Summary
Aquí describimos un sistema optimizado de inducción organoide retiniana, que es adecuado para varias líneas de células madre pluripotentes humanas para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia.
Abstract
Las enfermedades degenerativas de la retina son las principales causas de ceguera irreversible sin un tratamiento eficaz. Las células madre pluripotentes que tienen el potencial de diferenciarse en todo tipo de células de la retina, incluso los tejidos mini-retinianas, tienen grandes promesas para los pacientes con estas enfermedades y muchas oportunidades en el modelado de enfermedades y la detección de fármacos. Sin embargo, el proceso de inducción de las hPSC a las células de la retina es complicado y requiere mucho tiempo. Aquí, describimos un protocolo de inducción retiniana optimizado para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia, adecuados para diversas células madre pluripotentes humanas. Este protocolo se realiza sin la adición de ácido retinoico, lo que beneficia el enriquecimiento de los fotorreceptores de cono. La ventaja de este protocolo es la cuantificación del tamaño de EB y la densidad de recubrimiento para mejorar significativamente la eficiencia y la repetibilidad de la inducción retiniana. Con este método, todas las principales células de la retina aparecen secuencialmente y recapitulan los principales pasos del desarrollo de la retina. Facilitará las aplicaciones posteriores, como el modelado de enfermedades y la terapia celular.
Introduction
Las enfermedades degenerativas de la retina (PR), como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la retinosis pigmentaria (RP), se caracterizan por la disfunción y la muerte de las células fotorreceptoras y, por lo general, conducen a una pérdida irreversible de la visión sin formas efectivas de curar1. El mecanismo subyacente a estas enfermedades es en gran parte desconocido en parte debido a la falta de modelos de enfermedades humanas2. En las últimas décadas, se han logrado avances significativos en la medicina regenerativa a través de la tecnología de células madre. Muchos investigadores, incluyéndonos a nosotros mismos, hemos demostrado que las células madre pluripotentes humanas (hPSC), incluidas las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), pueden diferenciarse en todos los tipos de células retinianas, incluso en tejidos mini-retinianas a través de diversos enfoquesde diferenciación3,4,5,6,7,8,9,10, 11, proporcionando un enorme potencial en el modelado de enfermedades y la terapia celular12,13,14.
Sin embargo, el proceso de inducción de las hPSC a las células de la retina es muy complicado y requiere mucho tiempo con baja repetibilidad, lo que requiere investigadores con una rica experiencia y altas habilidades. Durante el proceso de inducción complejo y dinámico, una serie de factores afectarán el rendimiento de los tejidos de la retina15,16,17. Además, los diferentes métodos de inducción a menudo varían considerablemente en el tiempo y la expresión robusta de los marcadores retinianas, lo que podría confundir la recolección de muestras y la interpretación de datos3. Por lo tanto, un protocolo directo de diferenciación retiniana de las hPSC con orientación paso a paso estaría en demanda.
Aquí, en base a nuestros estudios publicados18,19,20,21,se describe un protocolo de inducción retiniana optimizado para generar organoides retinianas (RO) con ricos fotorreceptores de cono a partir de hPSCs, que no requiere el suplemento de ácido retinoico (AR). Este protocolo se centra en la descripción del método de varios pasos para generar retina neural y RPE. La formación de EB es la parte esencial de la etapa de inducción temprana. Tanto el tamaño como la densidad de recubrimiento de los EBs están optimizados cuantitativamente, lo que mejora científicamente el rendimiento de los tejidos de la retina y promueve la repetibilidad. En la segunda parte de la inducción, las vesículas ópticas (OVs) se autoorganizan en el cultivo de adherencia y las ROs forman en el cultivo de suspensión; los cursos de tiempo y las eficiencias de esta parte varían considerablemente en las diferentes líneas de hPSC. La maduración y especificación de las células de la retina en las OR ocurren principalmente en la etapa media y tardía de la inducción. Sin la adición de AR, se pueden producir fotorreceptores maduros con conos y bastones ricos.
El propósito de este protocolo es describir cuantitativamente y detallar cada paso para que los investigadores inexpertos lo repitan. Varias líneas de hPSC han sido inducidas con éxito en ROs por este protocolo con un rendimiento robusto de tejidos retinianas ricos en conos y alta repetibilidad. Las ROs derivadas de HPSCs con este protocolo pueden recapitular los principales pasos del desarrollo de la retina in vivoy sobrevivir a largo plazo, lo que facilita las aplicaciones posteriores, como el modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la terapia celular.
