Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

2D og 3D Human induserte Pluripotente stamcellebaserte modeller for å dissekere primær ciliuminvolvering under neokortisk utvikling

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer detaljerte protokoller for generering og karakterisering av 2D og 3D human indusert pluripotent stamcelle (hIPSC)-baserte modeller for neokortisk utvikling samt komplementære metoder som muliggjør kvalitativ og kvantitativ analyse av primær cilium (PC) biogenese og funksjon.

Abstract

Primær cilia (PC) er ikke-motile dynamiske mikrotubulebaserte organeller som stikker ut fra overflaten av de fleste pattedyrceller. De kommer ut av den eldre sentriolen under G1/G0-fasen av cellesyklusen, mens de demonteres når cellene går inn i cellesyklusen ved G2/M-fasegrensen igjen. De fungerer som signalhuber, ved å oppdage og transdusere ekstracellulære signaler som er avgjørende for mange celleprosesser. I likhet med de fleste celletyper har alle neokortiske nevrale stamme- og stamceller (NSPCer) vist seg å ha en PC som gjør at de kan føle og transdusere spesifikke signaler som kreves for den normale cerebral kortikale utviklingen. Her tilbyr vi detaljerte protokoller for å generere og karakterisere todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) cellebaserte modeller fra menneskeskapte pluripotente stamceller (hIPSCer) for å ytterligere dissekere involvering av PC under neokortisk utvikling. Spesielt presenterer vi protokoller for å studere PC-biogenesen og funksjonen i 2D nevrale rosett-avledede NSPCer, inkludert transduksjon av Sonic Hedgehog (SHH) -banen. For å dra nytte av den tredimensjonale (3D) organiseringen av cerebral organoider, beskriver vi en enkel metode for 3D-avbildning av i toto immunosterte cerebral organoider. Etter optisk rydding tillater rask oppkjøp av hele organoider påvisning av både sentrosomer og PC på neokortiske forfedre og nevroner i hele organoiden. Til slutt beskriver vi prosedyren for immunstaining og rydding av tykke frittflytende organoide seksjoner som bevarer en betydelig grad av 3D-romlig informasjon og tillater høyoppløselig oppkjøp som kreves for detaljert kvalitativ og kvantitativ analyse av PC-biogenese og funksjon.

Introduction

Primær cilia (PC) er mikrotubule-baserte organeller som sanser og transduserer en mengde kjemiske og mekaniske signaler fra det ekstracellulære miljøet. Spesielt er PC den sentrale organellen for transduksjon av Hedgehog-signalveien i vertebrater1,2. Mens de fleste nevrale celler lenge har blitt vist å huse en PC, har bidraget fra denne organellen i å forme sentralnervesystemet lenge vært undervurdert. Studier på neokortisk utvikling har ført til oppdagelsen av flere nevrale stamme- og stamceller (NSPCer), som alle har en PC, hvorav plasseringen er foreslått å være avgjørende for forfederens skjebnebestemmelse3,4,5,6,7. PC har vist seg avgjørende for cellemekanismer som kreves for normal cerebral kortikale utvikling, inkludert NSPC-utvidelse og engasjement8,9,10,11,12 samt apicobasal polaritet av radial glial stillas som støtter nevronal migrasjon13. I tillegg kreves PC under interneurons tangentielle migrasjon til kortikale plate14,15. Til slutt har det blitt foreslått en rolle for PCen i etableringen av synaptiske forbindelser av nevroner i hjernebarken16,17. Til sammen argumenterer disse funnene for en avgjørende rolle for PC på store trinn i cerebral kortikale utvikling18,19 og øker behovet for å undersøke deres engasjement i de patologiske mekanismene som ligger til grunn for anomalier av cerebral kortikale utvikling.

Nyere studier har i stor grad forbedret vår forståelse av viktige cellulære og molekylære forskjeller mellom kortikale utvikling i menneskelige og dyremodeller, med vekt på behovet for å utvikle menneskelige modellsystemer. I dette synet representerer menneskeskapte pluripotente stamceller (hIPSCer) en lovende tilnærming til å studere sykdomspatogenese i en relevant genetisk og cellulær kontekst. Tilhenger todimensjonale (2D) cellebaserte modeller eller nevrale rosetter inneholder NSPCer som ligner de som er sett i den utviklende hjernebarken, som blir organisert i rosettformede strukturer som viser riktig apicobasal polaritet20,21,22. Videre tillater det tredimensjonale (3D) kultursystemet generering av dorsale forebrain organoider som rekapitulerer mange trekk ved menneskelig cerebral kortikale utvikling23,24,25,26. Disse to komplementære cellebaserte modelleringsmetodene gir spennende perspektiver for å dissekere involvering av PC under normal og patologisk utvikling av hjernebarken.

Her tilbyr vi detaljerte protokoller for generering og karakterisering av nevrale rosetter og avledede NSPCer samt dorsale forebrain organoider. Vi tilbyr også detaljerte protokoller for å analysere biogenesen og funksjonen til PC som er tilstede på NSPCer ved å teste transduksjonen av Sonic Hedgehog-banen og analysere dynamikken til viktige molekyler involvert i denne veien. For å dra nytte av 3D-organiseringen av cerebral organoider, setter vi også opp en enkel og kostnadseffektiv metode for 3D-avbildning av in toto immunosterte cerebral organoider som tillater rask oppkjøp, takket være et lysarkmikroskop, av hele organoiden, med høy oppløsning som gjør det mulig å visualisere PC på alle typer neokortiske forfedre og nevroner av hele organoidet. Til slutt tilpasset vi immunhiistokjemi på 150 μm frittflytende seksjoner med etterfølgende rydding og oppkjøp ved hjelp av resonansskanning konfektmikroskop som tillater høyoppløselig bildeanskaffelse, som kreves for detaljert analyse av PC-biogenese og funksjon. Spesielt tillater 3D-bildebehandlingsprogramvare 3D-rekonstruksjon av PC med etterfølgende analyse av morfologiske parametere, inkludert lengde, antall og orientering av PC, samt signalintensitetsmåling av ciliary komponenter langs axoneme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering av 2D hIPS cellebaserte modeller av neokortisk utvikling

