Summary
我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。
Abstract
原発性繊毛(PC)は、ほとんどの哺乳動物細胞の表面から突出する非運動性の動的微小管ベースの細胞小器官である。それらは、細胞周期のG1/G0期に古いセントリオールから出現するが、細胞がG2/M期境界で細胞周期に再び入るにつれて分解する。それらは、多くの細胞プロセスに不可欠な細胞外シグナルを検出して伝達することによって、シグナルハブとして機能します。ほとんどの細胞型と同様に、すべての新皮質神経幹および前駆細胞(NSPC)は、正常な脳皮質の発達に必要な特定のシグナルを感知および伝達することを可能にするPCを保有していることが示されている。ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)から2次元(2D)および3次元(3D)細胞ベースのモデルを生成して特徴付け、新皮質発生中のPCの関与をさらに解剖するための詳細なプロトコルを提供します。特に、ソニックヘッジホッグ(SHH)経路の形質導入を含む2D神経ロゼット由来NSPCにおけるPCの生合成と機能を研究するためのプロトコルを提示する。脳オルガノイドの三次元(3D)組織を利用するために、我々は、 ヒトト 免疫染色された大脳オルガノイドの3Dイメージングのための簡単な方法を説明する。光学的クリアリングの後、オルガノイド全体の迅速な取得は、オルガノイド全体の新皮質前駆細胞およびニューロン上のセントロソームおよびPCの両方の検出を可能にする。最後に、かなりの程度の3D空間情報を保持し、PCの生合成と機能の詳細な定性的および定量的分析に必要な高解像度取得を可能にする、厚い自由浮遊オルガノイド切片の免疫染色および除去の手順を詳述します。
Introduction
原発性繊毛(PC)は微小管ベースの細胞小器官であり、細胞外環境からの多数の化学的および機械的手がかりを感知し、伝達する。特に、PCは脊椎動物におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の形質導入のための中心的な細胞小器官である1,2。ほとんどの神経細胞がPCを保有することが長い間示されてきましたが、中枢神経系の形成におけるこのオルガネラの貢献は長い間過小評価されてきました。新皮質の発達に関する研究は、複数の神経幹および前駆細胞(NSPC)の発見につながり、そのすべてがPCを保有しており、その場所は前駆者の運命決定に不可欠であることが提案されている3,4,5,6,7。PCは、NSPCの拡張とコミットメント8,9,10,11,12、ならびにニューロンの遊走をサポートする放射状グリア足場のアピコ基底極性を含む、正常な脳皮質の発達に必要な細胞メカニズムにとって重要であることが示されています13。加えて、PCは皮質プレートへの接線移動の間に介在ニューロン14、15必要とされる。最後に、大脳皮質におけるニューロンのシナプス結合の確立におけるPCの役割が提案されている16,17。全体として、これらの知見は、脳皮質発達の主要な段階におけるPCの重要な役割を主張し18,19、脳皮質発達の異常の根底にある病理学的メカニズムへのPCの関与を調査する必要性を提起する。
最近の研究は、ヒトモデルと動物モデルにおける皮質発生の間の重要な細胞および分子の違いについての理解を大幅に改善し、ヒトモデルシステムを開発する必要性を強調している。この見解では、ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)は、関連する遺伝的および細胞的文脈における疾患病因を研究するための有望なアプローチを表す。付着した2次元(2D)細胞ベースのモデルまたは神経ロゼットは、発達中の大脳皮質に見られるものと同様のNSPCを含み、正しいアピコ基底極性を示すロゼット状の構造に組織化される20,21,22。さらに、三次元(3D)培養システムは、ヒト脳皮質発達の多くの特徴を再現する背側前脳オルガノイドの生成を可能にする23、24、25、26。これら2つの相補的な細胞ベースのモデリングアプローチは、大脳皮質の正常および病理学的発達中のPCの関与を解剖するためのエキサイティングな視点を提供する。
ここでは、神経ロゼットおよび由来NSPCならびに背側前脳オルガノイドの生成および特性評価のための詳細なプロトコルを提供する。また、ソニックヘッジホッグ経路の形質導入を試験し、この経路に関与する重要な分子のダイナミクスを分析することにより、NSPCに存在するPCの生合成と機能を解析するための詳細なプロトコルも提供しています。また、大脳オルガノイドの3D組織を活用するため、 in toto 免疫染色された大脳オルガノイドの3Dイメージングのための簡単で費用対効果の高い方法を設定し、オルガノイド全体の高分解能で、ライトシート顕微鏡により、オルガノイド全体のあらゆる種類の新皮質前駆細胞およびニューロン上のPCを視覚化することができます。最後に、150μmの自由浮遊切片に免疫組織化学を適応させ、その後、共鳴走査型共焦点顕微鏡を用いた透明化と取得により、PCの生合成と機能の詳細な解析に必要な高解像度の画像取得を可能にしました。具体的には、3Dイメージングソフトウェアは、PCの長さ、数、向きなどの形態学的パラメータのその後の分析、ならびに軸索に沿った毛様体成分の信号強度測定によるPCの3D再構成を可能にする。
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Protocol
1. 新皮質発生の2D hIPS細胞ベースのモデルの生成
- 神経ロゼット形成
- 大きな規則的なコロニーを保有するhIPSC培養物から始めて、10%未満の分化を示し、80%以下のコンフルエントを示す。
- hIPSCを2mLのPBSですすいでください。
- Rock阻害剤を添加した2 mLのNSPC誘導培地(NIM+10 μMのY-27632)を加える。
- 針を使用して1つの35mm皿から各hIPSCコロニーを手動で解剖し、各コロニーを水平方向および垂直方向に正確に切断し、各コロニーを等しいクラスターに分割するチェッカーボードパターンを作成する。
- セルスクレーパーを使用してコロニーを切り離し、超低付着35mmディッシュに移す。
- 37°Cと5%CO2の加湿インキュベーターに一晩(ON)浮かべて、胚様体(EB)を形成できるようにします。