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Protocol
1. Cultura y expansión de las hPSCs
- Cultura HPSC
- Recubrimiento de dos pozos de una placa de 6 pozos con matriz extracelular (ECM, matriz calificada hESC). Preparar 50 ml de una solución de ECM que contenga 8-12 μg/mL de ECM en el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco. En 49 ml de DMEM, agregue 1 ml de la solución de material ECM descongelada (50x). Agregue 1 ml de la solución de ECM a cada pozo de una placa de 6 pozos. Incubarlo durante 1 h en una incubadora a 37 °C y 5% CO2.
- Prepare el medio de mantenimiento hPSC (MM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Precalentación de MM a temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
- Descongelar un vial criogénico de hPSCs (hiPSCs o hESCs) (aproximadamente 1 x 10 6 ) de un tanque de nitrógeno líquidomedianteincubación en un baño de agua a 37 °C durante 30 s.
- Saque el vial y desinfecte cuidadosamente con un aerosol de alcohol desinfectante al 75%. Póngalo en un gabinete de bioseguridad.
- Transfiera la suspensión celular del vial a un tubo de 15 ml, agregue 5 ml de MM precalentados gota a gota al tubo con una pipeta de 5 ml. Mientras tanto, agite suavemente el tubo para mezclar las hPSC.
- Centrifugar el tubo a 170 x g durante 5 min. Retire la mayor parte del sobrenadante con una pipeta de 1 ml con cuidado y deje atrás aproximadamente 50 μL de sobrenadante para evitar la pérdida de las células.
- Agregue 1 ml de MM al tubo y vuelva a colocar el pellet canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo una o dos veces con una pipeta de 1 ml.
NOTA: La supervivencia de células individuales de hPSCs es baja. Se prefieren grupos de células pequeñas con 3-5 células para mantener las hPSC creciendo en colonias. - Retire la ECM de los pozos precubiertos (paso 1.1.1), agregue 1.5 ml de MM a cada pozo y luego distribuya 0.5 ml de suspensión celular por pozo.
- Agite suavemente la placa para distribuir las hPSC de manera uniforme y coloque la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2. No mueva la placa durante al menos 24 h para promover la adherencia celular.
- Cambiar MM cada dos días y pasar las hPSCs cuando la confluencia ha alcanzado alrededor del 80%.
- Paso de hPSCs
NOTA: El mantenimiento del estado indiferenciado en hPSCs es bastante crítico para futuras aplicaciones. Bajo las condiciones adherentes, las hPSC crecen en colonias con un borde bien definido. Las células deben pasar cuando la confluencia de hPSCs alcanza aproximadamente el 80%.- Observe las células bajo un microscopio. Marque y elimine mecánicamente las células diferenciadas claramente visibles (<5%) antes de pasar.
- Prepare la placa recubierta de ECM como se describe en el paso 1.1.1.
- Solución salina tampón de fosfato (PBS) precalentado MM y 1x sin Ca2+ y Mg2+ en RT.
- Precalenta la solución de EDTA de 0,5 mM (en 1x PBS) en un baño de agua a 37 °C.
- Retire el medio de la placa de cultivo utilizando un sistema de aspiración al vacío, agregue 1 ml de 1 pbS en cada pozo para lavar las células con una pipeta de 1 ml y repita dos veces.
- Añadir 1 ml de solución de EDTA por poto para disociar las hPSC en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO2 durante 5 min. No exceda el tiempo de incubación recomendado para evitar la disociación a células individuales.
- Saque la placa y verifique si hay un desprendimiento de células bajo un microscopio. Las hPSC confluentes se aflojan y se puede ver cada borde celular, pero las células no pueden desprenderse fácilmente agitando suavemente la placa celular.
- Retire la solución de EDTA con una pipeta de 1 ml y agregue 1 ml de MM para detener la disociación. Pipetee suavemente las hPSC una o dos veces con una pipeta de 1 ml para resuspend las células. No hay necesidad de centrifugar para recoger las células.
