Summary
Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.
Abstract
Doenças degenerativas da retina são as principais causas de cegueira irreversível sem tratamento efetivo. Células-tronco pluripotentes que têm o potencial de se diferenciar em todos os tipos de células da retina, mesmo mini-tecidos da retina, possuem enormes promessas para pacientes com essas doenças e muitas oportunidades na modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos. No entanto, o processo de indução de hPSCs para células de retina é complicado e demorado. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado de indução da retina para gerar tecidos de retina com alta reprodutibilidade e eficiência, adequados para várias células-tronco pluripotentes humanas. Este protocolo é realizado sem a adição de ácido retinóico, que beneficia o enriquecimento de fotorreceptores de cone. A vantagem deste protocolo é a quantificação do tamanho do EB e da densidade de revestimento para aumentar significativamente a eficiência e a repetibilidade da indução da retina. Com este método, todas as principais células da retina aparecem sequencialmente e recapitulam os principais passos do desenvolvimento da retina. Facilitará aplicações a jusante, como modelagem de doenças e terapia celular.
Introduction
As doenças degenerativas da retina (RD), como a degeneração macular relacionada à idade (ED) e a retinite pigmentosa (RP), são caracterizadas pela disfunção e morte de células fotorreceptoras e normalmente levam à perda irreversível da visão sem formas efetivas de cura1. O mecanismo subjacente a essas doenças é parcialmente desconhecido devido à falta de modelos de doenças humanas2. Ao longo das últimas décadas, avanços significativos foram realizados na medicina regenerativa através da tecnologia de células-tronco. Muitos pesquisadores, incluindo nós mesmos, mostraram que células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs), podem se diferenciar em todos os tipos de células da retina, mesmo tecidos mini-retinas através de várias abordagens de diferenciação3,4,5,6,7,8,9,10, 11, proporcionando enorme potencial na modelagem da doença e na terapia celular12,13,14.
No entanto, o processo de indução de hPSCs para células de retina é altamente complicado e demorado com baixa repetibilidade, o que requer pesquisadores com rica experiência e altas habilidades. Durante o processo de indução complexa e dinâmica, uma série de fatores impactará o rendimento dos tecidos da retina15,16,17. Além disso, diferentes métodos de indução muitas vezes variam consideravelmente em tempo e expressão robusta de marcadores de retina, o que pode confundir a coleta de amostras e a interpretação dos dados3. Portanto, um protocolo simples de diferenciação de retina dos hPSCs com orientação passo a passo seria demandado.
Aqui, com base em nossos estudos publicados18,19,20,21, um protocolo otimizado de indução de retina para gerar organoides de retina (ROs) com fotorreceptores de cone rico de hPSCs, o que não requer o suplemento de ácido retinóico (RA). Este protocolo se concentra na descrição do método de várias etapas para gerar retina neural e RPE. A formação do EB é a parte essencial da fase inicial de indução. Tanto o tamanho quanto a densidade de revestimento dos EBs são otimizados quantitativamente, o que aumenta cientificamente o rendimento dos tecidos da retina e promove a repetibilidade. Na segunda parte da indução, vesículas ópticas (OVs) se auto-organizam na cultura de adesão e forma de ROs na cultura de suspensão; os cursos de tempo e eficiência desta parte variam consideravelmente em diferentes linhas hPSC. A maturação e especificação das células da retina em ROs ocorrem principalmente no estágio médio e tardio da indução. Sem a adição de RA, podem ser produzidos fotorreceptores maduros com cones ricos e hastes.
O objetivo deste protocolo é descrever quantitativamente e detalhar cada passo para pesquisadores inexperientes se repetirem. Várias linhas de hPSC foram induzidas com sucesso em ROs por este protocolo com um rendimento robusto de tecidos retinados ricos em cone e alta repetibilidade. Os ROs derivados do HPSCs com este protocolo podem recapitular os principais passos do desenvolvimento da retina in vivo, e sobreviver a longo prazo, o que facilita aplicações a jusante, como modelagem de doenças, rastreamento de medicamentos e terapia celular.