注: 胚様体 (EB) は、浮遊性回転楕円体クラスターまたは hIPSC の集合体として定義されます。 - EBをポリL-オルニチン/ラミニン(PO/lam)コーティングされた35 mmディッシュに2 mL NIM + 10 μMのY-27632で移します。
- NSPC誘導培地(Y−27632を含まないNIM)を神経ロゼットの形成まで毎日リフレッシュし、約12〜14日を要する。顕微鏡で確認してください。
注:このステップの後、神経ロゼットを拡張、分化、免疫染色分析のために処理するか、解離させて単離された神経幹および前駆細胞(NSPC)を得ることができます。
- 神経ロゼットの拡大と早期分化
- 神経ロゼットを針で格子状のパターンに切断し、細胞スクレーパーを使用してクラスターを外す。
- ロゼットを、0.5mLのNSPC維持培地(NMM)中のPO/lamコーティングガラスカバースリップ(4〜5ロゼット/ウェル)を含む4ウェルプレートに移す。
- プレートを37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内でインキュベートする。
- NMM は 20 日目まで 1 日おきに更新します。
- 20日目から、0.5mLのサイトカイン中の培養神経ロゼットはNMMを枯渇させ、分化を可能にした。2〜3日ごとに培地をリフレッシュする。
- 30日目および40日目(分化の10日目または20日目)に、0.5mLの4%PFA、20分、RTでロゼットを固定する。
- 単離されたNSPCのPC生合成と機能解析
-
NSPC解離
- ステップ1.1.8の神経ロゼットを針で格子状のパターンに切断し、セルスクレーパーを使用してクラスターをはがします。細胞を2 mLのNMM中のPO/lamコーティングされた35 mmディッシュに移し、37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内でインキュベートする。
- NMM は、コンフルエントになるまで 1 日おきに更新します (約 5 ~ 7 日)。
- 神経ロゼットを取り囲む大きくて透明な細胞を削り取った後、それらを手動で拾い上げ、新鮮なPO / lamコーティングされた35 mm皿に移して、NSPCを豊かにし、非神経細胞タイプを枯渇させる。
- すべての汚染細胞タイプを除去するために必要な1つまたは2つの手動継代(必要に応じてステップ1.3.1.3を繰り返す)の後、培地を取り出し、PBSですすいでください。
- 300 μLの0.05%トリプシンを加え、ほとんどの細胞が剥離するまで37°Cで5分間インキュベートする。
- 10%FBSを含む培地2mL(DMEM+10%FBS)を加えてトリプシンを不活性化した。細胞懸濁液を15mL円錐管に集める。細胞懸濁液を3回上下に軽くピペットでピペットし、細胞凝集塊を分解する。
- 300 x g で5分間遠心分離する。
- 上清を注意深く吸引し、細胞をNMNに再懸濁する。
- 解離したNSPCをNMM中の単一細胞(1 x 105細胞/cm2)としてPO/lamコーティングされたディッシュに播種し、37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内でインキュベートする。
- NMM の NSPC を展開するには、1 日おきに培地を変更します。
注:NSPCは、分化を避けるために高密度で播種される。
-
PC生合成解析
- 種子はNSPCを100,000細胞/ cm2で解離させ、37°Cの加湿インキュベーターでNMMで5%CO2で2日間インキュベートする。
- 培地および飢餓NSPCsをサイトカイン枯渇培地(NSPC飢餓培地、 補足表1)中で48時間吸引する。
- RT で 20 分間 4% PFA で NSPC を修正します。
- 免疫染色の前にPBSで5分間2回洗浄する。
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PC機能解析:SHHシグナル伝達経路
- 種子をPO/lamコーティングされた8ウェルチャンバースライド(300 μL)またはT25 ディッシュ(5mL)上で100,000細胞/ cm2でNSPCを解離させ、37°Cの加湿インキュベーター内でNMM中の5%CO2 で2日間インキュベートする。
- NSPCをNSPC飢餓培地(8ウェルチャンバースライドのウェルあたり300μL、T25フラスコに5mL)中で48時間飢えさせる。
- SHH経路を誘導するために、組換えSHH(100ng/mL)またはSAG(500nM)を添加した飢餓培地でNSPCをインキュベートする。(8ウェルチャンバースライドのウェルあたり150 μL、T25フラスコに2 mL)を24時間保存した。
- 8ウェルチャンバースライドで培養したNSPCを、1ウェルあたり4%PFAの250 μLでRTで20分間固定し、免疫染色分析の前に250 μLのPBSでRTで5分間2回洗浄します。
- 培地を取り出し、T25ディッシュで培養したNSPCsをPBSで洗浄した。
- 500 μLの0.05%トリプシンを加え、細胞が剥離するまで37°Cで5分間インキュベートする。
- 10%FBS(DMEM+10%FBS)を含む培地2mLを加えてトリプシンを不活性化し、細胞懸濁液を15mL円錐管に集めた。
- 300 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く吸引して、RNA抽出およびRT-PCR分析の前に-80°Cで凍結保存できるNSPCペレットを得た。
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NSPC解離
2. 背側前脳オルガノイドの生成
- hIPSCの単一細胞培養
- まず、分化率が10%未満で、ほぼ1回継代された大きな規則的なコロニーを保有するhIPSC培養物から始めます。セルが 80% 以下のコンフルエントであることを確認します。
- コロニーを2mLのPBSで洗浄する。
- 500 μL の Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) を加え、37 °C で 5 ~ 7 分間インキュベートします。
- GCDRを吸引し、5μMのY-27632を添加したmTeRS1培地を2mL加える。
- 細胞を10回穏やかに上下にピペットでピペットし、すべてのコロニーを単一細胞に解離させた。
- 細胞をビトロネクチンコーティングされたディッシュ上に移し、37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内でインキュベートする。