NOTA: Si la mayoría de las células se desprenden de la placa después de la incubación con EDTA, las células se pueden recolectar por centrífuga. - Retire la ECM de los pozos precubiertos (paso 1.2.2) y agregue 1,5 ml de MM por pozo.
- Transfiera 150-200 μL de grupos celulares a cada pozo. En general, las hPSC se pueden pasar en una proporción de 1:6. Por ejemplo, las células de un pozo de una placa de 6 pozos se pueden distribuir a seis pozos nuevos.
- Agite suavemente la placa para distribuir las hPSC de manera uniforme y cultite las hPSC en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 durante al menos 24 h sin tocar la placa.
- Cambie MM cada dos días como se describe en el paso 1.1.
2. Diferenciación retiniana de las hPSC
NOTA: Cuando las colonias alcanzan ~80% de confluencia(Figura 1B),se pueden guiar para diferenciar en organoides retinianas siguiendo el protocolo esquematizado en la Figura 1A. Para garantizar que las hPSC tengan alta calidad y buen rendimiento, evalúe regularmente la pluripotencia con marcadores moleculares como OCT4 o NANOG utilizando IFC o QPCR. Las HPSC deben descartarse si las células diferenciadas representan más del 5% del total de células. Compruebe si hay contaminación por micoplasma con un kit de detección de micoplasma de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice solo hPSC libres de micoplasma, ya que el micoplasma puede alterar la capacidad de diferenciación de las hPSC.
- Preparar medios y reactivos
- Prepare el medio de inducción neural (NIM) mezclando lo siguiente: 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL de suplemento de N2 al 1%, 0,5 mL de heparina al 0,1% (2 mg/mL en 1x PBS) y 5 mL de aminoácidos no esenciales (NEAA) al 1% de MEM.
- Preparar medio de diferenciación retiniana (RDM) que contenga 300 mL de DMEM/F-12, 200 mL de DMEM básico, 10 mL de suplemento de B27 al 2%, 5 mL de Antimicótico Antibiótico al 1%, y 5 mL de 1% de MEM NEAA.
NOTA: Tanto NIM como RDM no se filtran, pero se realiza una prueba de esterilidad. Sacar 1 ml de medio y añadirlo a un plato de 35 mm, y cultivar durante 3-7 días en una incubadora a 37 °C y 5% CO2. El medio se puede almacenar a 4 °C y debe utilizarse en un plazo de 2 semanas para garantizar la actividad de los componentes. - Preparar 10 mM blebbistatina (1.000x) en DMSO. Añadir 1.710 μL de DMSO para disolver 5 mg de Blebbistatin para obtener una solución stock de 10 mM (1.000x), alícuota a 10 μL/tubo y almacenar a -20 °C.
NOTA: Todos los medios y reactivos deben calentarse a RT durante 30 minutos antes de su uso, a menos que se mencione lo contrario.
- Formación de cuerpos embrónidos (EB)
- En el día 0 (D0), inicie la diferenciación. Saque un pozo de hPSC de una placa de 6 pomos, que ha crecido a ~ 80% de confluencia. Recoger las células con solución de disociación de EDTA como se describe en los pasos 1.2.1 a 1.2.6.
- Retire la solución de EDTA, agregue 1 ml de MM que contenga 10 μM de blebbistatina para detener la disociación celular y recoja las células con una pipeta de 1 ml. El tamaño de los grupos celulares es uno de los factores clave que afectan el rendimiento de los EBs. Aproximadamente, se prefieren cinco celdas por grupo para producir el tamaño correcto de EBs en D5 a D7.
NOTA: Este es un paso clave. No pipetee las células demasiadas veces, ya que los agregados similares a EB son difíciles de formar a partir de células individuales de hPSC. - Transfiera la suspensión celular (aproximadamente 2 x 106 células) a una placa de Petri de fijación ultra baja de 100 mm y agregue 9 ml de MM que contengan 10 μM de blebbistatina a la placa.
- Agite suavemente el plato dos veces para distribuir las células de manera uniforme y coloque el plato en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2.
- En D1, después de que las células se cultan durante al menos 24 h, saque el plato y obsérvelo bajo el microscopio. Un gran número de los agregados de células pequeñas se formarán espontáneamente en este momento(Figura 1C).
