomaria a 37 °C.
- Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura utilizzando un sistema di aspirazione sottovuoto, aggiungere 1 mL di 1x PBS in ciascun pozzetti per lavare le celle usando una pipetta da 1 mL e ripetere due volte.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di EDTA per pozzetta per dissociare le hPSC in un incubatore di colture cellulari a 37 °C e 5% di CO2 per 5 minuti. Non superare il tempo di incubazione raccomandato per evitare la dissociazione a singole cellule.
- Estrai la piastra e controlla il distacco delle cellule al microscopio. Le hPSC confluenti si allentano e ogni bordo cellulare può essere visto, ma le cellule non possono facilmente staccarsi scuotendo delicatamente la piastra cellulare.
- Rimuovere la soluzione di EDTA con una pipetta da 1 mL e aggiungere 1 mL di MM per arrestare la dissociazione. Pipettare delicatamente le hPSC una o due volte con una pipetta da 1 mL per ricaspendare le cellule. Non c'è bisogno di centrifugare per raccogliere le cellule.
NOTA: Se la maggior parte delle cellule si stacca dalla piastra dopo l'incubazione con EDTA, le cellule possono essere raccolte mediante centrifuga. - Rimuovere l'ECM dai pozzi preverniciati (punto 1.2.2) e aggiungere 1,5 ml di MM per pozzo.
- Trasferire 150-200 μL di grumi cellulari in ciascun pozzerà. Generalmente, le hPSC possono essere passaggio con un rapporto di 1:6. Ad esempio, le cellule di un pozzo di una piastra a 6 pozzetti possono essere distribuite a sei nuovi pozzi.
- Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le hPSC e colturare le hPSC nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 per almeno 24 ore senza toccare la piastra.
- Cambiare MM a giorni alterni come descritto nel passaggio 1.1.
2. Differenziazione retinica dalle hPSC
NOTA: Quando le colonie raggiungono ~80% di confluenza (Figura 1B), possono essere guidate a differenziarsi in organoidi retinici seguendo il protocollo schematizzato in Figura 1A. Per garantire che le hPSC abbiano un'alta qualità e una buona resa, valutare regolarmente la pluripotenza con marcatori molecolari come OCT4 o NANOG utilizzando IFC o QPCR. Le HPSC devono essere scartate se le cellule differenziate rappresentano più del 5% delle cellule totali. Verificare la contaminazione da micoplasma con un kit di rilevamento del micoplasma secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare solo hPSC prive di micoplasma poiché il micoplasma può alterare la capacità di differenziazione delle hPSC.
- Preparare mezzi e reagenti
- Preparare il mezzo di induzione neurale (NIM) mescolando quanto segue: 500 mL di Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 di Dulbecco (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL di supplemento N2 all'1%, 0,5 mL di eparina allo 0,1% (2 mg/mL in 1x PBS) e 5 mL di aminoacidi non essenziali MEM all'1% (NEAA).
- Preparare il mezzo di differenziazione retinica (RDM) contenente 300 mL di DMEM/F-12, 200 mL di DMEM basic, 10 mL di supplemento B27 al 2%, 5 mL di Antibiotic Antimycotic all'1% e 5 mL di MEM NEAA all'1%.
NOTA: sia NIM che RDM non vengono filtrati, ma viene eseguito un test di sterilità. Togliere 1 mL di mezzo e aggiungerlo in un piatto da 35 mm e colturare per 3-7 giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Il supporto può essere conservato a 4 °C e deve essere utilizzato entro 2 settimane per garantire l'attività dei componenti. - Preparare 10 mM Blebbistatin (1.000x) in DMSO. Aggiungere 1.710 μL di DMSO per sciogliere 5 mg di Blebbistatin per ottenere 10 mM di soluzione madre (1.000x), aliquota a 10 μL/tubo e conservare a -20 °C.
NOTA: Tutti i supporti e i reagenti devono essere riscaldati a RT per 30 minuti prima dell'uso, se non diversamente specificato.