  1. Nevral rosettdannelse
    1. Begynn med hIPSC-kulturer som huser store vanlige kolonier, som viser mindre enn 10% differensiering og ikke mer enn 80% samløp.
    2. Skyll hIPSCene med 2 ml PBS.
    3. Tilsett 2 ml NSPC induksjonsmedium supplert med berghemmeren (NIM + 10 μM Y-27632).
    4. Disseker hver hIPSC-koloni manuelt fra en 35 mm tallerken ved hjelp av en nål for å kutte hver koloni nøyaktig i horisontale og vertikale retninger for å skape et sjakkbrettmønster som deler hver koloni i like klynger.
    5. Løsne kolonien ved hjelp av en celleskraper og overfør dem til en ultra-lav-feste 35 mm tallerken.
    6. La dem flyte over natten (ON) i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2, slik at de kan danne embryoide legemer (EBs).
      MERK: Embryoide legemer (EBs) er definert som flytende sfæroidklynger eller aggregater av hIPSCer.
    7. Overfør EB-ene til poly-L-ornitin/laminin (PO/lam)-belagte 35 mm retter i 2 ml NIM + 10 μM Y-27632.
    8. Daglig oppdatering NSPC induksjon medium (NIM uten Y-27632) til dannelsen av nevrale rosetter som tar ca 12 til 14 dager. Sjekk under mikroskopet.
      MERK: Etter dette trinnet kan nevrale rosetter utvides, differensieres og behandles for immunopprettet analyse eller dissosiert for å få isolert nevral stamme og stamceller (NSPC).
  2. Neural rosett ekspansjon og tidlig differensiering
    1. Klipp nevrale rosetter i et rutenettlignende mønster med en nål og løsne klyngene ved hjelp av en celleskraper.
    2. Overfør rosettene til en 4-brønns plate som inneholder PO/lam-belagt glassdeksler (4-5 rosetter/brønn) i 0,5 ml NSPC-vedlikeholdsmedium (NMM).
    3. Inkuber platen i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
    4. Oppdater NMM annenhver dag frem til dag 20.
    5. Fra dag 20, kultur nevrale rosetter i 0,5 ml cytokin utarmet NMM for å tillate differensiering. Oppdater mediet hver 2-3 dager.
    6. På dag 30 og dag 40 (10 eller 20 dager med differensiering), fest rosettene med 0,5 ml 4% PFA, 20 min, RT.
  3. PC biogenese og funksjonsanalyse på isolerte NSPCer
    1. NSPC-dissosiasjon
      1. Klipp nevrale rosetter fra trinn 1.1.8 i et rutenettlignende mønster med en nål og løsne klyngene ved hjelp av en celleskraper. Overfør cellene til PO/lam-belagte 35 mm retter i 2 ml NMM og inkuber i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
      2. Oppdater NMM annenhver dag til samløpet (ca. 5-7 dager).
      3. Etter å ha skrapt bort de store, klare cellene rundt nevrale rosetter, velg dem manuelt og overfør dem til ferske PO / lam-belagte 35 mm retter for å berike for NSPCer og tømme ikke-nevrale celletyper.
      4. Etter en eller to manuelle passeringer (gjenta trinn 1.3.1.3 om nødvendig) som kreves for å fjerne alle forurensende celletyper, fjern mediet og skyll med PBS.
      5. Tilsett 300 μL 0,05% trypsin og inkuber i 5 min ved 37 °C til de fleste celler løsner.
      6. Tilsett 2 ml av mediet som inneholder 10% FBS (DMEM + 10% FBS) for å inaktivere trypsin. Samle celleopphenget i et 15 ml konisk rør. Rør celleopphenget forsiktig opp og ned tre ganger for å bryte opp celleklumper.
      7. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min.
      8. Aspirer forsiktig supernatanten og resuspender cellene i NMN.
      9. Frø de dissosierte NSPCene som enkeltceller (1 x 105 celler/cm2) i NMM på PO/lam-belagte retter og inkuber dem i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
      10. Utvid NSPCer i NMM ved å endre mediet annenhver dag.
        MERK: NSPCer er sådd med høy tetthet for å unngå differensiering.
    2. PC biogenesis analyse
      1. Frø dissosierte NSPCer ved 100 000 celler/cm2 og inkuberer dem i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i NMM i 2 dager.
      2. Aspirer medium og sult NSPCer i cytokin utarmet medium (NSPC sult medium, Supplemental Table 1) i 48 timer.
      3. Løs NSPCer med 4% PFA i 20 min på RT.
      4. Vask to ganger med PBS i 5 minutter ved RT før du immunserer.
    3. PC-funksjonsanalyse: SHH-signalvei
      1. Frø dissosierte NSPCer ved 100 000 celler/cm2 på PO/lam-belagte 8-brønns Chamber Slides (300 μL) eller T25 retter (5 ml) og inkuberer i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i NMM i 2 dager.
      2. Sult nspcs i NSPC sult medium (300 μL per brønn av 8-brønns kammer lysbilde og 5 ml i T25 kolbe) for 48 timer.
      3. For å indusere SHH-banen, inkuber NSPCene med sultmediet supplert med rekombinant SHH (100 ng/ml) eller SAG (500 nM); (150 μL per brønn av en 8-brønns kammersklie og 2 ml i T25-kolbe) i 24 timer.
      4. Fix NSPCs dyrket på 8-brønns kammer lysbilder i 250 μL av 4% PFA per brønn i 20 min ved RT og vask dem to ganger med 250 μL PBS i 5 min ved RT før immunstaining analyse.
      5. Fjern medium og vask NSPCer dyrket i T25-retter med PBS.
      6. Tilsett 500 μL 0,05% trypsin og inkuber i 5 min ved 37 °C til cellene løsner.
      7. Tilsett 2 ml medium som inneholder 10% FBS (DMEM + 10% FBS) for å inaktivere trypsin og samle cellefjæringen i et 15 ml konisk rør.
      8. Sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter og aspirerer forsiktig supernatanten for å oppnå NSPC-pellets som kan kryopreserveres ved -80 °C før RNA-ekstraksjon og RT-PCR-analyse.