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Protocol
1. Cultura e expansão de hPSCs
- Cultura HPSC
- Cubra dois poços de uma placa de 6 poços com matriz extracelular (ECM, matriz qualificada pelo HESC). Prepare 50 mL de uma solução ECM contendo 8-12 μg/mL de ECM no Meio de Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco. Em 49 mL de DMEM, adicione 1 mL da solução de estoque ECM descongelada (50x). Adicione 1 mL da solução ECM a cada poço de uma placa de 6 poços. Incuba-lo por 1h em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
- Prepare o meio de manutenção hPSC (MM) de acordo com a instrução do fabricante.
- MM pré-quente em temperatura ambiente (RT) por 30 min.
- Descongele um frasco criogênico de hPSCs (hiPSCs ou hESCs) (cerca de 1 x 106) de um tanque de nitrogênio líquido por incubação em um banho de água a 37 °C para 30 s.
- Retire o frasco e desinfete-o cuidadosamente usando um spray de álcool desinfecção de 75%. Coloque-o em um armário de biossegurança.
- Transfira a suspensão celular do frasco para um tubo de 15 mL, adicione 5 mL de gota MM pré-aquecida ao tubo usando uma pipeta de 5 mL. Enquanto isso, agite suavemente o tubo para misturar os hPSCs .
- Centrifugar o tubo a 170 x g por 5 min. Remova a maior parte do supernante usando uma pipeta de 1 mL cuidadosamente e deixe para trás cerca de 50 μL de supernasce para evitar perder as células.
- Adicione 1 mL de MM ao tubo e resuspenque a pelota, em tubos suavemente para cima e para baixo uma ou duas vezes com uma pipeta de 1 mL.
NOTA: A sobrevivência de células únicas de hPSCs é baixa. Pequenos aglomerados de células com células 3-5 são preferidos para manter os hPSCs crescendo em colônias. - Retire o ECM dos poços pré-revestidos (etapa 1.1.1), adicione 1,5 mL de MM a cada poço e, em seguida, distribua 0,5 mL de suspensão celular por poço.
- Agite suavemente a placa para distribuir os hPSCs uniformemente, e coloque a placa em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Não mova a placa por pelo menos 24 horas para promover a adesão celular.
- Mude mm a cada dois dias e passagem os hPSCs quando a confluência atingiu cerca de 80%.
- Passagem de hPSCs
NOTA: A manutenção do estado indiferenciado em hPSCs é bastante crítica para outras aplicações. Sob as condições aderentes, os HPSCs crescem em colônias com uma fronteira bem definida. As células devem ser passagemdas quando a confluência de hPSCs atingir cerca de 80%.- Observe as células sob um microscópio. Marque e remova mecanicamente as células diferenciadas claramente visíveis (<5%) antes da passagem.
- Prepare a placa revestida de ECM conforme descrito na etapa 1.1.1.
- Soro fisiológico pré-aquecido MM e 1x tampão de fosfato (PBS) sem Ca2+ e Mg2+ no RT.
- Pré-aqueça a solução 0,5 mM EDTA (em 1x PBS) em um banho de água a 37 °C.
- Remova o meio da placa de cultura usando um sistema de aspiração a vácuo, adicione 1 mL de 1x PBS em cada poço para lavar as células usando uma pipeta de 1 mL e repita duas vezes.
- Adicione 1 mL de solução EDTA por poço para dissociar os hPSCs em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO2 por 5 min. Não exceda o tempo de incubação recomendado para evitar a dissociação de células únicas.
- Retire a placa e verifique se há desprendimento das células sob um microscópio. Os hPSCs confluentes se soltam e cada borda celular pode ser vista, mas as células não podem sair facilmente agitando suavemente a placa celular.
- Remova a solução EDTA com uma pipeta de 1 mL e adicione 1 mL de MM para impedir a dissociação. Pipete suavemente os hPSCs uma ou duas vezes com uma pipeta de 1 mL para resuspensar as células. Não há necessidade de centrífuga para coletar as células.
NOTA: Se a maioria das células sair da placa após a incubação com EDTA, as células podem ser coletadas por centrífuga. - Retire o ECM dos poços pré-revestidos (etapa 1.2.2) e adicione 1,5 mL de MM por poço.