注: 分化実験の前に GCDR を使用して hIPSC を少なくとも 1 回継代し、hIPSC を単一細胞培養条件に適合させます。
- 0日目に、hIPSCが低濃度のFGF2およびhIPSCの生存に必要な高濃度の岩石阻害剤を含むEB培地中で胚体を形成できるようにする。これを行うには、次の手順に従います。
- コロニーを2mLのPBSで洗浄する。
- 500 μL の Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) を加え、37 °C で 5 ~ 7 分間インキュベートします。
- GCDRを吸引し、50μMのY-27632を添加したEB培地を1mL加える。1 mL ピペットを使用して細胞を静かに剥離し、15 mL の円錐形チューブに移します。
- 50 μMのY-27632を添加した2 mLのEB培地でもう一度すすぎ、残りの細胞を15 mLの円錐形チューブに移す。50 μMのY-27632を添加したEB培地3 mLを円錐管に直ちに加え、5 mLピペットを用いて溶液を穏やかにホモジナイズする。
- 解離した細胞を100 x g で5分間遠心分離する。
- 上清を穏やかに吸引し、50 μMのY-27632を添加した6 mLのEB培地に細胞を再懸濁する。
- 細胞を100 x g で5分間遠心分離する。
- 上清を吸引し、50 μMのY-27632を添加した1 mLのEB培地に細胞を再懸濁する。1 mL ピペットを使用して、細胞を単一細胞懸濁液に穏やかに解離させます。
- 細胞を再懸濁した直後に、それらを希釈してカウントする。
- 適切な量の細胞懸濁液(900,000個の細胞を含む)を、50μMのY-27632および4ng/mLのbFGFを添加した30mLのEB培地に希釈し、溶液を穏やかに混合する。
- 9,000細胞/ウェルを超低接着96Uプレート(300 μL/ウェル)にプレートします。EB形成を妨げないようにするには、プレートを37°Cの加湿インキュベーターで5%CO2 で3日目まで培地交換なしでインキュベートします。
- 神経誘導(二重SMAD阻害)
- 3日目に、EBが300〜400μmを測定し、規則的な境界線を表示するようにします。両方の基準に達した場合、培地の半分(150μL)を二重SMAD阻害剤を含む誘導培地-1と交換し、神経外胚葉分化を示す6日目から7日目までにEBの輪郭を明るくする(補足表2)。
- 4日目に、培地の3/4(225μL)を誘導培地-1と交換する。
- 6日目および8日目に:誘導培地-1の半分(150μL)をリフレッシュする。
- 基底膜マトリックスへのオルガノイド包埋(Day 10)
- 10日目に、EBsを成長因子減少基底膜マトリックス(BMM)に埋め込んだ。
注:このステップでは、ピペッティングを繰り返してオルガノイドの損傷を避けるために、常に滅菌ハサミを使用してピペットチップの開口部を切断してください。 - 最初に円錐形のチューブで約15-17個のオルガノイドを移す。EBを落ち着かせて、媒体を取り除きます。50 μLの誘導培地-2を加え、100 μLのBMMを含む微量遠心チューブに移す。
- マトリックス-EB混合物を超低アタッチメントプレートのウェルの中央に広げ、EBを分離して融合を防ぎます。
- BMMをインキュベーター内で37°Cで45分間固化させます。
- 各ウェルに3mLの誘導培地-2を加え、プレートを37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーターに入れた。
メモ: BMM が室温で固化するので、この手順をできるだけ早く実行してください。
- 10日目に、EBsを成長因子減少基底膜マトリックス(BMM)に埋め込んだ。
- 基底膜マトリックスに埋め込まれたオルガノイドの静置培養
- 12日目、14日目:リフレッシュ誘導培地-2。
- 16日目:誘導培地-2をリフレッシュし、神経上皮ループの拡大を顕微鏡下で確認する。
- 基底膜マトリックスの解離とオービタルシェーカーでの培養
- 17日目に、5mLピペットで上下に10回ピペッティングしてBMMからオルガノイドを解離させ、分化培地-1(ビタミンAなし)に移します。栄養吸収を改善するために、37°Cおよび5%CO2 の加湿インキュベーター内で80rpmでオービタルシェーカー上にインキュベートする。
注:固定培養には別のインキュベーターを使用し、オービタルシェーカー上で培養して、付着性hIPS細胞増殖に有害な振動を避けてください。 - 19日目:リフレッシュ分化培地-1。
- 21日目:分化培地-1を分化培地-2(ビタミンAを使用)に変更する。
- 23日目から35日目まで:2~3日ごとに分化培地-2で培地をリフレッシュする。
- 35日目から70日目まで:1%BMMで分化ミディアム2をリフレッシュし、2〜3日ごとにリフレッシュします。
- 分化の28、42、および70 +/- 2日後にオルガノイドを収集し、15 mL円錐管上の5 mL 4%PFA中で、4°Cで一晩固定する。
- さらに イントト またはフリーフローティング免疫染色分析のために、オルガノイドをPBS中で2回すすぎ、PBS+0.05%アジ化ナトリウム中で4°Cで保存する。
- 凍結切片の免疫染色分析のために、4%PFA固定オルガノイドを+4°Cオンで(またはオルガノイドが沈むまで)10mLおよび30%スクロースに浸漬する。凍結包埋マトリックスに埋め込み、凍結切除するまで-80°Cで保存します。
- 17日目に、5mLピペットで上下に10回ピペッティングしてBMMからオルガノイドを解離させ、分化培地-1(ビタミンAなし)に移します。栄養吸収を改善するために、37°Cおよび5%CO2 の加湿インキュベーター内で80rpmでオービタルシェーカー上にインキュベートする。
3. 背側前脳オルガノイドの toto 免疫標識、クリアリング、ライトシート取得
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固定
- オルガノイドを6ウェルプレートに集め、培地を除去し、2mLの4%PFAで4°Cで一晩固定した。
- 室温で2mLのPBS中で3回の洗浄を行う。
- オルガノイドを2 mLチューブに移し、2 mLのPBS+0.05%アジ化ナトリウム中で4°Cで保存する。
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透過処理
- オルガノイドを0.2%Triton X100を含むPBS1mL中でRTで1時間インキュベートする。これを 2 回実行します。