- Preparar 12 mL de mezcla con MM y NIM en una proporción de 3:1 (9 mL de MM y 3 mL de NIM) en un tubo de 15 mL.
- Transfiera los cultivos celulares a un tubo centrífugo de 15 ml con una pipeta de 10 ml perpendicularmente y agregue 10 ml de la mezcla precalentada al plato.
- Centrifugar el tubo a 60 x g durante 3 min para recoger los agregados, retirar el sobrenadante con una pipeta de 5 ml y dejar unos 500 μL para evitar la pérdida de células.
- Añadir 2 ml de la mezcla al tubo y transferir la suspensión al mismo plato (paso 2.2.7).
- Agite suavemente el plato para distribuir uniformemente los agregados celulares y vuelva a colocar el plato en la incubadora.
- En D2, prepare 12 ml de una nueva mezcla con MM y NIM en una proporción de 1:1 (6 ml de MM y 6 ml de NIM) en un tubo de 15 ml. Cambie el medio celular con la mezcla fresca preparada repitiendo los pasos de 2.2.5 a 2.2.10.
- En D3, cambie el medio celular con 15 ml de NIM como se describió anteriormente. Culta las células durante al menos 5 días en las condiciones de suspensión.
NOTA: Durante D1 a D3, el medio debe cambiarse cada día, proporcionando suficiente nutrición. Desde D3, NIM se puede cambiar cada dos días. Además, los EBs se pueden dividir en varios platos para proporcionar una nutrición abundante.
- Sembrar los EBs
NOTA: En D5 a D7, elija un punto de tiempo apropiado para enchazar los EBs en los platos recubiertos de ECM de acuerdo con el tamaño de los EBs. Los EBs con un diámetro aproximado de 200 μm son apropiados para la diferenciación retiniana. En general, un pozo de hPSC en una placa de 6 pomos puede producir alrededor de 300 a 1,000 EBs. La variación del rendimiento de EB varía según las líneas hPSC.- En D4, prepare platos recubiertos de ECM para el cultivo adherente de EBs. Agregue 5 ml de ECM a cada plato de cultivo de tejidos de 100 mm (tratado en superficie) y colócalos en la incubadora durante la noche.
- En D5, retire el ECM de los platos precubiertos y agregue 10 ml de NIM precalentados a cada plato.
- Saque el plato que contiene EBs. Compruebe la calidad de los EBs bajo el microscopio y asegúrese de que sean bastante brillantes y de forma redonda. El tamaño de los EBs es de aproximadamente 200 μm de diámetro. Recoja todos los EBs en un tubo de 15 mL. Transfiera los EBs de los platos a un tubo de 15 mL con una pipeta de 5 mL. Deje que los EBs se asienten durante 5 minutos. Retire la mayor parte del sobrenadante, dejando atrás unos 2 ml de medio.
- Distribuya los EBs en los platos recubiertos que contienen 10 mL de NIM gota a gota con una pipeta de 1 mL. Sembrar los EBs a una densidad de aproximadamente 2-3 EBs por cm2. Por ejemplo, agregue alrededor de 120-180 EBs en un plato de 100 mm. Para juzgar aproximadamente el número eb, coloque una gota de suspensión EB en un codazo y cuente el número de EB bajo el microscopio.
NOTA: La densidad de recubrimiento de los EBs es uno de los factores clave que afectan la eficiencia de la inducción retiniana. La densidad también se puede ajustar por cada línea hPSC. - Agite suavemente los platos para distribuir los EBs de manera uniforme. Póngalos en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
NOTA: No mueva los platos durante al menos 24 h para mejorar la adherencia de los EBs.
- Inducción de vesículas ópticas (OM) y epitelio pigmentario retiniano (EPR) en condiciones adherentes
NOTA: Después de que los EBs se siembran en la superficie recubierta de ECM, las hPSC pueden desarrollar estructuras similares a OV, que se pueden observar ya D20 después de la diferenciación. En este protocolo, no se requieren factores de crecimiento específicos o moléculas de señalización para guiar las hPSC en el destino de la retina, excepto la adición de suplementos de N2 y B27 en los medios.- En D8-D9, retire los platos y observe los EBs bajo el microscopio. Todos los EBs se adjuntarán y extenderán en los platos (Figura 1D). Añadir 10 ml de NIM fresco a cada plato de 100 mm que contenga 10 ml de medio viejo. Vuelva a colocarlos en la incubadora.