2. Generering av dorsale forebrain organoider

  1. Encellet kultur av hIPSCer
    1. Begynn med hIPSC-kulturer som huser store vanlige kolonier som viser mindre enn 10% differensiering, og som har blitt passeret nesten en gang. Forsikre deg om at cellene ikke er mer enn 80% sammenfallende.
    2. Vask koloniene med 2 ml PBS.
    3. Tilsett 500 μL gentle cell dissosiasjonsreagens (GCDR) og inkuber i 5 til 7 min ved 37 °C.
    4. Aspirer GCDR og tilsett 2 ml mTeRS1 medium supplert med 5 μM Y-27632.
    5. Pipette cellene forsiktig opp og ned 10 ganger for å dissosiere alle kolonier i enkeltceller.
    6. Overfør cellene på vitronektinbelagte retter og inkuber i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
      MERK: Utfør minst 1 passasje av hIPSCene ved hjelp av GCDR før differensieringseksperimentet for å tilpasse hIPSCene til encellede kulturforhold.
  2. På dag 0, la hIPSC-er danne embryonale legemer i EB-medium som inneholder en lav konsentrasjon av FGF2 og en høy konsentrasjon av berghemmer som kreves for hIPSC-overlevelse. Følg trinnene nedenfor for å gjøre dette.
    1. Vask koloniene med 2 ml PBS.
    2. Tilsett 500 μL gentle cell dissosiasjonsreagens (GCDR) og inkuber i 5 til 7 min ved 37 °C.
    3. Aspirer GCDR og tilsett 1 ml EB-medium supplert med 50 μM Y-27632; Bruk en 1 ml pipette for å løsne cellene forsiktig og overføre dem til et 15 ml konisk rør.
    4. Skyll igjen med 2 ml EB-medium supplert med 50 μM Y-27632, overfør de resterende cellene til det koniske røret på 15 ml. Tilsett umiddelbart 3 ml EB-medium supplert med 50 μM Y-27632 til det koniske røret og homogeniser forsiktig løsningen ved hjelp av en 5 ml pipette.
    5. Sentrifuger de dissosierte cellene ved 100 x g i 5 min.
    6. Aspirer forsiktig supernatanten og resuspend cellene i 6 ml EB-medium supplert med 50 μM Y-27632.
    7. Sentrifuger cellene på 100 x g i 5 min.
    8. Aspirer de supernatante og resuspend cellene i 1 ml EB-medium supplert med 50 μM Y-27632. Bruk en 1 ml pipette for forsiktig å fjerne cellene i en encellet suspensjon.
    9. Umiddelbart etter at du har resuspendert cellene, fortynn og tell dem.
    10. Fortynn riktig volum celleoppheng (som inneholder 900 000 celler) i 30 ml EB-medium supplert med 50 μM Y-27632 og 4 ng/ml bFGF og bland forsiktig løsningen.
    11. Plate 9000 celler/brønn i en ultra-lav feste 96U plate (300 μL/brønn). For å unngå forstyrrende EB-dannelse, inkuber platen i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 til dag 3 uten middels endring.
  3. Nevral induksjon (dobbel SMAD-hemming)
    1. På dag 3, sørg for at EB-er måler 300-400 μm og viser vanlige grenser. Hvis begge kriteriene nås, erstatt halvparten av mediet (150 μL) med induksjonsmedium-1 som inneholder doble SMAD-hemmere, noe som fører til lysning av konturen til EB-ene etter dag 6 til dag 7 som indikerer nevroektodermal differensiering (supplerende tabell 2).
    2. På dag 4 erstatter du 3/4 av mediet (225 μL) med induksjonsmedium-1.
    3. På dag 6 og dag 8: Oppdater halvparten av induksjonsmediet-1 (150 μL).
  4. Organoid innebygging i kjellermembranmatrise (dag 10)
    1. På dag 10 legger du inn EBer i vekstfaktor redusert kjellermembranmatrise (BMM).
      MERK: Fra dette trinnet må du alltid bruke steril saks til å kutte åpningen av pipettespissene for å unngå å skade organoidene ved gjentatt pipettering.
    2. Først overføre rundt 15-17 organoider i koniske rør. La EB-ene slå seg ned og fjerne mediet. Tilsett 50 μL induksjonsmedium-2 og overfør dem til et mikrosenterrør som inneholder 100 μL BMM.
    3. Spred matrise-EB-blandingen på midten av en brønn med en ultra-lav-festeplate og skill EB-ene for å forhindre at de fusjonerer.
    4. La BMM størkne i inkubatoren ved 37 °C i 45 minutter.
    5. Tilsett 3 ml induksjonsmedium-2 i hver brønn og legg platen i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
      MERK: Sørg for at denne prosedyren gjøres så raskt som mulig, da BMM størkner ved romtemperatur.
  5. Stasjonær kultur av organoider innebygd i kjellermembranmatrisen
    1. Dag 12, 14: Oppdater induksjon middels-2.
    2. Dag 16: Oppdater induksjon medium-2 og sjekk under et mikroskop utvidelsen av nevroepitheliale løkker.
  6. Kjellermembranmatrise dissosiasjon og kultur på en orbital shaker
    1. På dag 17 dissosierer du organoider fra BMM ved å pipettere opp og ned 10 ganger med en 5 ml pipette og overføre dem til differensieringsmedium-1 (uten vitamin A). Inkuber på en orbital shaker ved 80 rpm i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 for å forbedre ernæringsmessig absorpsjon.
      MERK: Bruk en annen inkubator for stasjonær kultur og kultur på en orbital shaker for å unngå vibrasjoner som er skadelige for tilhenger av hIPS-cellevekst.
    2. Dag 19: Oppdater differensiering medium-1.
    3. Dag 21: Endre differensiering middels-1 til differensiering medium-2 (med vitamin A).
    4. Fra dag 23 til dag 35: Oppdater medium med differensiering middels 2 hver 2-3 dager.
    5. Fra dag 35 til dag 70: Oppdater differensiering middels 2 med 1% BMM og oppdater hver 2-3 dager.
    6. Samle organoidene etter 28, 42 og 70 +/- 2 dager med differensiering og fest dem over natten ved 4 °C, i 5 ml 4 % PFA på et konisk rør på 15 ml.
    7. For videre i toto eller frittflytende immundempende analyse skylles organoider deretter to ganger i PBS og bevares ved 4 °C i PBS + 0,05 % natriumazid.
    8. For immundempende analyse på frosne seksjoner, senk 4% PFA faste organoider i 10 ml 30% sukrose ved +4 °C PÅ (eller til organoider synker). Bygg dem inn i en frossen innbyggingsmatrise og oppbevar ved -80 °C til kryooseksjon.