- 0.2% Triton X100および20% DMSOを含む1 mLのPBS中で、37°Cで一晩インキュベートする。
- 0.1% Tween20、0.1% Triton X100、0.1% デオキシコール酸、0.1% NP40 および 20% DMSO を含む PBS 1 mL 中、37°Cで一晩インキュベートします。
- 0.2%Triton-X100を含む1mLのPBS中で、RTで1時間インキュベートする。これを 2 回実行します。
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ブロッキングと免疫標識
- 1 mLのブロッキング溶液(PBS、0.2%トリトンX100、6%ロバセラム、10%DMSO)を37°Cでブロックし、オンにします。
- 250 μL の PBS、0.2% Tween20、0.1 μg/mL のヘパリン、5% DMSO および 3% ロバ血清で希釈した一次抗体と共に、37°Cで 2 日間インキュベートします。
- 0.2% Tween20 および 0.1 μg/mL のヘパリンを含む PBS 1 mL で 37 °Cで 1 時間洗浄します。 これを 4 回実行します。
- 0.2% Tween20 および 0.1 μg/mL のヘパリンを含む PBS 1 mL で、37 °C で一晩洗浄します。
- 0.2% Tween 20、0.1 μg/mL のヘパリンおよび 3% ロバ血清を含む PBS 250 μL で希釈した二次抗体と共に、37°Cで 2 日間インキュベートします。
- 0.2% Tween 20 および 0.1 μg/mL のヘパリンを含む PBS 1 mL で、ホイール上で RT で 1 時間洗浄します。これを 4 回実行します。
- 0.2% Tween 20 および 0.1 μg/mL のヘパリンを含む PBS 1 mL で、一晩、ホイール上で RT で洗浄します。
- 1 mL の PBS で RT で 24 時間洗浄します。
- 透明になるまで1mLのPBSおよび0.05%アジ化ナトリウム中で+4°Cでストックする。
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TDEでのクリアリング(2,2'-チオジエタノール)
- オルガノイドを1mLの30%TDE(3mLのTDE+7mLのPBS)中でRTで24時間インキュベートする。
- 1 mL の 60% TDE (6 mL の TDE + 4 mL の PBS) を RT で 24 時間インキュベートします。
- 1 mL の 80% TDE (8 mL の TDE + 2 mL の PBS) を RT で 24 時間インキュベートします。
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ライトシート取得前のオルガノイド埋め込み
メモ: カスタムメイドのシステムを使用してください。メスで先端を切った1mLの注射器で作られました。- 60%TDE溶液中に100mLの4%低融点アガロースを調製し、2mLチューブにアリコートを調製する。+4°Cで保存します。
- オルガノイド包埋の前に、60%TDE中の4%低融点アガロース1.5mLを含む1本のチューブを、液化するまで37°Cの水浴中で予熱する。
- 一方、メスを用いて切り落とされた1mLシリンジからなるカスタムメイドの成形システムを用意する。
- プランジャーを使用してゲル溶液600μLをシリンジにポンプで送る。
- 滅菌ハサミを用いて切断された開口部を拡大したピペットチップを用いて試料を位置決めする。
- サンプルがシリンジの下3分の1以内に配置されるように、400μLのゲル溶液をシリンジに充填する。
- ゲルを重合させ、取得まで光から保護した4°Cの80%TDE溶液に保存します。
- ライトシートの取得には、サンプルチャンバーに添加された80%TDE溶液に20倍の対物レンズを浸漬して、クリアリング法の屈折率を正確に調整できるようにします。
- アガロース包埋オルガノイドを含むシリンジを、オルガノイドを対物レンズの前に配置するために操作できる1mLシリンジを収容するように設計された最大のサンプルホルダーに挿入する。
注:オルガノイド全体のライトシート取得には約5〜10分かかります。
4. 背部前脳オルガノイドの遊離浮遊部の免疫染色および透明化
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オルガノイドの固定、アガロースの埋め込み、および切片化
- 分化の28、42、および70 +/- 2日後にオルガノイドを6ウェルプレートに集め、2mLの4%PFA中で4°Cで一晩固定する。
- 2 mL の PBS で 2 回すすぎ、2 mL の PBS + 0.05% アジ化ナトリウムで 4 °C で保存します。
- 固定したオルガノイドをプラスチック埋め込み型(7 x 7 mm)の4%低融点アガロースに埋め込む。プラスチック金型からアガロースブロックを慎重に取り外し、ビブラートーム段階に接着します。
- ビブラトームを用いて包埋オルガノイドを切片化し、切片の損傷を避けるためにペイントブラシを用いて500μLのPBSを含む24ウェルプレートのウェルに移して150μmの自由浮遊切片を得た。
注:低融点アガロースは、その融解温度が約60°Cしかないため、推奨されます。 PBS溶液中に4%低融点アガロースを調製し、オルガノイド包埋前にウォーターバス中で37°Cのすぐ上に冷却したままにする。
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透過処理、ブロッキング、免疫染色
- 切片を0.3% Triton X100を含む500 μLのPBS中で、RTで、攪拌下で、20分間インキュベートする。これを3回行います。
- 切片を、0.3% Triton X100および5% 無脂乳を含む 500 μL の PBS に RT で、攪拌下、2 時間インキュベートします。
- 切片を250 μLの一次抗体溶液(PBS + 0.3% Triton X100 + 1% 無脂乳)中、攪拌下、+4°Cで一晩インキュベートする。
- 切片を500 μLのPBSでRTにて、攪拌下で20分間洗浄する。これを 4 回実行します。
- 切片を250 μLの二次抗体溶液(PBS + 0.3% Triton X100 + 1%無脂乳)中でRTで、攪拌下、2時間インキュベートする。
- 切片を500 μLのPBSでRTにて、攪拌下で20分間洗浄する。これを 4 回実行します。