NOTA: No retire el medio antiguo. - En D12, cambie la mitad del medio con NIM usando una pipeta de 10 ml. Mantenga la cultura en la incubadora.
- En D16, retire todo el NIM de los platos utilizando un sistema de aspiración al vacío. Añadir 20 ml de RDM a cada plato. Siga cultivando en RDM y cambie la mitad del medio cada dos días.
- Durante D10-D30, observe los cambios morfológicos de las células dos veces por semana bajo un microscopio y evalúe la eficiencia de la diferenciación retiniana.
NOTA: Desde D10, los dominios de campo ocular (EF) se autoorganizan en las zonas periféricas de los AB adherentes. Las estructuras tipo OV aparecen entre D20 y D25, sobresalen gradualmente del plato y autoforman una copa óptica, que está rodeada por el RPE pigmentado(Figura 1E). Los OV se pueden reconocer fácilmente con el anillo NR brillante, refractivo y grueso.
- En D8-D9, retire los platos y observe los EBs bajo el microscopio. Todos los EBs se adjuntarán y extenderán en los platos (Figura 1D). Añadir 10 ml de NIM fresco a cada plato de 100 mm que contenga 10 ml de medio viejo. Vuelva a colocarlos en la incubadora.
- Separar y cultivar OVs y RPE en suspensión para obtener organoides retinianas (ROs)
- En D28-D35, la mayoría de los OV aparecen en los platos. Use una aguja de tungsteno o una aguja con una jeringa de 1 ml para separar mecánicamente los OV morfológicamente identificables junto con el RPE adyacente. Cultivarlos en suspensión.
NOTA: La apariencia y el rendimiento de los OV y RPE varían ampliamente en las diferentes líneas de hPSC. Por lo tanto, el punto de tiempo de separación de OV y RPE es flexible. Los OV obvios con el RPE adyacente se pueden separar y luego mover a un plato de cultivo de baja fijación que contenga RDM. Siga cultivando el resto de las células hasta que se levanten todos los OV y RPO. - Coloque 50-60 OVs en cada plato de cultivo de baja fijación de 100 mm que contenga 15 mL de RDM para la formación de ROs (Figura 1F).
- Cambie RDM cada 2-3 días hasta D42, cuando los ROs tienen una forma bien redonda.
- En D28-D35, la mayoría de los OV aparecen en los platos. Use una aguja de tungsteno o una aguja con una jeringa de 1 ml para separar mecánicamente los OV morfológicamente identificables junto con el RPE adyacente. Cultivarlos en suspensión.
3. Desarrollo y maduración de la retina
NOTA: En este protocolo, se requiere suero para mantener las ORO creciendo y madurando para el cultivo a largo plazo.
-
Laminación retiniana y especificación en ROs
- Preparar 10 mL de taurina de 100 mM (1,000x) en 1x PBS. Pesar 125 mg de taurina, y disolver en 10 ml de 1x PBS. Filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm. Alícuota a 500 μL/tubo y conservar a -20 °C.
- Preparar el medio de cultivo de retina 1 (RC1). Mezcle los siguientes componentes: 250 mL de DMEM/F-12, 175 mL de DMEM básico, 50 mL de suero fetal bovino, 10 mL de suplemento de B27 al 2%, 5 mL de Antibiótico Antimicótico al 1%, 5 mL de 1% DE MEM NEAA, 0,5 mL de taurina de 100 μM y 5 mL de 2 mM de L-alanil-L-glutamina.
- Preparar el medio de cultivo de retina 2 (RC2) que contenga 450 mL de DMEM/F-12, 50 mL de suero fetal bovino, 5 mL de suplemento de N2 al 1%, 5 mL de 1% antimicótico antibiótico, 0,5 mL de taurina de 100 μM, 5 mL de MEM NEAA al 1% y 5 mL de L-alnil-L-glutamina.
NOTA: El RC1 y el RC2 no se filtran, sino que se someten a una prueba de esterilidad. Saque 1 ml de medio, agréguelo a un plato de 35 mm y cultúe durante 3-7 días en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2,para garantizar la esterilidad antes de su uso. El medio se puede almacenar a 4 °C y debe utilizarse en un plazo de 2 semanas para garantizar la actividad de los componentes. Todos los medios y reactivos deben calentarse previamente a RT durante 30 minutos antes de su uso. - En D42, cambie el medio de cultivo de RDM a RC1.