3. I toto immunolabeling, rydding og lightsheet oppkjøp av dorsale forebrain organoider

  1. Fiksering
    1. Samle organoidene i 6-brønnsplater, fjern mediet, og fest dem med 2 ml 4% PFA, ved 4 °C, over natten.
    2. Utfør tre vasker i 2 ml PBS ved romtemperatur.
    3. Overfør organoidene til 2 ml rør og oppbevar ved 4 °C i 2 ml PBS + 0,05 % natriumazid.
  2. Permeabilisering
    1. Inkuber organoider i 1 ml PBS som inneholder 0,2 % Triton X100 ved RT i 1 time. Gjør dette to ganger.
    2. Inkuber i 1 ml PBS som inneholder 0,2 % Triton X100 og 20 % DMSO, ved 37 °C, over natten.
    3. Inkuber i 1 ml PBS som inneholder 0,1 % Tween20, 0,1 % Triton X100, 0,1 % deoksykolat, 0,1 % NP40 og 20 % DMSO, ved 37 °C, over natten.
    4. Inkuber i 1 ml PBS som inneholder 0,2 % Triton-X100, ved RT, i 1 time. Gjør dette to ganger.
  3. Blokkering og immunmerking
    1. Blokker i 1 ml blokkeringsløsning (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Esel serum,10% DMSO), ved 37 °C, PÅ.
    2. Inkuber med primære antistoffer fortynnet i 250 μL PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/ml Heparin, 5% DMSO og 3% eselserum, ved 37 °C, i 2 dager.
    3. Vask i 1 ml PBS som inneholder 0,2% Tween20 og 0,1 μg/ml Heparin, i 1 time, ved 37 °C. Gjør dette fire ganger.
    4. Vask i 1 ml PBS som inneholder 0,2% Tween20 og 0,1 μg/ml Heparin, over natten, ved 37 °C.
    5. Inkuber med sekundære antistoffer fortynnet i 250 μL PBS som inneholder 0,2% Tween 20, 0,1 μg/ml Heparin og 3% eselserum, ved 37 °C, i 2 dager.
    6. Vask i 1 ml PBS som inneholder 0,2% Tween 20 og 0,1 μg/ml Heparin, i 1 time, på et hjul, ved RT. Gjør dette fire ganger.
    7. Vask i 1 ml PBS som inneholder 0,2% Tween 20 og 0,1 μg/ml Heparin, over natten, på et hjul, ved RT.
    8. Vask i 1 ml PBS, i 24 timer, ved RT.
    9. Lager ved +4 °C i 1 ml PBS og 0,05 % natriumazid til klaring.
  4. Rydding i TDE (2,2′ -Thiodietanol)
    1. Inkuber organoidene i 1 ml 30% TDE (3 ml TDE + 7 ml PBS), i 24 timer, ved RT.
    2. Inkuber i 1 ml 60 % TDE (6 ml TDE + 4 ml PBS), i 24 timer, ved RT.
    3. Inkuber i 1 ml 80 % TDE (8 ml TDE + 2 ml PBS), i 24 timer, ved RT.
  5. Organoid innebygging før oppkjøp av lysark
    MERK: Bruk et skreddersydd system; laget med en 1 ml sprøyte med spissen kuttet med en skalpell.
    1. Forbered 100 ml 4% lavsmeltende agarose i 60% TDE-løsning og aliquot i 2 ml rør. Spar ved +4 °C.
    2. Før organoid innebyggingen forvarmer du ett rør som inneholder 1,5 ml 4 % lavsmeltende agarose i 60 % TDE i et vannbad ved 37 °C til det flytende.
    3. I mellomtiden forbereder du et skreddersydd støpesystem laget av en 1 ml sprøyte, hvis spiss er avskåret ved hjelp av en skalpell.
    4. Pump i sprøyten 600 μL av geloppløsningen ved hjelp av stempelet.
    5. Plasser prøven med en forstørret pipettespiss hvis åpning er kuttet med steril saks.
    6. Fyll inn sprøyten med 400 μL geloppløsning slik at prøven plasseres innenfor den nedre tredjedelen av sprøyten.
    7. La gelen polymerisere og oppbevares i 80% TDE-oppløsning ved 4 °C beskyttet mot lys til anskaffelse.
    8. For oppkjøp av lysark, bruk en 20x objektiv nedsenket i 80% TDE-løsning lagt til i prøvekammeret for å tillate nøyaktig justering til brytningsindeksen for clearingmetoden.
    9. Sett inn sprøyten som inneholder den agarose innebygde organoiden i den største prøveholderen designet for å imøtekomme en 1 ml sprøyte som stempelet kan betjenes for å plassere organoiden foran målet.
      MERK: Det tar omtrent 5 til 10 minutter å kjøpe et helt organoid.