- Transfira 150-200 μL de aglomerados celulares para cada poço. Geralmente, os hPSCs podem ser passagemdos a uma proporção de 1:6. Por exemplo, células de um poço de uma placa de 6 poços podem ser distribuídas para seis novos poços.
- Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente os hPSCs e cultue os hPSCs na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por pelo menos 24h sem tocar na placa.
- Mude MM a cada dois dias como descrito na etapa 1.1.
2. Diferenciação de retina dos hPSCs
NOTA: Quando as colônias atingem ~80% de confluência(Figura 1B),elas podem ser guiadas a diferenciar-se em organoides de retina seguindo o protocolo esquematizado na Figura 1A. Para garantir que os hPSCs tenham alta qualidade e bom rendimento, avalie regularmente a pluripotência com marcadores moleculares como OCT4 ou NANOG usando IFC ou QPCR. Os HPSCs devem ser descartados se as células diferenciadas responderem por mais de 5% do total de células. Verifique se há contaminação por mycoplasma com um kit de detecção de mycoplasma de acordo com as instruções do fabricante. Use apenas hPSCs sem mycoplasma, pois o mycoplasma pode alterar a capacidade de diferenciação dos hPSCs.
- Preparar mídia e reagentes
- Prepare o meio de indução neural (NIM) misturando o seguinte: 500 mL da mistura de médio/nutriente modificado da Águia Modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL de 1% de suplemento N2, 0,5 mL de heparina de 0,1% (2 mg/mL em 1x PBS) e 5 mL de aminoácidos não essenciais MEM (NEAA).
- Prepare o meio de diferenciação da retina (RDM) contendo 300 mL de DMEM/F-12, 200 mL de DMEM básico, 10 mL de suplemento B27 de 2%, 5 mL de 1% antibiótico antimycótico e 5 mL de 1% MEM NEAA.
NOTA: Tanto o NIM quanto o RDM não são filtrados, mas um teste de esterilidade é realizado. Tire 1 mL de médio e adicione-o em um prato de 35 mm, e cultura por 3-7 dias em uma incubadora a 37 °C e 5% DE CO2. A mídia pode ser armazenada a 4 °C e deve ser usada dentro de 2 semanas para garantir a atividade dos componentes. - Prepare 10 mM Blebbistatin (1.000x) em DMSO. Adicione 1.710 μL de DMSO para dissolver 5 mg de Blebbistatin para obter uma solução de estoque de 10 mM (1.000x), alíquota a 10 μL/tubo e armazenar a -20 °C.
NOTA: Todos os meios de comunicação e reagentes devem ser aquecidos em RT por 30 minutos antes do uso, a menos que seja mencionado de outra forma.
- Formação do corpo embrionário (EB)
- No dia 0 (D0), inicie a diferenciação. Retire um poço de hPSCs de uma placa de 6 poços, que cresceu para ~80% de confluência. Colete as células com solução de dissociação EDTA conforme descrito nas etapas 1.2.1 a 1.2.6.
- Remova a solução EDTA, adicione 1 mL de MM contendo Blebbistatin de 10 μM para parar a dissociação celular e colete as células com uma pipeta de 1 mL. O tamanho dos aglomerados celulares é um dos fatores-chave que impactam o rendimento dos EBs. Aproximadamente, cinco células por aglomerado são preferidas para produzir o tamanho certo de EBs em D5 a D7.
NOTA: Este é um passo fundamental. Não enconha as células muitas vezes, uma vez que agregados semelhantes ao EB são difíceis de formar a partir de células únicas de hPSCs. - Transfira a suspensão celular (cerca de 2 x 106 células) para uma placa de Petri de fixação ultra-baixa de 100 mm e adicione 9 mL de MM contendo Blebbistatin de 10 μM ao prato.
- Agite suavemente o prato duas vezes para distribuir as células uniformemente, e coloque o prato na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
- Em D1, depois que as células são cultivadas por pelo menos 24 h, tire o prato e observe-o sob o microscópio. Um grande número de pequenos agregados celulares será espontaneamente formado por esta altura(Figura 1C).
- Prepare 12 mL de mistura com MM e NIM a uma proporção de 3:1 (9 mL de MM e 3 mL de NIM) em um tubo de 15 mL.