- Formazione del corpo embrioide (EB)
- Il giorno 0 (D0), iniziare la differenziazione. Estrai un pozzetti di hPSC da una piastra a 6 pozzetti, che è cresciuta fino a circa l'80% di confluenza. Raccogliere le cellule con la soluzione di dissociazione EDTA come descritto nei passaggi da 1.2.1 a 1.2.6.
- Rimuovere la soluzione di EDTA, aggiungere 1 mL di MM contenente 10 μM di Blebbistatin per fermare la dissociazione cellulare e raccogliere le cellule con una pipetta da 1 mL. La dimensione dei grumi cellulari è uno dei fattori chiave che influenzano la resa degli EB. Approssimativamente, cinque celle per grumo sono preferite per produrre la giusta dimensione di EB su D5 a D7.
NOTA: questo è un passaggio chiave. Non pipettare le cellule troppe volte poiché gli aggregati simili a EB sono difficili da formare da singole celle di hPSC. - Trasferire la sospensione cellulare (circa 2 x 106 celle) in una capsula di Petri ad attacco ultra-basso da 100 mm e aggiungere 9 ml di MM contenenti 10 μM di Blebbistatina al piatto.
- Agitare delicatamente il piatto due volte per distribuire uniformemente le cellule e mettere il piatto nell'incubatrice a 37 °C e 5% CO2.
- Su D1, dopo che le cellule sono state coltivate per almeno 24 ore, esportare fuori il piatto e osservarlo al microscopio. Un gran numero di aggregati di piccole cellule si formerà spontaneamente da questo momento (Figura 1C).
- Preparare 12 mL di miscela con MM e NIM con un rapporto 3:1 (9 mL di MM e 3 mL di NIM) in un tubo da 15 mL.
- Trasferire le colture cellulari in un tubo centrifugo da 15 mL con una pipetta da 10 mL perpendicolarmente e aggiungere 10 mL della miscela preriscaldata al piatto.
- Centrifugare il tubo a 60 x g per 3 minuti per raccogliere gli aggregati, rimuovere il surnatante usando una pipetta da 5 ml e lasciare circa 500 μL per evitare di perdere cellule.
- Aggiungere 2 mL della miscela al tubo e trasferire la sospensione nello stesso piatto (punto 2.2.7).
- Agitare delicatamente il piatto per distribuire uniformemente gli aggregati cellulari e rimettere il piatto nell'incubatrice.
- Su D2, preparare 12 mL di una nuova miscela con MM e NIM con un rapporto 1:1 (6 mL di MM e 6 mL di NIM) in un tubo da 15 mL. Cambiare il mezzo cellulare con la miscela appena preparata ripetendo i passaggi da 2.2.5 a 2.2.10.
- Su D3, cambiare il mezzo cellulare con 15 ml di NIM come descritto sopra. Coltura le cellule per almeno 5 giorni nelle condizioni di sospensione.
NOTA: Durante D1 a D3, il mezzo deve essere cambiato ogni giorno, fornendo un'alimentazione sufficiente. Dal momento che D3, NIM può essere cambiato a giorni alterni. Inoltre, gli EB possono essere suddivisi in diversi piatti per fornire un'abbondante nutrizione.
- Semina gli EB
NOTA: su D5 a D7, scegliere un punto temporale appropriato per placcare gli EB sulle piastre rivestite in ECM in base alle dimensioni degli EB. Gli EB con un diametro approssimativo di 200 μm sono appropriati per la differenziazione retinica. In generale, un pozzo di hPSC in una piastra a 6 pozzetti può produrre da 300 a 1.000 EB. La variazione della resa EB è variata dalle linee hPSC.- Su D4, preparare piatti rivestiti in ECM per la cultura aderente agli EB. Aggiungere 5 ml di ECM a ciascun piatto di coltura tissutale da 100 mm (trattato in superficie) e metterli nell'incubatrice durante la notte.
- Su D5, rimuovere eCM dai piatti pre-rivestiti e aggiungere 10 ml di NIM preriscaldato a ciascun piatto.