4. Immunstaining og rydding av frittflytende deler av dorsale forebrain organoider

  1. Fiksering, agarose innebygging og seksjonering av organoidene
    1. Samle organoider etter 28, 42 og 70 +/- 2 dager med differensiering i en 6-brønns plate og fest over natten ved 4 °C i 2 ml PFA.
    2. Skyll to ganger i 2 ml PBS og spar ved 4 °C i 2 ml PBS + 0,05 % natriumazid.
    3. Bygg inn de faste organoidene i 4% lavsmeltende agarose i en plastinnbyggingsform (7 x 7 mm). Fjern forsiktig agaroseblokken fra plastformen og lim den til vibratomtrinnet.
    4. Del de innebygde organoidene ved hjelp av et vibratom for å oppnå 150 μm frittflytende seksjoner overført i en brønn på en 24-brønns plate som inneholder 500 μL PBS ved hjelp av en pensel for å unngå å skade seksjonene.
      MERK: Lavsmeltende agarose anbefales da smeltetemperaturen bare er ca. 60 °C. Forbered 4% lavsmeltende agarose i PBS-oppløsning og la den avkjøles litt over 37 °C i et vannbad før organoid innebygging.
  2. Permeabilisering, blokkering og immunstaining
    1. Inkuber seksjonene i 500 μL PBS som inneholder 0,3% Triton X100, ved RT, under agitasjon, i 20 minutter. Gjør dette tre ganger.
    2. Inkuber seksjonene i 500 μL PBS som inneholder 0,3% Triton X100 og 5% nonfat melk, ved RT, under agitasjon, i 2 timer.
    3. Inkuber seksjonene i 250 μL primær antistoffløsning (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% ikke-fett melk), under agitasjon, ved +4 °C, over natten.
    4. Vask seksjonene i 500 μL PBS, ved RT, under agitasjon, i 20 minutter. Gjør dette fire ganger.
    5. Inkuber seksjonene i 250 μL sekundær antistoffoppløsning (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% ikke-fettmelk), ved RT, under agitasjon, i 2 timer.
    6. Vask seksjonene i 500 μL PBS, ved RT, under agitasjon, i 20 minutter. Gjør dette fire ganger.
    7. Oppbevar seksjonene i 500 μL PBS ved +4° C til du tømmer.
  3. Rydding i TDE (2,2′ -Thiodietanol)
    1. Inkuber seksjonene i 500 μL på 30% og 60% TDE i 1 time hver ved RT, og deretter i 500 μL 80% TDE over natten, ved RT.
    2. Oppbevar de klarerte seksjonene i 500 μL 80% TDE til oppkjøpet ved +4 °C.
  4. Montering av frittflytende seksjoner før oppkjøp med resonansskanning konfikal
    1. Monter en frittflytende seksjon i et forseglet kammer som gjør det mulig å opprettholde prøven i 80% TDE-løsning og designet for å tilpasse seg på et motorisert XY-stadium av konfokale mikroskoper.
    2. Sett en rund dekslerlip i kammersystemet.
    3. Overfør forsiktig den ryddede immundempte delen ved hjelp av en pensel.
    4. Fyll kammeret med 80% TDE-løsning.
    5. Tilsett to standard deksler pluss en andre runde deksler og en silikontetning.
    6. Skru på skruringen på kammeret for å forsegle systemet perfekt.

5. Lysark og resonansskanning konfektanalyse

  1. Behandle lysark- og resonansskanningsanskaffelser ved hjelp av programvare som muliggjør 3D-visualisering og analyse av hele immunostained prøven.
    MERK: Slik programvare gjør det mulig å raskt åpne store data for enkelt å lage øyeblikksbilder og animasjoner. Det gjør det mulig å flytte prøven i forskjellige retninger og generere 2D-visninger takket være et 2D-slicerverktøy i forskjellige retninger, for eksempel XY og YZ.
  2. For automatisk deteksjon av både sentrosomer og primære cilia, bruk en spotveiviser som gjør det mulig å kvantifisere nummeret sitt i patologiske kontra kontrollforhold.
  3. For 3D-rekonstruksjon av PC som muliggjør presis måling av lengden, bruk en filamentveiviser for å manuelt fikse startpunktet til PCen, og programvaren bruker fluorescenssignalet til å rekonstruere PCen nøyaktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

2D hIPS cellebaserte modeller for å studere primær ciliumbiogenese og funksjon
Protokollen som er beskrevet her er tilpasset fra tidligere publiserte studier20,21,22. Denne protokollen tillater generering av nevrale rosettstrukturer som inneholder neokortiske forfedre og nevroner som ligner de som er sett i den utviklende neocortex. Detaljert validering kan utføres ved konvensjonell immunstainingsanalyse ved hjelp av spesifikke beslutningstakere3. For eksempel bør apikale forfedre (AP) være dobbeltfarget med SOX2 og PAX6, mellomliggende forfedre (IP) avsløres av TBR2 / EOMES-farging, og tidligfødte neokortiske nevroner avsløres av CTIP2-farging (figur 1A-C). Slike nevrale rosettlignende strukturer modellerer interkinetisk kjernefysisk migrasjon (INM) av AP som kan visualiseres ved immunostaining med antistoffer oppdratt mot fosfo-vimentin, som flekker mitotiske kjerner og TPX2 som flekker den mitotiske spindelen. Disse markørene tillater derfor analyse av flere egenskaper ved AP, inkludert INM med celledeling som skal foregå apically rundt den sentrale lumen (figur 1D,D'), samt divisjonsmodusen bestemt ved å måle vinkelen mellom divisjonsplanet og den apikale overflaten. Til slutt kan ciliogenesis analyseres ved immunoppfatning med antistoffer oppdratt mot PCNT, som flekker basal kroppen av PC, og ARL13B som flekker axoneme. På slike rosettstrukturer strekker PC seg fra den apikale polen av AP-er til de sentrale lumen i hver ventrikellignende region (figur 1E,E'), mens de også stikker ut fra CTIP2+ nevroner (figur 1E'').

Dissosiasjon av disse rosettstrukturene gjør det mulig å skaffe isolerte NSPCer dyrket på poly-L-ornitin/lamininbelagte kulturplater i NMM med høy tetthet for å tillate vedlikehold av en stabil og utvidbar befolkning av NSPCer i minst 15 passasjer uten å samle karyotype abnormiteter21,27. For å analysere PC-biogenese dyrkes dissosierte NSPCer for å samløpe og sulte i 48 timer. Immunstainingsanalyser ved bruk av antistoffer som er reist mot PC-markører, viser at NSPCene har PC (figur 2A). Ved å kombinere to komplementære open source-verktøy, Ilastik, et maskinlæringsbasert bildeanalyseverktøy som er nyttig for PC-segmentering28 og CiliaQ, en Fiji / ImageJ-plugin-pakke29, som muliggjør 3D-rekonstruksjon av PC fra 3D-konfokale bildestakker, kan flere strukturelle parametere enkelt evalueres, inkludert antall PC og lengde.