- 切片を500 μLのPBSに入れ、透明になるまで+4°Cで保存します。
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TDEでのクリアリング(2,2'-チオジエタノール)
- 切片を 500 μL の 30% および 60% TDE でそれぞれ 1 時間インキュベートし、次いで RT で一晩 80% TDE の 500 μL でインキュベートします。
- クリアした切片を +4 °C で取得するまで 500 μL の 80% TDE に保存します。
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共振走査共焦点による取得前の自由浮遊セクションの取り付け
- 密閉チャンバにフリーフローティングセクションを取り付け、サンプルを80%TDE溶液に維持し、共焦点顕微鏡の電動XYステージに適応するように設計されています。
- チャンバーシステムに1つの丸いカバースリップを入れます。
- クリアした免疫染色部を絵筆で慎重に移します。
- チャンバーを80%TDE溶液で満たします。
- 2つの標準カバースリップに加えて、1つのセカンドラウンドカバースリップとシリコンシールを追加します。
- チャンバーのねじ込みリングをねじ込み、システムを完全に密閉します。
5. ライトシートと共鳴走査共焦点解析
- 免疫染色されたサンプル全体の3D可視化と分析を可能にするソフトウェアを使用して、光シートおよび共鳴スキャン取得を処理します。
注:このようなソフトウェアを使用すると、巨大なデータをすばやく開き、スナップショットやアニメーションを簡単に作成できます。これにより、サンプルを異なる向きで移動し、XYとYZなどの異なる向きの2Dスライサーツールのおかげで2Dビューを生成できます。 - セントロソームと原発性繊毛の両方を自動的に検出するには、スポットウィザードを使用して、病理学的状態と対照状態の両方でそれらの数を定量化できます。
- PCを3D再構成して長さを正確に測定するには、フィラメントウィザードを使用してPCの始点を手動で固定し、ソフトウェアは蛍光信号を使用してPCを正確に再構築します。
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Representative Results
一次繊毛の生合成と機能を研究するための2D hIPS細胞ベースのモデル
ここで詳述したプロトコールは、以前に発表された研究から適応されています20,21,22。このプロトコルは、発達中の新皮質に見られるものと同様の新皮質前駆細胞およびニューロンを含む神経ロゼット構造の生成を可能にする。詳細な検証は、特定のメーカーを用いた従来の免疫染色分析によって行うことができます3。例えば、頂端前駆細胞(AP)はSOX2およびPAX6で二重染色されるべきであり、中間前駆細胞(IP)はTBR2/EOMES染色によって明らかにされ、そして早期新皮質ニューロンはCTIP2染色によって明らかにされるべきである(図1A-C)。このような神経ロゼット様構造モデルは、有糸分裂核を染色するホスホビメンチンおよび有糸分裂紡錘体を染色するTPX2に対して惹起された抗体による免疫染色によって可視化することができるAPの動態間核移動(INM)である。したがって、これらのマーカーは、中央内腔の周りで頂端的に起こる細胞分裂を伴うINMを含むAPのいくつかの特性の分析を可能にし(図1D,D')、ならびに分裂平面と頂端表面との間の角度を測定することによって決定される分割モードを可能にする。最後に、繊毛形成は、PCの基底体を染色するPCNTおよび軸索を染色するARL13Bに対して惹起された抗体による免疫染色によって分析することができる。このようなロゼット構造上では、PCはAPの頂端から各心室様領域の中心内腔に延びており(図1E、E')、CTIP2+ニューロンからも突出している(図1E'')。
これらのロゼット構造の解離により、NMM中のポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティング培養プレート上で高密度に培養された単離されたNSPCを得ることが可能になり、核型異常を蓄積することなく、少なくとも15継代にわたってNSPCの安定で拡張可能な集団の維持が可能になる21,27。PCの生合成を解析するために、解離したNSPCを合流点まで培養し、48時間飢餓状態にする。PCマーカーに対して産生された抗体を用いた免疫染色分析は、これらのNSPCがPCを保有していることを示している(図2A)。PCセグメンテーション28に便利な機械学習ベースの画像解析ツールであるIlastikと、3D共焦点画像スタックからのPCの3D再構築を可能にするFiji/ImageJプラグインパッケージ29のCiliaQの2つの補完的なオープンソースツールを組み合わせることで、PCの数や長さなど、いくつかの構造パラメータを簡単に評価できます。
NSPCのPC機能は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の形質導入を試験することによっても評価することができる。SHHシグナル伝達経路の形質導入を評価するために、NSPCを48時間飢餓状態にし、組換えSHH(rSHH)または平滑化アゴニスト(SAG)で24時間処理する。GPR161、SMO、およびGLI2に対して産生された抗体を用いて、免疫蛍光(IF)分析により、GPR161は通常PCから出て、GLI2およびSMOはSHH経路活性化に応答してPC内に蓄積する(図2C-D)。CiliaQツールを用いた3D共焦点画像スタックの解析により、SHH経路活性化後のPCからのGPR161出口、ならびにPC内のGLI2およびSMO蓄積を定量化することができる(図2F-G)。さらに、rSHH-またはSAG処理NSPCから抽出されたmRNAに対する半定量的RT-PCR解析は、2つのSHH標的遺伝子GLI1およびPTCH1の誘導を示し、対照hIPSCに由来するNSPCにおける正常なSHHシグナル伝達伝達を証明している(図2B)。
全体として、後部前脳を発達させる2D細胞ベースのモデルは、正常な大脳皮質発達のいくつかの側面を明確に再現し、大脳皮質のヒト発達異常の原因となる遺伝子に変異を有する患者hIPSCに対する対照を用いて、新皮質発達の異常の根底にあるPC関連メカニズムを解剖するための有望なツールを表す。
新皮質発生中の一次繊毛の関与を研究するための3D hIPS細胞ベースのモデル