- Togliere il piatto contenente EB. Controlla la qualità degli EB al microscopio e assicurati che siano abbastanza luminosi e di forma rotonda. La dimensione degli EB è di circa 200 μm di diametro. Raccogli tutti gli EB in un tubo da 15 ml. Trasferire gli EB dalle portate a un tubo da 15 ml con una pipetta da 5 ml. Lasciare che gli EB si depositino per 5 minuti. Rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando circa 2 ml di mezzo.
- Distribuire gli EB nelle stoviglie rivestite contenenti 10 mL di NIM goccia a goccia con una pipetta da 1 mL. Seminare gli EB ad una densità di circa 2-3 EB per cm2. Ad esempio, aggiungere circa 120-180 EB in una parabola da 100 mm. Per giudicare approssimativamente il numero EB, posiziona una goccia di sospensione EB su un coperchio e conta il numero di EB al microscopio.
NOTA: La densità di placcatura degli EB è uno dei fattori chiave che influenzano l'efficienza dell'induzione retinica. La densità può anche essere regolata da ogni linea hPSC. - Agitare delicatamente i piatti per distribuire uniformemente gli EB. Mettili nell'incubatrice a 37 °C e 5% CO2.
NOTA: Non spostare i piatti per almeno 24 ore per migliorare l'aderenza degli EB.
- Induzione di vescicole ottiche (OV) ed epitelio pigmentato retinico (RPE) in condizioni aderenti
NOTA: Dopo che gli EB sono stati seminati sulla superficie rivestita di ECM, le hPSC possono sviluppare strutture simili a OV, che possono essere osservate già a D20 dopo la differenziazione. In questo protocollo, specifici fattori di crescita o molecole di segnalazione non sono necessari per guidare le hPSC nel destino retinico, ad eccezione dell'aggiunta di integratori N2 e B27 nei mezzi.- Su D8-D9, rimuovere le stoviglie e osservare gli EB al microscopio. Tutti gli EB saranno attaccati e sparsi sui piatti (Figura 1D). Aggiungere 10 mL di NIM fresco a ogni piatto da 100 mm contenente 10 mL di vecchio mezzo. Rimetterli nell'incubatrice.
NOTA: non rimuovere il vecchio supporto. - Su D12, cambiare metà del mezzo con NIM usando una pipetta da 10 ml. Mantieni la cultura nell'incubatore.
- Su D16, rimuovere tutti i NIM dalle stoviglie utilizzando un sistema di aspirazione sottovuoto. Aggiungere 20 ml di RDM a ogni piatto. Continua a coltivare in RDM e cambia metà del mezzo a giorni alterni.
- Durante D10-D30, osservare i cambiamenti morfologici delle cellule due volte alla settimana al microscopio e valutare l'efficienza della differenziazione retinica.
NOTA: a partire da D10, i domini del campo oculare (EF) sono auto-organizzati nelle zone periferiche degli EB aderenti. Le strutture simili a OV appaiono tra D20 e D25, sporgono gradualmente dal piatto e auto-formano una tazza ottica, che è circondata dall'RPE pigmentato (Figura 1E). Gli AV possono essere facilmente riconosciuti con l'anello NR luminoso, rifrattivo e spesso.
- Su D8-D9, rimuovere le stoviglie e osservare gli EB al microscopio. Tutti gli EB saranno attaccati e sparsi sui piatti (Figura 1D). Aggiungere 10 mL di NIM fresco a ogni piatto da 100 mm contenente 10 mL di vecchio mezzo. Rimetterli nell'incubatrice.
- Staccare e colturare OV e RPE in sospensione per ottenere organoidi retinici (RO)
- Su D28-D35, la maggior parte degli UV appare nei piatti. Utilizzare un ago di tungsteno o un ago con una siringa da 1 mL per staccare meccanicamente gli AV morfologicamente identificabili insieme all'RPE adiacente. Coltivateli in sospensione.