- Transfira as culturas celulares para um tubo de centrífugas de 15 mL com uma pipeta de 10 mL perpendicularmente, e adicione 10 mL da mistura pré-aquecida ao prato.
- Centrifugar o tubo a 60 x g por 3 min para coletar os agregados, remova o supernatante usando uma pipeta de 5 mL e deixe para trás cerca de 500 μL para evitar a perda de células.
- Adicione 2 mL da mistura ao tubo e transfira a suspensão para o mesmo prato (etapa 2.2.7).
- Agite suavemente o prato para distribuir uniformemente os agregados celulares, e coloque o prato de volta na incubadora.
- Em D2, prepare 12 mL de uma nova mistura com MM e NIM a uma proporção de 1:1 (6 mL de MM e 6 mL de NIM) em um tubo de 15 mL. Mude o meio celular com a mistura fresca preparada repetindo os passos de 2.2.5 para 2.2.10.
- Em D3, troque o meio celular com 15 mL de NIM como descrito acima. Cultume as células por pelo menos 5 dias sob as condições de suspensão.
NOTA: Durante a D1 para a D3, o meio deve ser alterado todos os dias, proporcionando nutrição suficiente. Desde a D3, o NIM pode ser alterado a cada dois dias. Além disso, os EBs podem ser divididos em diversos pratos para proporcionar nutrição abundante.
- Sementes os EBs
NOTA: Em D5 a D7, escolha um ponto de tempo apropriado para emplacar os EBs nos pratos revestidos de ECM de acordo com o tamanho dos EBs. EBs com diâmetro aproximado de 200 μm é apropriado para a diferenciação da retina. Em geral, um poço de hPSCs em uma placa de 6 poços pode produzir cerca de 300 a 1.000 EBs. A variação do rendimento do EB é variada pelas linhas hPSC.- Na D4, prepare pratos revestidos de ECM para a cultura aderente aos EBs. Adicione 5 mL de ECM a cada prato de cultura de tecido de 100 mm (tratado na superfície) e coloque-os na incubadora durante a noite.
- Em D5, retire o ECM dos pratos pré-revestidos e adicione 10 mL de NIM pré-aquecido a cada prato.
- Tire o prato que contém EBs. Verifique a qualidade dos EBs sob o microscópio e certifique-se de que eles são bastante brilhantes e redondos em forma. O tamanho dos EBs tem aproximadamente 200 μm de diâmetro. Colete todos os EBs em um tubo de 15 mL. Transfira os EBs dos pratos para um tubo de 15 mL com uma pipeta de 5 mL. Deixe os EBs se acalmarem por 5 minutos. Remova a maior parte do supernaspe, deixando para trás cerca de 2 mL de meio.
- Distribua os EBs nos pratos revestidos contendo 10 mL de NIM gota a gota com uma pipeta de 1 mL. Semente os EBs a uma densidade de aproximadamente 2-3 EBs por cm2. Por exemplo, adicione cerca de 120-180 EBs em um prato de 100 mm. Para julgar aproximadamente o número do EB, coloque uma gota de suspensão do EB em um deslizamento de cobertura, e conte o número de EBs sob o microscópio.
NOTA: A densidade de revestimento dos EBs é um dos fatores-chave que impactam a eficiência da indução da retina. A densidade também pode ser ajustada por cada linha hPSC. - Agite delicadamente os pratos para distribuir os EBs uniformemente. Coloque-os na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: Não mova os pratos por pelo menos 24h para aumentar a adesão dos EBs.
- Indução de vesículas ópticas (OVs) e epitélio pigmento de retina (RPE) em condições aderentes
NOTA: Depois que os EBs são semeados na superfície revestida de ECM, os hPSCs podem desenvolver estruturas semelhantes a OV, que podem ser observadas tão cedo quanto D20 após a diferenciação. Neste protocolo, fatores específicos de crescimento ou moléculas de sinalização não são necessários para guiar os hPSCs para o destino da retina, exceto a adição de suplementos N2 e B27 na mídia.- Em D8-D9, remova os pratos e observe os EBs sob o microscópio. Todos os EBs serão anexados e distribuídos nos pratos(Figura 1D). Adicione 10 mL de NIM fresco a cada prato de 100 mm contendo 10 mL de meio antigo. Coloque-os de volta na incubadora.