ここで説明するプロトコル(図3A)は、以前に公開されたプロトコル23,24,25,26,30から適合され、5つの異なる制御hIPSCラインで正常にテストされています。これにより、hIPSC由来の背側前脳オルガノイドの生成が可能になり、大きな神経上皮ループを形成しながら時間の経過とともにサイズが増加します(図3B)。オルガノイドクライオセクション(クライオスタット、20 μm)、自由浮遊セクション(ビブラトーム、150 μm)、またはtotoのいずれかで免疫標識分析を品質管理のために実行できます。28日目±2日目に、オルガノイドは、神経前駆細胞マーカーSOX2と背側前脳マーカーPAX6とを共発現する層状神経上皮ループからなり、背側前脳の同一性を証明している。42日目±2日目(分化の6週間)に、これらのループはより複雑な層別組織を表示するはずです。これらのループ構造の頂端から基底表面まで、SOX2/PAX6陽性の頂端橈骨グリア前駆細胞(aRG)を有する心室帯(VZ)様領域、ならびにTBR2陽性中間前駆細胞(IP)を有する心室下帯(SVZ)様領域およびCTIP2陽性の早期新皮質ニューロンを含む皮質板(CP)様領域を描くことができる(図3C、aRGの頂端分子極性は、ZO-1およびN-CADHの心室表面における頂端濃縮によって評価することができる(図4A、ビデオ1)。aRG前駆分裂特性は、TP2XおよびP-VIMマーカーを使用して評価し、皮質ループの心室表面におけるaRG有糸分裂核のアライメントに通常つながるINMを分析することができる(図4B、ビデオ2)。このような免疫標識はまた、aRGの対称対非対称分割様式を評価するための分割角度の測定を可能にする。P-Vim陽性前駆細胞はSVZ様領域でも観察することができ、外側の放射状グリアを連想させる基底表面に延びる独特の基底突起を保有する(oRGまたは基底放射状グリア、図4C、ビデオ2)。それらは42日目のオルガノイドからは存在しないが、SATB2陽性の後期生まれのニューロンは70日目(分化の10週間)から検出されるべきであり(図3D、F)、新皮質ニューロン分化のin vivo様のタイミングを証明している。
基底体(ガンマチューブリン)および軸索(ARL13B)マーカーを用いた免疫標識実験により、20μmの凍結切片上でPCを可視化することができます(図3G、H)。背側前脳オルガノイドの3D組織を利用するために、ホールマウント免疫染色を行うことができる。このようなトト免疫染色および透明オルガノイドの光シート取得は、すべてのNSPCタイプおよび新皮質ニューロン上のセントロソームおよびPCの両方の検出を可能にする(ビデオ3)。さらに、PC生合成のより正確な解析を行うために、背側前脳オルガノイドの自由に浮遊する厚い切片(150μm)について免疫組織化学分析を行ってもよい。クリア後、このような切片は、倒立共鳴白色光共焦点レーザー顕微鏡の40倍(NA 1.3)または63倍(NA 1.4)の油対物レンズを使用して取得することができ、オルガノイドの3D空間情報を維持しながら分解能を向上させることができる。このようなレーザー走査型共焦点顕微鏡は、干渉することなく正確で柔軟な励起と検出により、厚い断面の迅速な取得を可能にします(ビデオ4)。PCの数、長さ、向きなど、PCの構造パラメータを3Dイメージングソフトウェアを使用して評価できます。機械学習ベースの画像解析ツールであるIlastik28やFiji/ImageJ29のCiliaQプラグインパッケージなどのオープンソースの無料で利用可能な専用ツールは、自動PCセグメンテーションに非常に有用であり、その後のPC生合成と機能の定性的および定量的分析を可能にします制御対病理学的状態。
図1:2D神経ロゼットの生成と特性評価。 (A)SOX2およびPAX6抗体を用いてAPを検出し、(B)TBR2/EOMESを用いてIPを明らかにし、(C)CTIP2を用いて早期新皮質ニューロンを染色する神経ロゼット構造の免疫組織化学的特徴付け。増殖するAPはホスホビメンチンおよびTPX2抗体で検出され、頂端表面(D,D ́)に位置する。PCは、PCNTおよびARL13B抗体による二重免疫染色によって明らかにされる。PC は各 AP から各ロゼットの中央内腔まで拡張され、IP および早産ニューロン(E,E',E'')でも検出されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:2Dニューラルロゼットに由来する単離されたNSPCは、機能的なPCを保有している。 2D神経ロゼットの解離は、ARL13BおよびPCNT免疫染色(A)によって明らかにされたように、48時間の飢餓後にPCを保有する単離されたNSPCを生じる。NSPCは、48時間の飢餓状態後の2つのSHH標的遺伝子GLI1およびPTCH1のRT−PCR定量およびその後の組換えSHH(rSHH)による24時間処理による経路の活性化によって明らかにされたように機能的なPCを保有しているGLI1および PTCH1発現データは、3連で実施し、ACTB発現データに正規化した。データは2−ΔΔCt法で分析され、SEM(マン・ホイットニー検定)±相対発現として提示された(B)。(D)または(C)rSHH治療の有無にかかわらず、SHHシグナル伝達経路の2つの重要なアクター、GLI2、およびGPR161のダイナミクスをテストするための飢餓NSPCのIF分析は、SHH経路の活性化後にそれぞれPCに蓄積または終了する。共焦点画像の解析のためにIlastikツールとCiliaQツールを組み合わせることにより、PC内のGPR161(F)およびGLI2(G)シグナル強度を+/-rSHH処理NSPCで比較した。データは箱ひげ図とひげ図にまとめられています(SEM±平均値)。p<0.0001(マン・ホイットニー検定)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:背側前脳オルガノイドの生成と特性評価。 (A)背側前脳オルガノイドを生成するためのプロトコルの概略概要。(b)分化の1日目、3日目、7日目、24日目、および42日目におけるオルガノイドの代表的な明視野画像。SOX2、TBR2、およびCTIP2抗体による免疫染色後の42日目(C)および70日目(D)におけるオルガノイドの20μm凍結切片の共焦点画像は、それぞれ、心室帯(VZ)、TBR2陽性IPを含む脳室下帯(SVZ)、およびCTIP2陽性の早期新生児新皮質ニューロンを含むプレプレート様領域(CP)を描写した。