PC-funksjonen til NSPCer kan også evalueres ved å teste transduksjonen av Hedgehog-signalveien. For å vurdere transduksjonen av SHH-signalveien sultes NSPCer i 48 timer og behandles med rekombinant SHH (rSHH) eller en glattet agonist (SAG) i 24 timer. Ved hjelp av antistoffer som er reist mot GPR161, SMO og GLI2, gjør immunfluorescent (IF) analyse det mulig å teste smuglingen av disse viktige SHH-signaliseringsaktørene langs PCen, med GPR161 som normalt går ut av PCen mens GLI2 og SMO akkumuleres i PCen som svar på SHH-baneaktivering (figur 2C-D). Analyse av 3D-konfokale bildestakker ved hjelp av CiliaQ-verktøy gjør det mulig å kvantifisere GPR161-utgang fra PCen, samt GLI2- og SMO-akkumulering i PCen etter SHH-baneaktivering (figur 2F-G). I tillegg viser semi-kvantitativ RT-PCR-analyse på mRNA hentet fra rSHH- eller SAG-behandlede NSPCer induksjonen av to SHH-målgener, GLI1 og PTCH1, som vitner om normal SHH-signaltransduksjon i NSPCer avledet fra kontroll-hIPSCer (figur 2B).

Totalt sett reproduserer 2D-cellebaserte modeller for å utvikle dorsal forebrain tydelig flere aspekter av normal hjernebarkutvikling og representerer lovende verktøy for å dissekere PC-tilknyttede mekanismer som ligger til grunn for anomalier av neokortisk utvikling ved hjelp av kontroll versus pasient hIPSCer som skjuler mutasjoner i gener som er ansvarlige for menneskelige utviklingsavvik i hjernebarken.

3D hIPS cellebaserte modeller for å studere primært ciliuminvolvering under neokortisk utvikling
Protokollen som er beskrevet her (figur 3A) er tilpasset fra tidligere publiserte protokoller23,24,25,26,30 og vellykket testet på fem forskjellige kontroll hIPSC linjer. Det tillater generering av hIPSC-avledede dorsale forebrain organoider som øker i størrelse over tid mens de danner store nevroepitheliale løkker (figur 3B). Immunolabelingsanalyse enten på organoide kryoser (kryostat, 20 μm), frittflytende seksjoner (vibratom, 150 μm) eller i toto, kan utføres for kvalitetskontroller. På dag 28 ± 2 består organoider av stratifiserte nevroepitheliale løkker som samtidig uttrykker den nevrale stamcellemarkøren SOX2 og dorsal forebrain-markøren PAX6, som vitner om dorsal forebrain identitet. På dag 42 ± 2 (6 uker med differensiering), bør disse løkkene vise en mer kompleks stratifisert organisasjon. Fra den apikale til basale overflaten av disse sløyfestrukturene, en ventrikulær sone (VZ)-lignende region med SOX2/PAX6-positiv apikal radial glial forfedre (aRG) kan avgrenses, samt en subventricular sone (SVZ)-lignende region med TBR2-positive mellomliggende forfedre (IPs) og en kortikale plate (CP)-lignende region som inneholder CTIP2-positiv tidlig fødte neokortiske nevroner (figur 3C, E). ARG's args apikale molekylære polaritet kan evalueres ved den apikale berikelsen ved den ventrikulære overflaten av ZO-1 og N-CADH (figur 4A, video 1). ARG-forfederdivisjonsegenskapene kan evalueres ved hjelp av TP2X- og P-VIM-markører for å analysere INM som normalt fører til justering av aRG-mitotiske kjerner ved den ventrikulære overflaten av de kortikale løkkene (figur 4B, video 2). Slik immunisolering gjør det også mulig å måle divisjonsvinkelen for å evaluere symmetrisk versus asymmetrisk divisjonsmodus for aRG. P-Vim positive forfedre kan også observeres i SVZ-lignende regionen, og har en unik basalprosess som strekker seg til basaloverflaten som minner om ytre radial glia (oRG eller basal radial glia, figur 4C, video 2). Mens de er fraværende fra dag 42 organoider, SATB2 positive senfødte nevroner bør oppdages fra dag 70 (10 uker med differensiering) (Figur 3D, F), attesterer for in vivo-lignende tidspunkt for neokortisk nevronal differensiering.

Immunisoleringsforsøk ved hjelp av basallegemet (gamma Tubulin) og axoneme (ARL13B)-markører tillater visualisering av PC på 20 μm kryoseksjoner (figur 3G,H). For å dra nytte av 3D-organiseringen av dorsale forebrain organoider, kan helmontert immunostaining utføres. Light sheet oppkjøp av slike i toto immunostained og cleared organoider tillater påvisning av både sentrosomer og PC på alle NSPC typer samt på neokortiske nevroner (Video 3). I tillegg, for å utføre mer nøyaktige analyser av PC biogenese, immunhiistokjemi analyse på frittflytende tykke seksjoner (150 μm) av dorsale forebrain organoider kan utføres. Etter rydding kan slike seksjoner anskaffes ved hjelp av et 40x (NA 1.3) eller 63x (NA 1.4) oljemål om et invertert resonans hvitt lys konfokalt lasermikroskop, noe som gjør det mulig å forbedre oppløsningen samtidig som 3D-romlig informasjon om organoider bevares. Slike laserskanningskonfokale mikroskop muliggjør rask anskaffelse av tykke seksjoner, med en presis og fleksibel eksitasjon og deteksjon uten forstyrrelser (video 4). Flere strukturelle parametere for PC kan evalueres, inkludert PC-nummer, lengde og orientering, ved hjelp av 3D-bildebehandlingsprogramvare. Dedikerte åpen kildekode, fritt tilgjengelige verktøy som Ilastik28, et maskinlæringsbasert bildeanalyseverktøy samt CiliaQ-plugin-pakken på Fiji / ImageJ29 er svært nyttige for automatisk PC-segmentering som tillater etterfølgende kvalitativ og kvantitativ analyse av PC-biogenese og funksjon i kontroll kontra patologiske forhold.