NOTA: Não remova o meio antigo. - Em D12, troque metade do meio com NIM usando uma pipeta de 10 mL. Mantenha a cultura na incubadora.
- Em D16, remova todos os NIM dos pratos usando um sistema de aspiração a vácuo. Adicione 20 mL de RDM a cada prato. Continue culminando em RDM e troque metade do meio a cada dois dias.
- Durante a D10-D30, observe as alterações morfológicas das células duas vezes por semana sob um microscópio e avalie a eficiência da diferenciação da retina.
NOTA: Desde D10, os domínios de eye field (EF) são auto-organizados nas zonas periféricas dos EBs aderentes. As estruturas semelhantes a OV aparecem entre D20 e D25, gradualmente se projetam do prato, e auto-formam um copo óptico, que é cercado pelo RPE pigmentado(Figura 1E). Os OVs podem ser facilmente reconhecidos com o anel NR brilhante, refrativo e grosso.
- Em D8-D9, remova os pratos e observe os EBs sob o microscópio. Todos os EBs serão anexados e distribuídos nos pratos(Figura 1D). Adicione 10 mL de NIM fresco a cada prato de 100 mm contendo 10 mL de meio antigo. Coloque-os de volta na incubadora.
- Despeito e cultura OVs e RPE em suspensão para obter organoides de retina (ROs)
- Na D28-D35, a maioria dos OVs aparecem nos pratos. Use uma agulha de tungstênio ou uma agulha com seringa de 1 mL para desprender mecanicamente os OVs morfologicamente identificáveis junto com o RPE adjacente. Cultuá-los em suspensão.
NOTA: A aparência e o rendimento de OVs e RPE variam amplamente em diferentes linhas hPSC. Assim, o ponto de tempo de desapegar OV e RPE é flexível. OVs óbvios com o RPE adjacente podem ser destacados e, em seguida, movidos para um prato de cultura de baixa fixação contendo RDM. Continue a culminar o resto das células até que todos os OVs e RPEs sejam levantados. - Coloque 50-60 OVs em cada prato de cultura de apego baixo de 100 mm contendo 15 mL de RDM para a formação de ROs(Figura 1F).
- Altere rdm a cada 2-3 dias até D42, quando os ROs são bem em forma redonda.
- Na D28-D35, a maioria dos OVs aparecem nos pratos. Use uma agulha de tungstênio ou uma agulha com seringa de 1 mL para desprender mecanicamente os OVs morfologicamente identificáveis junto com o RPE adjacente. Cultuá-los em suspensão.
3. Desenvolvimento e maturação da retina
NOTA: Neste protocolo, o soro é necessário para manter os ROs crescer e amadurecer para a cultura de longo prazo.
-
Laminação e especificação da retina em ROs
- Prepare 10 mL de taurina de 100 mM (1.000x) em 1x PBS. Pesar 125 mg de taurina, e dissolver em 10 mL de 1x PBS. Filtre a solução com um filtro de seringa de 0,22 μm. Alíquota a 500 μL/tubo e armazena a -20 °C.
- Prepare a cultura da retina meio 1 (RC1). Misture os seguintes componentes: 250 mL de DMEM/F-12, 175 mL de DMEM básico, 50 mL de soro bovino fetal,10 mL de suplemento B27 de 2%, 5 mL de 1% Antibiótico Antimycótico, 5 mL de 1% MEM NEAA, 0,5 mL de 100 μM taurina, e 5 mL de 2 mM L-alanyl-L-glutamine.
- Prepare o meio de cultura da retina 2 (RC2) contendo 450 mL de DMEM/F-12, 50 mL de soro bovino fetal, 5 mL de suplemento N2 de 1%, 5 mL de 1% Antibiótico Antimycético, 0,5 mL de 100 μM taurina, 5 mL de 1% MEM NEAA, e 5 mL de 2 mM L-alnyl-L-glutamina.