NOTA: l'aspetto e la resa di OV e RPE variano ampiamente nelle diverse linee hPSC. Pertanto, il punto temporale di distacco di OV e RPE è flessibile. Gli OT ovvi con l'RPE adiacente possono essere staccati e quindi spostati in una parabola di coltura a basso attacco contenente RDM. Continua a coltivare il resto delle celle fino a quando tutti gli AV e gli RPE non vengono sollevati. - Inserire 50-60 OV in ogni piatto di coltura a attacco basso da 100 mm contenente 15 ml di RDM per la formazione di OR (Figura 1F).
- Cambia RDM ogni 2-3 giorni fino a D42, quando i RO sono ben rotondi.
- Su D28-D35, la maggior parte degli UV appare nei piatti. Utilizzare un ago di tungsteno o un ago con una siringa da 1 mL per staccare meccanicamente gli AV morfologicamente identificabili insieme all'RPE adiacente. Coltivateli in sospensione.
3. Sviluppo e maturazione della retina
NOTA: In questo protocollo, il siero è necessario per mantenere i RO crescere e maturare per la coltura a lungo termine.
-
Laminazione retinica e specificazione nelle RO
- Preparare 10 mL di taurina da 100 mM (1.000x) in 1x PBS. Pesare 125 mg di taurina e sciogliere in 10 ml di 1x PBS. Filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 μm. Aliquota a 500 μL/tubo e conservare a -20 °C.
- Preparare il terreno di coltura retinica 1 (RC1). Mescolare i seguenti componenti: 250 mL di DMEM/F-12, 175 mL di DMEM basic, 50 mL di siero bovino fetale, 10 mL di supplemento B27 al 2%, 5 mL di Antibiotic Antimycotic all'1%, 5 mL di MEM NEAA all'1%, 0,5 mL di taurina 100 μM e 5 mL di L-alanil-L-glutammina.
- Preparare il terreno di coltura retinico 2 (RC2) contenente 450 mL di DMEM/F-12, 50 mL di siero bovino fetale, 5 mL di supplemento N2 all'1%, 5 mL di Antibiotic Antimycotic all'1%, 0,5 mL di taurina 100 μM, 5 mL di 1% MEM NEAA e 5 mL di L-alnil-L-glutammina.
NOTA: RC1 e RC2 non vengono filtrati, ma sottoposti a un test di sterilità. Togliere 1 mL di terreno, aggiungerlo a un piatto da 35 mm e colturare per 3-7 giorni nell'incubatrice a 37 °C e 5% CO2, per garantire la sterilità prima dell'uso. Il supporto può essere conservato a 4 °C e deve essere utilizzato entro 2 settimane per garantire l'attività dei componenti. Tutti i supporti e i reagenti devono essere preriscaldati a RT per 30 minuti prima dell'uso. - Su D42, passare il terreno di coltura da RDM a RC1.
- Inclinare i piatti a circa 30° e lasciare che i RO si depositino per 30 s. Rimuovere il vecchio RDM con una pipetta da 10 mL lasciando circa 1 mL di mezzo per evitare di perdere RO. Aggiungere 15 ml di RC1 fresco a ciascun piatto.
- Agitare delicatamente i piatti per distribuire uniformemente i RO. Rimettete i piatti nell'incubatrice. Cambia l'intero mezzo due volte a settimana in seguito.
- Durante D50-D90, selezionare l'alta qualità dei RO per la cultura a lungo termine, che sono di forma rotonda con un NR spesso e luminoso. Posizionare 30-40 RO in una parabola di attacco bassa da 100 mm con 20 ml di RC1 e cambiare l'intero mezzo due volte a settimana.
- Per la cultura della sospensione a lungo termine degli RO, pipettare i RO per evitare il riattacco RO-RO utilizzando una pipetta. Trasferisci i RO in nuovi piatti di cultura una volta al mese per evitare che i RO si attacchino alla superficie dei piatti.