PAX6、CTIP2、およびSATB2抗体による免疫染色後の42日目(E)および70日目(F)におけるオルガノイドの20μm凍結切片の共焦点画像は、70日目におけるSATB2陽性後期生まれニューロンの出現を示す。ARL13BおよびPCNT抗体による免疫染色後の42日目のオルガノイドの20μm凍結切片の共焦点画像は、CTIP2陽性ニューロン(H)にも存在するが、放射状グリア前駆細胞(G)の頂端にあるPCを明らかにした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)PAX6、N-CADH、およびCTIP2抗体で染色された背側前脳オルガノイド全体(Day 42)のライトシート取得は、APX6陽性放射状グリア前駆細胞が正しいアピコ基底極性を示す複数の神経上皮ループを示し、その頂端側におけるN-カドヘリンの蓄積およびプレプレート様領域を描写するCTIP2陽性の早期新皮質ニューロンによって明らかになった。(B)心室橈骨グリア前駆細胞の動態間核移動を示すTPX2、P-Vim、およびCTIP2抗体で染色された背側前脳オルガノイド全体(Day 42)のライトシート取得。(C)TPX2およびP-Vim抗体で染色された背側前脳オルガノイド全体(Day 42)のライトシート取得を拡大し、外側の放射状グリア前駆細胞を連想させる独特の基底プロセスを延長し、脳室下帯に局在する前駆者を示す。(d)NSPCおよび新皮質ニューロン中のPCを示すPCNTおよびARL13B抗体で染色された背側前脳オルガノイドの150μm切片(Day 42)の共鳴スキャナー取得。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:脳皮質異常の病態生理学へのPCの関与を解剖するための背側前脳発達の2Dおよび3D hIPS細胞ベースのモデルの生成および特徴付け。 hIPS細胞 は、低接着培養プレートに胚様体(EB)を形成させ、次いで二重SMAD阻害剤を含む誘導培地にインキュベートして神経外胚葉分化を誘導する。PO/lamコーティングされた皿へのEBの接着は、2D神経ロゼット構造の生成を可能にし、EBの遊離浮遊培養は、その後のBMMへの埋め込みにより、背側前脳オルガノイドの生成を可能にする。付着性ニューラルロゼット培地からの有糸分裂促進因子の離脱は、IF分析によって試験することができる神経新生の発症を促進する。付着性神経ロゼットの解離は、PC生合成および機能解析に有用な単離されたNSPC培養物の生成を可能にする。背側前脳オルガノイドは、分化の4、6、または10週間後に収集され、その後の免疫染色分析のために、 toto、厚さ150μmの切片、または20μmの凍結切片のいずれかで固定されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:PAX6、CTIP2、およびNCADH抗体で免疫染色された背側前脳オルガノイド全体のライトシート取得(Day 42)。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:TPX2、P-VIM、およびCTIP2抗体で免疫染色された背側前脳オルガノイド全体(Day 42)のライトシート取得。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ3:PCNTおよびARL13B抗体で免疫染色された背側前脳オルガノイド全体のライトシート取得(Day 42)。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ4:ARL13BおよびPCNT抗体で免疫染色した背側前脳オルガノイドの150μm切片(Day 42)の共鳴走査共焦点取得。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル:ここをクリックしてテーブルをダウンロードしてください。
補足表1:2D神経ロゼットおよびNSPCの生成に使用される媒体のレシピ。
補足表2:背側前脳オルガノイドの生成に使用される媒体のレシピ。
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Discussion
PCは現在、NSPCの拡大とコミットメント8,9,10,11,12、ならびにニューロン移動13,14およびシナプト形成16,17を含む、正常な脳皮質発達中の重要なステップを調節する重要な細胞小器官と見なされています16,17。.動物モデルまたはヒト胎児大脳組織における分析に加えて、新皮質発達の非常に革新的で関連性の高い患者由来のhIPSCベースのモデルの生成は、正常および病理学的脳皮質発達の両方におけるPCの役割を解剖するために不可欠である。
ここで詳述した2D hIPSCベースのモデリングプロトコルは、3つの主要な出版物20,21,22から適応されました。神経上皮分化は、アクチビン/結節(SB-431542)およびBMP(LDN-193189)経路の小分子阻害剤を用いた二重SMAD阻害によって誘導される22。細胞は、分化の20日後にNSPCsおよび新皮質深層ニューロンを含むロゼット状の構造に組織化される。さらに、これらのロゼット様構造は、正しいアピコ基底極性、頂端前駆細胞の運動学的核移動、ならびにすべてのNSPCおよびニューロンから伸びるPCを示す。これらのロゼット構造が解離した後、皮質前駆細胞の均質で安定した集団が得られる21。合流点まで培養し、48時間飢えさせると、これらの皮質の祖先は、フィジー/ ImageJのIlastik28とCiliaQ28,29プラグインパッケージを組み合わせることで、形態、数、長さを簡単に分析できるPCを保有します。さらに、サイトカインを使用してSHHシグナル伝達経路を誘導することにより、IFは、GLI2、SMO、およびGPR161などのPCに沿った重要なシグナル伝達経路アクターのダイナミクスをテストするために、PC機能を使用することもできる。さらに、半定量的RT-PCRアッセイは、SHH経路活性化に応答したGLI1およびPTCH1を含むSHH標的遺伝子発現の誘導の試験を可能にする。PCの機能に依存する他のシグナル伝達経路も、WNTおよびIGF経路を含む試験されるべきである2,32,33。正常な大脳皮質発達のいくつかの側面を明確に再現するこの2Dモデリングアプローチを結論付けるために、それは正常対病理学的状態におけるPCの生合成および機能をテストするための有用で関連性の高いツールを表し、新皮質発達中のPCの関与に関するさらなる洞察を得ることに貢献するはずである。