NOTA: O RC1 e o RC2 não são filtrados, mas passam por um teste de esterilidade. Tire 1 mL de médio, adicione-o a um prato de 35 mm e cultura por 3-7 dias na incubadora a 37 °C e 5% de CO2, para garantir a esterilidade antes do uso. O meio pode ser armazenado a 4 °C e deve ser usado dentro de 2 semanas para garantir a atividade dos componentes. Todos os meios de comunicação e reagentes devem ser pré-aquecidos em RT por 30 minutos antes do uso. - Em D42, mude o meio de cultura de RDM para RC1.
- Incline os pratos em cerca de 30° e deixe os ROs se acalmarem por 30 s. Remova o RDM antigo com uma pipeta de 10 mL deixando para trás cerca de 1 mL de média para evitar perder ROs. Adicione 15 mL de RC1 fresco a cada prato.
- Agite suavemente os pratos para distribuir os ROs uniformemente. Coloque os pratos de volta na incubadora. Troque todo o meio duas vezes por semana depois disso.
- Durante o D50-D90, selecione a alta qualidade dos ROs para cultura de longo prazo, que são em forma redonda com uma NR grossa e brilhante. Coloque 30-40 ROs em um prato de 100 mm de baixa fixação com 20 mL de RC1, e mude todo o meio duas vezes por semana.
- Para a cultura de suspensão a longo prazo dos ROs, pipeta os ROs para evitar a religação RO-RO usando uma pipeta. Transfira ROs para novos pratos culturais uma vez por mês para evitar que os ROs grudem na superfície dos pratos.
NOTA: Sob as condições de cultura de suspensão, os ROs são em forma redonda, com um anel NR brilhante e grosso anexado com mais ou menos RPE de um lado. A retina neural laminada desenvolve e subtipos de células da retina aparecem sequencialmente com células gânglios da retina geradas pela primeira vez, seguidas por células fotorreceptoras, células amacrinas e células bipolares.
-
Amadurecimento do fotoreceptor humano com enriquecimento de cones em ROs
- Depois de D90, mude o meio de RC1 para RC2, que é adequado para a maturação do fotorreceptor.
- Alterar o meio conforme descrito nas etapas 3.1.7-3.1.8.
NOTA: Sob esta condição de cultura, os ROs podem crescer a longo prazo(Figura 1G),até d300 testados. As células retinianas em ROs tornam-se maduras, e todos os subtipos celulares da retina neural, incluindo células glial muller, hastes e cones também são adquiridos. Sem qualquer adição de RA, os fotorreceptores de cone também são ricos em ROs.
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Representative Results
O processo de indução da retina neste protocolo imita o desenvolvimento da retina fetal humana. Para iniciar a diferenciação da retina, os HPSCs foram dissociados em pequenos aglomerados e cultivados em suspensão para induzir a formação de EBs. Em D1, formaram-se os agregados de células uniformizadas ou EBs(Figura 1C). O meio de cultura foi gradualmente transformado em NIM. Na D5, os EBs foram banhados nos pratos de cultura revestidos de ECM. As células migraram gradualmente para fora dos EBs (Figura 1D). A partir de D10, os campos oculares auto-organizados na zona periférica dos EBs aderentes. Na D16, o meio de indução foi substituído pelo RDM. Posteriormente, os domínios NR gradualmente se formaram, salientes do prato, e estruturas auto-formadas semelhantes a OV cercadas pelas células RPE(Figura 1E). Durante o D28-D35, os OVs juntamente com o RPE adjacente foram levantados com uma agulha afiada e cultivados em suspensão. Sob as condições de cultura de suspensão, os ROs auto-formados compreendendo a retina neural (NR) anexada com mais ou menos esfera de RPE em um lado (Figura 1F) e poderiam sobreviver e amadurecer horas extras desde que fbs fossem adicionados ao meio.
À medida que a diferenciação e especificação da retina progrediam, os HPSCs produziam todos os principais subtipos de células da retina sequencialmente. Os subtipos da retina neural gradualmente alinhados em camadas, imitando as características da arquitetura da retina humana nativa (Figura 2A-G). As células gânglios da retina (RGCs) foram primeiramente geradas a partir de progenitores da retina e acumuladas no lado basal das NRs. Células fotorreceptoras localizadas no lado apical, enquanto células amacrinas, células horizontais, células bipolares e células gliais muller, todas localizadas na camada intermediária de NRs.