Figure 1
Figur 1: Generering og karakterisering av 2D-nevrale rosetter. Immunhiistokjemisk karakterisering av nevrale rosettstrukturer ved hjelp av (A) SOX2 og PAX6 antistoffer for å oppdage AP, (B) TBR2/EOMES for å avsløre IP, og (C) CTIP2 for å flekke tidligfødte neokortiske nevroner. Proliferating AP oppdages med fosfo-vimentin og TPX2 antistoffer og ligger på den apikale overflaten (D,D'). PC avsløres ved dobbel immunstaining med PCNT og ARL13B antistoffer. PC strekker seg fra hver AP til de sentrale lumen av hver rosett, mens de også oppdages på IP og tidlig fødte nevroner (E, E', E''). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Isolerte NSPCer avledet fra 2D nevrale rosetter har funksjonell PC. Dissosiasjon av 2D-nevrale rosetter gir opphav til isolerte NSPCer som skjuler PC etter sult i 48 timer som avslørt av ARL13B og PCNT immunostaining (A). NSPCer har funksjonell PC som avslørt ved RT-PCR-kvantifisering av to SHH-målgener GLI1 og PTCH1 etter sult i 48 timer og påfølgende aktivering av banen ved behandling med rekombinant SHH (rSHH) i 24 h. GLI1 og PTCH1 uttrykksdata ble utført i triplikat og normalisert til ACTB uttrykksdata. Data ble analysert med 2-ΔΔCt-metoden og presentert som relativt uttrykk ± SEM (Mann Whitney test) (B). IF-analyse på sultne NSPCer med (D) eller uten (C) rSHH-behandling for å teste dynamikken til to viktige aktører i SHH-signalveien, GLI2 og GPR161, som henholdsvis akkumuleres eller går ut av PCen etter SHH-baneaktivering. Ved å kombinere Ilastik- og CiliaQ-verktøy for analyse av konfokale bilder ble GPR161 (F) og GLI2 (G) signalintensitet i PC sammenlignet i +/- rSHH-behandlet NSPCer. ARL13B-farging ble brukt til PC-segmentering, og som forventet var PC-lengden uendret i +/- rSHH behandlet NSPCs (E). Data summeres i boks- og whisker-plott (gjennomsnittsverdier ± SEM). p < 0.0001 (Mann Whitney test). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Generering og karakterisering av dorsale forebrain organoider. (A) Skjematisk oversikt over protokollen for å generere dorsale forebrain organoider. (B) Representative lysfeltbilder av organoider på dag 1, 3, 7, 24 og 42 av differensiering. Kondokale bilder av 20 μm kryoser av organoider på dag 42 (C) og 70 (D) etter immunstaining med SOX2, TBR2, og CTIP2 antistoffer avgrenser henholdsvis ventrikkelsonen (VZ), den subventrikulære sonen (SVZ) som inneholder TBR2 positiv IP, og den preplate-lignende regionen (CP) som inneholder CTIP2 positive tidligfødte neokortiske nevroner. Kondokale bilder av 20 μm kryoser av organoider på dag 42 (E) og 70 (F) etter immunstaining med PAX6, CTIP2 og SATB2 antistoffer som viser utseendet til SATB2 positive senfødte nevroner på dag 70. Konfokale bilder av 20 μm kryoser av en organoid på dag 42 etter immunstaining med ARL13B og PCNT antistoffer som avslører PC på den apikale polen av radiale glial forfedre (G) mens de også er til stede på CTIP2 positive nevroner (H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: 3D-avbildning av dorsale forebrain organoider. (A) Oppkjøp av et helt dorsalt forebrain organoid (dag 42) farget med PAX6, N-CADH, og CTIP2 antistoffer som viser flere nevroepitheliale løkker med PAX6 positive radiale glial forfedre som viser riktig apicobasal polaritet som avslørt ved akkumulering av N-Cadherin på deres apikale side og CTIP2 positive tidligfødte neokortiske nevroner som avgrenser en preplate-lignende region. (B) Oppkjøp av et helt dorsalt forebrain organoid (dag 42) farget med TPX2, P-Vim og CTIP2 antistoffer som illustrerer interkinetisk kjernefysisk migrasjon av ventrikulære radiale gliale forfedre. (C) Zoom på lysarkoppkjøpet av en hel dorsal forebrain organoid (dag 42) farget med TPX2- og P-Vim-antistoffer som viser en forfedre som utvider en unik basalprosess og lokalisert i den subventrikulære sonen, som minner om en ytre radial glialgenitor. (D) Resonant Scanner oppkjøp av en 150 μm del av en dorsal forebrain organoid (Dag 42) farget med PCNT og ARL13B antistoffer som viser PC i NSPCer og neokortiske nevroner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Generering og karakterisering av 2D- og 3D hIPS-cellebaserte modeller av dorsal forebrain utvikling for å dissekere PC-involvering til patofysiologien til cerebral kortikale anomalier. hIPS-celler har lov til å danne embryoide kropper (EBs) i lavadheft kulturplater, og blir deretter inkubert inn i et induksjonsmedium som inneholder doble SMAD-hemmere for å indusere neuroectodermaliasjon. Vedheft av EBs i PO / lam-belagte retter tillater generering av 2D nevrale rosettstrukturer, mens den frittflytende kulturen til EBs med etterfølgende innbygging i BMM tillater generering av dorsale forebrain organoider. Tilbaketrekking av mitogene faktorer fra tilhenger nevralt rosettmedium fremmer utbruddet av nevrogenese som kan testes ved IF-analyse. Dissosiasjon av tilhenger nevrale rosetter gjør det mulig å generere isolerte NSPC-kulturer som er nyttige for PC biogenesis og funksjonsanalyse. Dorsale forebrain organoider samles etter 4, 6 eller 10 ukers differensiering og festes for etterfølgende immunoppfatningsanalyse enten i toto, på 150 μm tykke seksjoner, eller 20 μm kryoser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Oppkjøp av et helt dorsalt forebrain organoid (dag 42) immunostert med PAX6-, CTIP2- og NCADH-antistoffer. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Oppkjøp av et helt dorsalt forebrain organoid (dag 42) immunostert med TPX2-, P-VIM- og CTIP2-antistoffer. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3: Oppkjøp av et helt dorsalt forebrain organoid (dag 42) immunostert med PCNT og ARL13B antistoffer. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 4: Resonant skanning konfokal oppkjøp av en 150 μm del av en dorsal forebrain organoid (dag 42) immunostert med ARL13B og PCNT antistoffer. Klikk her for å laste ned denne videoen.