- Incline los platos a unos 30° y deje que los ROs se asienten durante 30 s. Retire el RDM antiguo con una pipeta de 10 ml dejando aproximadamente 1 ml de medio para evitar la pérdida de ROs. Añadir 15 ml de RC1 fresco a cada plato.
- Agite suavemente los platos para distribuir los ROs de manera uniforme. Vuelva a poner los platos en la incubadora. Cambie todo el medio dos veces por semana a partir de entonces.
- Durante D50-D90, seleccione ROs de alta calidad para cultivo a largo plazo, que son de forma redonda con un NR grueso y brillante. Coloque 30-40 ROs en un plato de fijación baja de 100 mm con 20 ml de RC1, y cambie todo el medio dos veces por semana.
- Para el cultivo de suspensión a largo plazo de los RO, pipetee los RO para evitar la reencayes ro-RO utilizando una pipeta. Transfiera las ROs a nuevos platos de cultivo una vez al mes para evitar que las ROs se peguen a la superficie de los platos.
NOTA: Bajo las condiciones de cultivo de suspensión, los OR son de forma redonda, con un anillo NR brillante y grueso unido con más o menos RPE en un lado. La retina neural laminada se desarrolla y los subtipos de células retinianas aparecen secuencialmente con células ganglionares retinianas generadas por primera vez, seguidas de células fotorreceptoras, células amacrinas y células bipolares.
-
Maduración de fotorreceptores humanos con enriquecimiento de conos en RE
- Después de D90, cambie el medio de RC1 a RC2, que es adecuado para la maduración de fotorreceptores.
- Cambie el medio como se describe en los pasos 3.1.7 a 3.1.8.
NOTA: Bajo esta condición de cultivo, los RU pueden crecer a largo plazo(Figura 1G),hasta D300 probado. Las células retinianas en los CO maduran, y todos los subtipos celulares de retina neural, incluidas las células gliales muller, los bastones y los conos también se adquieren. Sin ninguna adición de AR, los fotorreceptores de cono también son ricos en ROs.
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Representative Results
El proceso de inducción de la retina en este protocolo imita el desarrollo de la retina fetal humana. Para iniciar la diferenciación retiniana, las hPSC se disociaron en pequeños grupos y se cultivaron en suspensión para inducir la formación de EBs. En D1, se formaron los agregados celulares uniformados o EBs(Figura 1C). El medio de cultivo se transformó gradualmente en NIM. En D5, los EBs se colocaron en los platos de cultivo recubiertos de ECM. Las células migraron gradualmente fuera de los EBs (Figura 1D). A partir de D10, los campos oculares se autoorganizan en la zona periférica de los EB adherentes. En D16, el medio de inducción fue reemplazado por RDM. Posteriormente, los dominios NR se formaron gradualmente, sobresalieron del plato y estructuras autoformadas similares a OV rodeadas por las células RPE(Figura 1E). Durante D28-D35, los OV junto con el RPE adyacente se levantaron con una aguja afilada y se cultivaron en suspensión. Bajo las condiciones de cultivo de suspensión, los RO se autoformaron comprendiendo retina neural (NR) unida con más o menos esfera de RPE en un lado(Figura 1F)y podrían sobrevivir y madurar con el tiempo siempre y cuando se agregaran FBS al medio.
A medida que avanzaba la diferenciación y especificación de la retina, las hPSC produjeron todos los principales subtipos de células retinianas secuencialmente. Los subtipos de retina neural se alinearon gradualmente en capas, imitando las características de la arquitectura de la retina humana nativa(Figura 2A-G). Las células ganglionares de la retina (RGC) se generaron por primera vez a partir de progenitores retinianas y se acumularon en el lado basal de los NR. Células fotorreceptoras ubicadas en el lado apical, mientras que las células amacrinas, las células horizontales, las células bipolares y las células gliales muller se encuentran en la capa intermedia de las NR.