NOTA: nelle condizioni di coltura della sospensione, gli RO sono di forma rotonda, con un anello NR luminoso e spesso attaccato con più o meno RPE su un lato. La retina neurale laminata si sviluppa e i sottotipi di cellule retiniche appaiono sequenzialmente con le cellule gangliari retiniche generate per la prima volta, seguite da cellule fotorecettrici, cellule amacrine e cellule bipolari.
-
Maturazione dei fotorecettori umani con arricchimento dei coni nelle RO
- Dopo D90, passare il mezzo da RC1 a RC2, che è adatto per la maturazione dei fotorecettori.
- Modificare il supporto come descritto nei passaggi 3.1.7-3.1.8.
NOTA: in questa condizione di coltura, le RO possono crescere a lungo termine (Figura 1G), fino a D300 testate. Le cellule retiniche nei RO diventano mature e vengono acquisiti anche tutti i sottotipi cellulari della retina neurale, comprese le cellule gliali muller, i bastoncelli e i coni. Senza alcuna aggiunta di RA, i fotorecettori a cono sono anche ricchi di RO.
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Representative Results
Il processo di induzione retinica in questo protocollo imita lo sviluppo della retina fetale umana. Per avviare la differenziazione retinica, le hPSC sono state dissociate in piccoli grumi e coltivate in sospensione per indurre la formazione di EB. Su D1, si sono formati aggregati di celle uniformate o EB (Figura 1C). Il mezzo di coltura è stato gradualmente trasferito in NIM. Su D5, gli EB sono stati placcati sui piatti di coltura rivestiti in ECM. Le celle migrarono gradualmente fuori dagli EB (Figura 1D). Da D10, campi oculari auto-organizzati nella zona periferica di EB aderenti. Su D16, il mezzo di induzione è stato sostituito da RDM. Successivamente, i domini NR si sono gradualmente formati, sporgevano dal piatto e si auto-formavano strutture simili a OV circondate dalle celle RPE (Figura 1E). Durante il D28-D35, gli AV insieme all'RPE adiacente sono stati sollevati con un ago affilato e coltivati in sospensione. Nelle condizioni di coltura in sospensione, i RO si sono autoformati comprendenti retina neurale (NR) attaccati con più o meno sfera RPE su un lato(Figura 1F)e potevano sopravvivere e maturare nel tempo finché gli FBS venivano aggiunti al mezzo.
Con il progredire della differenziazione e della specificazione retinica, le hPSC hanno prodotto tutti i principali sottotipi di cellule retiniche in sequenza. I sottotipi di retina neurale si allineano gradualmente a strati, imitando le caratteristiche dell'architettura della retina umana nativa (Figura 2A-G). Le cellule gangliari retiniche (RGC) sono state inizialmente generate da progenitori retinici e accumulate nel lato basale delle NR. Cellule fotorecettrici situate nel lato apicale, mentre le cellule amacrine, le cellule orizzontali, le cellule bipolari e le cellule gliali muller si trovano tutte nello strato intermedio di NRs.
Con questo protocollo, i RO si sono sviluppati nei fotorecettori altamente maturi con aste e coni (Figura 2G-I). I fotorecettori sono aumentati rapidamente nello strato nucleare in via di sviluppo (Figura 2G) dopo la settimana 8 e sono gradualmente maturati dalla settimana 17 in poi. Dalla settimana 21, tutti i sottotipi di fotorecettori, inclusi bastoncelli, coni rossi / verdi e coni blu, possono essere rilevati nelle RO. Sia i bastoncelli ricchi che i coni possono essere ottenuti in questo protocollo di induzione senza alcuna aggiunta di RA durante l'intero processo di differenziazione.