2D hIPSCベースのモデリングアプローチを補完する背側前脳オルガノイドは、早期発達期のヒト大脳皮質の多くの特徴および特徴を再現するため、インビトロで正常および病理学的脳発達を調査する前例のない機会を提供する。現在、プロトコルの2つの主要なタイプが使用されています:組み込みメソッドとガイド付きメソッド。Lancasterら23によって開発された本質的なプロトコルは、最小限の外的要因で自己組織化するIPSCの固有の能力に依存しており、異なる脳領域の基礎を含む脳オルガノイドを生じさせ、異なる脳領域間の相互作用をモデル化するユニークな機会を提供する。しかし、このようなモデリング戦略に内在する高い変動性と異質性は、再現性という大きな課題を提示します。誘導型オルガノイド分化プロトコルは、最小限の異質性で脳領域特異的オルガノイドの生成を可能にする24,25,26。このアプローチにより、初期のヒト脳皮質発達の主要なプロセスを反復する心室様構造を有する背部前脳オルガノイドを首尾よく生成することができました。第1の重要な課題は、分化率が10%未満の大きな規則的なコロニーを保有し、hIPCを単一細胞培養条件に適応させるために単層としてほぼ1回継代された高品質のhIPSC培養から始めることである。実際、この分野における主要な課題の1つであるオルガノイドの不均一性を制限するために、均質なサイズのEBの形成は、hIPSCコロニーを単一細胞懸濁液に解離させる必要性を示唆する前提条件であり、定義された細胞密度での播種を可能にする。もう1つの重要なステップは、3D構造と神経上皮拡張をサポートするために必要なEBのBMMインクルージョンです。我々は、たとえそれが追加のステップ、BMM解離を伴うとしても、個々の包含よりも約15個のオルガノイドの群包含を好んだ。振とう培養前のBMM解離は、オルガノイドバッチ内およびオルガノイドバッチ間の変動性を低減することが示されており、その結果、再現性が向上します34。さらに、BMMに広がる細胞プロセスを取り除くことができますが、これは以下の分化ステップでは有害ではありませんが、手順の後続のステップで品質検査のためにオルガノイドを観察することを困難にします。栄養吸収と酸素交換を改善するために、我々はオービタルシェーカーとスピニングバイオリアクターでのオルガノイド成熟を比較し、同様の結果をもたらした。したがって、オービタルシェーカーオプションは、中程度の体積、したがって実験の総コストを大幅に削減できるため、選択しました。重要なことに、オービタルシェーカーでの固定培養および振とう培養には別のインキュベーターを使用して、付着性hIPSC増殖に有害な振動を避けることです。このプロトコルを5つの異なる制御hIPSCライン35に適用することに成功し、この手順の堅牢性を保証する均質な結果を生み出しました。
このようなオルガノイドの特性評価は、いくつかの方法を用いて達成することができる。オルガノイド内の3D空間情報を保持するために、我々は、その後のライトシート取得によるオルガノイド全体のホールマウント免疫染色および除去を可能にするプロトコルを設定した。サンプルの起源と厚さに応じて、異なる透明化方法が効率で登場しています36,37。ここでは、マウスの脳や腸のオルガノイドをクリアするために以前に使用されていたグリコール誘導体であるTDE(2,2'-チオジエタノール)に依存する、シンプルで高速で費用対効果の高いクリアリング方法を確立しました38,39。免疫染色および透明化されたオルガノイドの取得は、80%TDEに浸漬した20倍の対物レンズを用いてライトシート顕微鏡上で行った。他の3Dイメージング取得方法と比較して、光シート顕微鏡は、いくつかの理由で興味深いものです:高速取得、良好な浸透、およびフォトブリーチングの減少。透過処理ステップの最適化により、効率的で均質な抗体浸透に到達し、オルガノイド全体のすべての前駆細胞およびニューロン細胞型から延びるPCの基礎体および軸索を視覚化することができます。さらに、40倍(NA 1.3)または63倍(NA 1.4)のオイル対物レンズを備えた倒立共鳴走査型共焦点顕微鏡を使用して、厚さ150μmの自由に浮遊する断面を取得することで、解像度をさらに高めることができ、かなりの程度の3D空間情報を保持し、PCの生合成と機能の定性的および定量的分析を可能にします。
このような2Dおよび3D細胞ベースのモデルと、繊毛症患者細胞のリプログラミングまたはCRISPR/CAS9技術を使用してセントロソームまたは毛様体遺伝子を特異的に編集することによって生成されたhIPSC上の3Dイメージング解析(図5)を組み合わせることで、大脳皮質の正常および病理学的発達中のPCの寄与の理解において著しい進歩が可能になるはずである。重要なことに、ゲノム編集技術はまた、疾患メカニズムの検出に挑戦する遺伝的異質性を克服するために、患者の突然変異を特異的に救助して同種制御hIPSCを得ることを可能にする。さらに、単一細胞ゲノムアプローチは現在、この分野全体で広く使用されており、免疫染色分析に対する適切で補完的なアプローチを表しています。したがって、すべての新興技術に内在し、広範囲に対処されているいくつかの制限と困難にもかかわらず、このような2Dおよび3D hIPSCベースのモデルおよびここで提示した特性評価方法は、人間の発達的新皮質異常の根底にある病理学的メカニズムへのPCの関与を解剖するための強力で関連性の高いツールを提供する。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、Agence Nationale de la Recherche(ANR)からS.T.(ANR-17-CE16-0003-01)およびN..B.B.(ANR-16-CE16-0011およびANR-19-CE16-0002-01)への助成金によって支援されました。LBは、Investissements d'avenirプログラム(ANR-10-IAHU-01)とFondation Bettencourt Schueller(MD-PhDプログラム)の下でANRによってサポートされています。イマジン・インスティテュートは、Investissements d'avenirプログラム(ANR-10-IAHU-01、CrossLabプロジェクト)の下で、また第2次Investissements d'Avenirプログラム(ANR-17-RHUS-0002)の一環として、ANRからの国家資金によって支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
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