Con este protocolo, los RU se convirtieron en los fotorreceptores altamente maduros con bastones y conos(Figura 2G-I). Los fotorreceptores aumentaron rápidamente en la capa nuclear en desarrollo(Figura 2G)después de la semana 8, y maduraron gradualmente a partir de la semana 17 en adelante. A partir de la semana 21, todos los subtipos de fotorreceptores, incluidos los bastones, los conos rojos / verdes y los conos azules, se pueden detectar en las RO. Tanto los bastones ricos como los conos se pueden obtener en este protocolo de inducción sin ninguna adición de AR a lo largo de todo el proceso de diferenciación.
Figura 1: Inducción y características morfológicas de los organoides retinianas a partir de hPSCs. (A) Esquemas de inducción retiniana a partir de hPSCs. (B) Una colonia típica de hPSCs (10x). (C) EBs en D1 (4x). (D) En D7, los EBs chapados se unieron y se extendieron en los platos (4x). (E) En D25, las estructuras similares a la vesícula óptica (OV) se formaron y sobresalieron del plato (indicado por el círculo rojo), rodeadas de RPE pigmentado (4x). (F) Organoides retinianas autoformados después de que los OV fueron levantados y cultivados en condiciones de suspensión (las flechas puntiagudas NR y RPE (4x). (G) Un organoide de la retina que comprende NR (flecha roja) y RPE (flecha negra) en D180 (4x). Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los subtipos de células retinianas se detectaron secuencialmente en tejidos retinianas tridimensionales. Imágenes de ejemplo de los principales tipos de células de la retina que expresan marcadores específicos por tinción inmunofluorescente. (A-B) Células progenitoras de la retina expresadas Ki67 (A) y VSX2 (B). (C) Células ganglionares retinianas positivas para islotes1 situadas en el lado basal de la retina neural. (D) Células amacrinas positivas para AP2α. (E) Células gliales de Muller positivas para SOX9. (F) Células bipolares PKCα positivas. (G) Recuperar células fotorreceptoras positivas. (H) Fotorreceptores de rodopsina positiva. (I) Fotorreceptores de cono positivo L/M-opsina. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo de inducción retiniana de varios pasos, las hPSC se guiaron paso a paso para obtener el destino de la retina y se autoorganizaron en organoides retinianas que contenían NR y RPE laminados. Durante la diferenciación, las hPSC recapitularon todos los pasos principales del desarrollo de la retina humana in vivo,desde EF, OV y RPE, hasta la laminación retiniana, generando todos los subtipos de células retinianas, incluidas las células ganglionares de la retina, las células amacrinas, las células bipolares, los fotorreceptores de bastón y cono, y las células gliales muller en un orden espacial y temporal. La recapitulación del desarrollo de la retina beneficiaría a las aplicaciones posteriores, como el modelado de enfermedades de la retina.
Se han establecido un par de protocolos para generar organoides retinianas a partir de hPSCs3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 . De acuerdo con las condiciones de cultivo, los protocolos se pueden clasificar en 2D, 3D, y la combinación de enfoques 2D y 3D9,13. Los enfoques 2D6,10,22 significan que todo el proceso de inducción ocurre en las condiciones de cultivo adherente, generando células retinianas sin arquitectura a partir de hPSCs. En contraste, los enfoques 3D7,11,23 significan que todo el proceso de inducción está bajo las condiciones de cultivo en suspensión, produciendo tejidos retinianas organizados. Por ejemplo, Sasai, Y. et al.7,24 informaron un método SFEBq (cultivo flotante sin suero de agregados similares a cuerpos embrionarios con reagregación rápida) para guiar a las ESC a diferenciarse en copas ópticas en cultivo de suspensión. Utilizando los enfoques 3D de varios pasos8,11,18,20,25 incluyendo este protocolo, las hPSCs han sido inducidas hacia destinos retinianas y organoides tanto en condiciones de cultivo adherente como en suspensión.
Para inducir a las hPSC al destino de la retina neural, se han agregado una serie de factores exógenos a los medios en muchos protocolos. Por ejemplo, Lamba, et al.26 agregaron una combinación de noggin (un inhibidor de la vía BMP) y Dickkopf-1 (dkk1, un antagonista de la vía de señalización Wnt /β-catenina) y factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) para dirigir las ESC a un destino neural anterior. Osakada et al.6 agregaron DAPT (un inhibidor de las vías de señalización notch) y factor de determinación izquierda-derecha A (un inhibidor de las vías de señalización WNT) para obtener precursores de fotorreceptores de bastones y conos. Kuwahara et al.27 y Capowski et al.3 agregaron BMP4 para la exposición breve y temprana del cultivo de hPSCs para mejorar la producción de OV. Por el contrario, este protocolo de inducción retiniana optimizado es simple y de bajo costo sin requerir moduladores de señalización extrínseca, excepto el suplemento básico de N2 y B27.