Figura 1: Induzione e caratteristiche morfologiche degli organoidi retinici da hPSC. (A) Schemi di induzione retinica da hPSC. (B) Una tipica colonia di hPSC (10x). (C) EBs su D1 (4x). (D) Su D7, gli EB placcati sono stati attaccati e sparsi sui piatti (4x). (E) Su D25, le strutture simili a vescicole ottiche (OV) si formavano e sporgevano dal piatto (indicato dal cerchio rosso), circondato da RPE pigmentato (4x). (F) Gli organoidi retinici si sono autoformati dopo che gli OV sono stati sollevati e coltivati in condizioni di sospensione (le frecce puntavano NR e RPE (4x). (G) Organoide retinico composto da NR (freccia rossa) e RPE (freccia nera) su D180 (4x). Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I sottotipi di cellule retiniche sono stati rilevati sequenzialmente nei tessuti retinici tridimensionali. Immagini di esempio dei principali tipi di cellule retiniche che esprimono marcatori specifici mediante colorazione immunofluorescente. (A-B) Cellule progenitrici retiniche espresse Ki67 (A) e VSX2 (B). (C) Islet1 cellule gangliari retiniche positive situate nel lato basale della retina neurale. (D) Cellule amacrine positive per AP2α. (E) Cellule gliali di Muller positive per SOX9. (F) Cellule bipolari PKCα positive. (G) Recoverin cellule fotorecettrici positive. (H) Fotorecettori rod positivi rod rod. (I) Fotorecettori a cono positivo L/M-opsina. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo di induzione retinica in più fasi, le hPSC sono state guidate passo dopo passo per ottenere il destino retinico e auto-organizzate in organoidi retinici contenenti NR e RPE laminati. Durante la differenziazione, le hPSC hanno ricapitolato tutte le principali fasi dello sviluppo della retina umana in vivo,da EF, OV e RPE, alla laminazione retinica, generando tutti i sottotipi di cellule retiniche, comprese le cellule gangliari retiniche, le cellule amacrine, le cellule bipolari, i fotorecettori a bastoncello e cono e le cellule gliali muller in ordine spaziale e temporale. La ricapitolazione dello sviluppo retinico andrebbe a beneficio delle applicazioni a valle, come la modellazione delle malattie retiniche.
Sono stati stabiliti un paio di protocolli per generare organoidi retinici da hPSC3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 . In base alle condizioni di coltura, i protocolli possono essere classificati in 2D, 3D e la combinazione di approcci 2D e 3D9,13. Gli approcci 2D6,10,22 significano che tutto il processo di induzione avviene nelle condizioni di coltura aderenti, generando cellule retiniche senza architettura da hPSC. Al contrario, gli approcci 3D7,11,23 significano che tutto il processo di induzione è nelle condizioni di coltura della sospensione, producendo tessuti retinici organizzati. Ad esempio, Sasai, Y. et al.7,24 hanno riportato un metodo SFEBq(coltura fluttuante senza siero di aggregati simili al corpo embrioide con rapida riaggregazione) per guidare gli ESC a differenziarsi in coppette ottiche in coltura in sospensione. Utilizzando gli approcci 3D multi-step8,11,18,20, 25 incluso questo protocollo, le hPSC sono state indotte verso destini retinici e organoidi in condizioni di coltura sia aderente che in sospensione.
Per indurre le hPSC al destino retinico neurale, una serie di fattori esogeni sono stati aggiunti ai media in molti protocolli. Ad esempio, Lamba, et al.26 hanno aggiunto una combinazione di noggin (un inibitore della via BMP) e Dickkopf-1 (dkk1, un antagonista della via di segnalazione Wnt / β-catenina) e fattore di crescita insulino-simile-1 (IGF-1) per dirigere le ESC verso un destino neurale anteriore. Osakada et al.6 hanno aggiunto DAPT (un inibitore delle vie di segnalazione di Notch) e il fattore di determinazione sinistra-destra A (un inibitore delle vie di segnalazione WNT) per ottenere precursori di fotorecettori di bastoncelli e coni. Kuwahara et al.27 e Capowski et al.3 hanno aggiunto BMP4 per una breve esposizione precoce della cultura hPSCs per migliorare la produzione di OV. Al contrario, questo protocollo di induzione retinica ottimizzato è semplice e a basso costo senza richiedere modulatori di segnalazione estrinseci tranne il supplemento di base di N2 e B27.