Com este protocolo, os ROs se desenvolveram nos fotorreceptores altamente maduros com hastes e cones(Figura 2G-I). Os fotorreceptores aumentaram rapidamente na camada nuclear em desenvolvimento(Figura 2G) após a semana 8, e gradualmente amadureceram a partir da semana 17 em diante. A partir da semana 21, todos os subtipos de fotorreceptores, incluindo hastes, cones vermelhos/verdes e cones azuis podem ser detectados em ROs. Tanto varas e cones ricos podem ser obtidos neste protocolo de indução sem qualquer adição de RA durante todo o processo de diferenciação.
Figura 1: Indução e características morfológicas de organoides de retina de hPSCs. (A) Esquemas de indução da retina a partir de hPSCs. (B) Uma colônia típica de hPSCs (10x). (C) EBs em D1 (4x). (D) Na D7, os EBs banhados foram anexados e espalhados nos pratos (4x). (E) Na D25, a vesícula óptica como estruturas (OVs) formou-se e salientou-se a partir do prato (indicado pelo círculo vermelho), cercado por RPE pigmentado (4x). (F) Organoides retinais auto-formados após os OVs serem levantados e cultivados em condições de suspensão (as setas pontudas NR e RPE (4x). (G) Um organoide de retina composto por NR (seta vermelha) e RPE (seta preta) em D180 (4x). Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Subtipos de células da retina foram detectados sequencialmente em tecidos tridimensionais da retina. Exemplo de imagens de grandes tipos de células da retina expressando marcadores específicos por coloração imunofluorescente. (A-B) Células progenitoras de retina expressas Ki67 (A) e VSX2 (B). (C) Ilhotas1 células gânglios de retina positivas localizadas no lado basal da retina neural. (D) Células amacrinas positivas para AP2α. (E) Células gliais muller positivas para SOX9. (F) Células bipolares PKCα positivas. (G) Recuperar células fotorreceptoras positivas. (H) Fotorreceptores positivos da haste de rhodopsin. (I) Fotorreceptores de cone positivos L/M-opsin. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo de indução de retina de várias etapas, os HPSCs foram guiados passo a passo para ganhar o destino da retina, e auto-organizados em organoides de retina contendo NR e RPE laminados. Durante a diferenciação, os HPSCs recapitularam todos os principais passos do desenvolvimento da retina humana in vivo, desde EF, OV e RPE, até laminação da retina, gerando todos os subtipos de células da retina, incluindo células de gânglios da retina, células amacrinas, células bipolares, rod e fotorreceptores de cone, e células gliais muller em uma ordem espacial e temporal. A recapitulação do desenvolvimento da retina beneficiaria aplicações a jusante, como a modelagem da doença da retina.
Foram estabelecidos alguns protocolos para gerar organoides de retina dos hPSCs3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 . De acordo com as condições culturais, os protocolos podem ser classificados em 2D, 3D, e a combinação de abordagens 2D e 3D9,13. O 2D se aproxima6,10,22 significa que todo o processo de indução ocorre nas condições de cultura aderentes, gerando células da retina sem arquitetura a partir de hPSCs. Em contraste, o 3D se aproxima7,11,23 médias de que todo o processo de indução está sob as condições de cultura de suspensão, produzindo tecidos de retina organizados. Por exemplo, Sasai, Y. et al.7,24 relataram um método SFEBq (cultura flutuante sem soro de agregados embrionários semelhantes ao corpo com re-agregação rápida) para orientar os ESCs a se diferenciarem em copos ópticos na cultura de suspensão. Utilizando as abordagens 3D multi-passos8,11,18,20,25 incluindo este protocolo, os hPSCs foram induzidos para destinos retinais e organoides sob condições de cultura de aderente e suspensão.