El ácido retinoico (AR) juega un papel importante en el desarrollo de la retina y la determinación de fotorreceptores28,29,30. La mayoría de los protocolos se desarrollaron con el suplemento de AR (0,5-1 μM) en ciertos períodos. Nuestros estudios han demostrado que una concentración demasiado alta de AR o un período demasiado largo de tratamiento con AR dan como resultado fotorreceptores ricos en bastones, pero inhiben la diferenciación deconos 8,18. Sin embargo, en este protocolo optimizado, la AR no se agrega a los medios de cultivo a lo largo de todo el proceso de diferenciación18,promoviendo la producción de fotorreceptores de cono, que es responsable de la visión diurna humana y la visión del color y requerida para el reemplazo celular del tratamiento de RD. Aunque algunos estudios revelan que la señalización de la hormona tiroidea dirige los subtipos de conos en ratones y retina humana31,32,el regulador para el compromiso cono aún no está claro33. En estos estudios de Kim et al.34 y Lowe et al.35,el cultivo a largo plazo también sin ningún ácido retinoico exógeno generó organoides retinianas ricos en conos, lo que es consistente con este protocolo optimizado.
Los puntos clave de este protocolo a comprender son hacer EBs de alta calidad y sembrar EBs de manera apropiada. Las células crecen rápidamente durante el cultivo temprano de suspensión de EB. El medio debe cambiarse todos los días y ser suficiente para proporcionar una nutrición abundante. El tamaño de los EBs, de aproximadamente 200 μm de diámetro, es apropiado para la diferenciación retiniana. La densidad de recubrimiento de los EBs a 2-3 EBs por cm2 es adecuada para la mayoría de las líneas hPSC. La mejor ventaja de este protocolo optimizado es la cuantificación del tamaño de EB y la densidad de recubrimiento para mejorar significativamente la eficiencia y la repetibilidad de la inducción retiniana. Hemos descrito claramente todos los pasos en detalle, lo que ayuda en gran medida a los investigadores inexpertos a aprender y repetir la inducción retiniana.
Además, la eficiencia de la inducción retiniana depende en gran medida de la calidad y la potencia de diferenciación de las hPSCs36,37. Diferentes hPSC tienen diferentes eficiencias. De hecho, algunas líneas hPSC tienen una eficiencia deficiente, lo que podría deberse a los métodos de reprogramación, las células somáticas, etc. Se ha confirmado que este protocolo es adecuado para varias hPSC para obtener organoides retinianas 3D y el EPR, incluyendo varios hESCs e hiPSC reprogramados a partir de fibroblastos, sangre y células de orina18,20,21. En general, con este protocolo descrito anteriormente, un pozo de hPSC (aproximadamente el 80% de confluencia) en una placa de 6 pomos puede generar aproximadamente 1,000 EBs, produciendo aproximadamente 200 ROs. Por lo tanto, este protocolo con alta eficiencia es adecuado para la producción a gran escala de organoides retinianas y beneficia las aplicaciones posteriores, incluido el estudio básico y traslacional.
En resumen, el protocolo de inducción retiniana optimizado es simple y de bajo costo con alta repetibilidad y eficiencia, ofrece modelos personalizados prometedores de enfermedades de la retina y proporciona abundante fuente celular para la terapia celular, la detección de medicamentos y la prueba de terapia génica.
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Disclosures
Xiufeng Zhong es el inventor de patentes relacionado con la generación de células retinianas a partir de células madre pluripotentes humanas.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional Clave de I + D de China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), el Fondo de Proyectos de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (201803010078), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guangdong (2017B020230003), la Fundación de Ciencias Naturales (NSF) de China (81570874, 81970842), el programa de talentos Hundred de la Universidad Sun Yat-sen (PT1001010) y los Fondos de Investigación Fundamental del Laboratorio Estatal Clave de Oftalmología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
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