L'acido retinoico (RA) svolge un ruolo importante nello sviluppo retinico e nella determinazione dei fotorecettori28,29,30. La maggior parte dei protocolli sono stati sviluppati con il supplemento di RA (0,5-1 μM) in determinati periodi. I nostri studi hanno dimostrato che una concentrazione troppo elevata di RA o un periodo troppo lungo di trattamento con AR provocano fotorecettori ricchi di bastoncelli ma inibiscono la differenziazione del cono8,18. Tuttavia, in questo protocollo ottimizzato, l'AR non viene aggiunta ai mezzi di coltura durante l'intero processo di differenziazione18, promuovendo la produzione di fotorecettori a cono, che è responsabile della visione diurna umana e della visione dei colori e necessaria per la sostituzione cellulare del trattamento RD. Sebbene alcuni studi rivelino che la segnalazione dell'ormone tiroideo dirige i sottotipi di cono nei topi e nella retina umana31,32,il regolatore per l'impegno del cono non è ancora chiaro33. In questi studi di Kim et al.34 e Lowe et al.35, la coltura a lungo termine anche senza alcun organoidi retinoico esogeni generati da acido retinoico ricco di coni, che è coerente con questo protocollo ottimizzato.
I punti chiave di questo protocollo da cogliere sono fare EB di alta qualità e seminare EB in modo appropriato. Le cellule crescono rapidamente durante la coltura precoce della sospensione di EB. Il mezzo dovrebbe essere cambiato ogni giorno ed essere sufficiente per fornire un'alimentazione abbondante. La dimensione degli EB, circa 200 μm di diametro, è appropriata per la differenziazione retinica. La densità di placcatura degli EB a 2-3 EBs per cm2 è adatta per la maggior parte delle linee hPSC. Il miglior vantaggio di questo protocollo ottimizzato è la quantificazione della dimensione EB e della densità di placcatura per migliorare significativamente l'efficienza e la ripetibilità dell'induzione retinica. Abbiamo descritto chiaramente tutti i passaggi in dettaglio, il che aiuta in gran parte i ricercatori inesperti a imparare e ripetere l'induzione retinica.
Inoltre, l'efficienza di induzione retinica dipende in gran parte dalla qualità e dalla potenza di differenziazione delle hPSC36,37. HPC diverse hanno efficienze diverse. Alcune linee hPSC hanno infatti una scarsa efficienza, che potrebbe essere dovuta ai metodi di riprogrammazione, alle cellule somatiche e così via. Questo protocollo è stato confermato essere adatto per varie hPSC per ottenere organoidi retinici 3D e l'RPE, tra cui varie hESC e hiPSC riprogrammate da fibroblasti, sangue e cellule urinarie18,20,21. In generale, con questo protocollo sopra descritto, un pozzo di hPSC (circa l'80% di confluenza) in una piastra a 6 pozzetti può generare circa 1.000 EB, producendo circa 200 RO. Pertanto, questo protocollo ad alta efficienza è adatto per la produzione su larga scala di organoidi retinici e beneficia delle applicazioni a valle, tra cui lo studio di base e traslazionale.
In sintesi, il protocollo di induzione retinica ottimizzato è semplice e a basso costo con elevata ripetibilità ed efficienza, offre promettenti modelli personalizzati di malattie della retina e fornisce abbondanti fonti cellulari per la terapia cellulare, lo screening farmacologico e il test di terapia genica.
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Disclosures
Xiufeng Zhong è l'inventore del brevetto relativo alla generazione di cellule retiniche da cellule staminali pluripotenti umane.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), dal Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), dal Science & Technology Project della provincia del Guangdong (2017B020230003), dalla Natural Science Foundation (NSF) della Cina (81570874, 81970842), dal programma Hundred talent della Sun Yat-sen University (PT1001010) e dai Fundamental Research Funds dello State Key Laboratory of Ophthalmology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
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