Para induzir hPSCs ao destino neural da retina, uma série de fatores exógenos foram adicionados à mídia em muitos protocolos. Por exemplo, Lamba, et al.26 adicionaram uma combinação de noggin (um inibidor da via BMP) e Dickkopf-1 (dkk1, um antagonista da via de sinalização Wnt/β-catenin) e fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) para direcionar ESCs para um destino neural anterior. Osakada et al.6 adicionaram DAPT (um inibidor de vias de sinalização notch) e fator de determinação esquerda-direita A (um inibidor de vias de sinalização WNT) para obter precursores de cauda e fotorreceptor de vara e cone. Kuwahara et al.27 e Capowski et al.3 adicionaram BMP4 para exposição breve e precoce da cultura dos HPSCs para melhorar a produção de OV. Em contrapartida, este protocolo otimizado de indução de retina é simples e de baixo custo sem exigir moduladores de sinalização extrínseca, exceto o suplemento básico de N2 e B27.
O ácido retinóico (RA) desempenha um papel importante no desenvolvimento da retina e na determinação do fotoreceptor28,29,30. A maioria dos protocolos foi desenvolvida com o suplemento de RA (0,5-1 μM) em determinados períodos. Nossos estudos demonstraram que a concentração muito alta de RA ou período muito longo de tratamento de RA resultam em fotorreceptores ricos em varas, mas inibem a diferenciação do cone8,18. No entanto, neste protocolo otimizado, a RA não se soma aos meios de cultura durante todo o processo de diferenciação18,promovendo a produção de fotorreceptores de cone, que é responsável pela visão diária humana e visão colorida e necessária para substituição celular do tratamento RD. Embora alguns estudos revelem que a sinalização hormonal da tireoide direciona subtipos de cone em camundongos e retina humana31,32, o regulador do comprometimento do cone ainda não está claro33. Nestes estudos de Kim et al.34 e Lowe et al.35, a cultura de longo prazo também sem qualquer ácido retinóico exógeno gerou organoides retinais ricos em cone, o que é consistente com este protocolo otimizado.
Os pontos-chave deste protocolo a serem compreendidos são fazer EBs de alta qualidade e seear em apropriadamente EBs. As células crescem rapidamente durante a cultura de suspensão do EB precoce. O meio deve ser trocado todos os dias e ser suficiente para fornecer nutrição abundante. O tamanho dos EBs, com aproximadamente 200 μm de diâmetro, é apropriado para a diferenciação da retina. A densidade de revestimento de EBs a 2-3 EBs por cm2 é adequada para a maioria das linhas hPSC. A melhor vantagem deste protocolo otimizado é a quantificação do tamanho do EB e densidade de revestimento para aumentar significativamente a eficiência e a repetibilidade da indução da retina. Descrevemos claramente todos os passos em detalhes, o que ajuda em grande parte os pesquisadores inexperientes a aprender e repetir a indução da retina.
Além disso, a eficiência da indução da retina depende em grande parte da qualidade e da potência de diferenciação dos hPSCs36,37. Diferentes hPSCs têm diferentes eficiências. Algumas linhas hPSC realmente têm baixa eficiência, o que pode ser devido aos métodos de reprogramação, células somáticas, e assim por diante. Este protocolo foi confirmado adequado para vários hPSCs para obter organoides de retina 3D e o RPE, incluindo vários hESCs e hiPSCs reprogramados de fibroblastos, sangue e células de urina18,20,21. Em geral, com este protocolo descrito acima, um poço de hPSCs (cerca de 80% de confluência) em uma placa de 6 poços pode gerar cerca de 1.000 EBs, produzindo cerca de 200 ROs. Portanto, este protocolo com alta eficiência é adequado para a produção em larga escala de organoides de retina e beneficia aplicações a jusante, incluindo estudo básico e translacional.
Em resumo, o protocolo otimizado de indução da retina é simples e de baixo custo com alta repetibilidade e eficiência, oferece modelos personalizados promissores de doenças da retina e fornece fonte celular abundante para terapia celular, triagem de medicamentos e teste de terapia genética.
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Disclosures
Xiufeng Zhong é o inventor de patentes relacionado à geração de células retinais a partir de células-tronco pluripotentes humanas.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo National Key P&D Program of China (2016YFC1010103, 2017YFA0104101), o Fundo de Projetos de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (201803010078), o Projeto de Ciência & Tecnologia da Província de Guangdong (2017B020230003), a Natural Science Foundation (NSF) da China (81570874, 81970842), Cem programas de talentos da Universidade Sun Yat-sen (PT1001010) e os Fundos De Pesquisa Fundamental do Laboratório Estadual de Oftalmologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
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