TILLEGGSFILER: Klikk her for å laste ned tabellene.

Supplerende tabell 1: Oppskrift av mediet som brukes til generering av 2D-nevrale rosetter og NSPCer.

Supplerende tabell 2: Oppskrift av mediet som brukes til generering av dorsale forebrain organoider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PC er nå ansett som viktige organeller som regulerer viktige skritt under normal cerebral kortikale utvikling18,19,31 inkludert NSPC-utvidelse og engasjement8,9,10,11,12 samt nevronal migrasjon13,14 og synaptogenesis16,17 . I tillegg til analyse i dyremodeller eller humant føtal cerebral vev, er genereringen av svært innovative og relevante pasientavledede hIPSC-baserte modeller for neokortisk utvikling avgjørende for å dissekere PCens rolle under både normal og patologisk cerebral kortikale utvikling.

Den 2D hIPSC-baserte modelleringsprotokollen som er beskrevet her, ble tilpasset fra tre store publikasjoner20,21,22. Neuroepithelial differensiering er indusert av dobbel SMAD-hemming ved hjelp av små molekylhemmere av aktivin / nodal (SB-431542) og BMP (LDN-193189) veier22. Celler er organisert i rosettformede strukturer som inneholder NSPCer samt neokortiske dyplagsnevroner etter 20 dager med differensiering. I tillegg viser disse rosettlignende strukturene riktig apicobasal polaritet, interkinetisk kjernefysisk migrasjon av apikale forfedre samt PC som strekker seg fra alle NSPCer og nevroner. Etter dissosiasjon av disse rosettstrukturene oppnås en homogen og stabil populasjon av kortikale forfedre21. Når de er dyrket til samløp og sultet i 48 timer, har de kortikale forfedrene PC som morfologien, antallet og lengden lett kan analyseres ved å kombinere Ilastik28 og CiliaQ28,29 plugin-pakke på Fiji / ImageJ. Videre, ved å bruke cytokiner for å indusere SHH-signalveien, kan PC-funksjonen også brukes av IF til å teste dynamikken til viktige signalveiaktører langs PCen som GLI2, SMO og GPR161. I tillegg muliggjør semi-kvantitative RT-PCR-analyser testing av induksjonen av SHH-målgenuttrykk, inkludert GLI1 og PTCH1, som svar på SHH-baneaktivering. Andre signalveier som er avhengige av PC-funksjon, bør også testes, inkludert WNT- og IGF-veier2,32,33. For å konkludere med denne 2D-modelleringsmetoden, som tydelig reproduserer flere aspekter av normal hjernebarkutvikling, representerer den et nyttig og relevant verktøy for å teste PC-biogenese og fungere i normale versus patologiske forhold og bør bidra til å få ytterligere innsikt i involvering av PC under neokortisk utvikling.

Komplementære til 2D hIPSC-baserte modellering tilnærminger, dorsal forebrain organoider tilbyr enestående muligheter til å undersøke normal og patologisk cerebral utvikling in vitro som de recapitulate mange funksjoner og egenskaper av tidlig utvikle menneskelig cerebral cortex. To hovedtyper av protokoller brukes for tiden: iboende og veiledede metoder. Den iboende protokollen utviklet av Lancaster og kolleger23 er avhengig av IPSCs egenutviklede evne til selvorganisert med minimale eksterne faktorer og gir opphav til cerebral organoider som inneholder rudiments av distinkte hjerneregioner som gir en unik mulighet til å modellere interaksjonene mellom forskjellige hjerneregioner. Imidlertid gir den høye variasjonen og heterogeniteten som ligger i en slik modelleringsstrategi betydelige utfordringer med reproduserbarhet. Guidede organoid differensieringsprotokoller tillater generering av hjerneregionspesifikke organoider med minimal heterogenitet24,25,26. Denne tilnærmingen tillot oss å lykkes med å generere dorsale forebrain organoider med ventrikellignende strukturer som rekapitulerer store prosesser for tidlig menneskelig cerebral kortikaleutvikling. Det første kritiske problemet er å starte med høykvalitets hIPSC-kulturer som huser store vanlige kolonier som viser mindre enn 10% differensiering og som har blitt passasje nesten en gang som monolayer for å tilpasse hIPCene til encellede kulturforhold. Faktisk, for å begrense organoid heterogenitet, en av de største utfordringene i feltet, er dannelsen av EBs med en homogen størrelse en forutsetning som innebærer behovet for dissosiasjon av hIPSC-kolonier i encellet suspensjon som tillater såing ved definert celletetthet. Et annet kritisk skritt er BMM-inkludering av EB-er, som trengs for å støtte 3D-struktur og nevroepithelial ekspansjon. Vi favoriserte gruppen inkludering av omtrent femten organoider over individuell inkludering selv om det innebærer et ekstra skritt, BMM dissociation. BMM-dissosiasjon før rystelseskulturen har vist seg å redusere variasjon i og mellom organoide partier, noe som resulterer i høyere reproduserbarhet34. I tillegg gjør det mulig å kvitte seg med celleprosesser som strekker seg inn i BMM som ikke er skadelige for følgende differensieringstrinn, men som gjør det vanskelig å observere organoider for kvalitetsinspeksjon under påfølgende trinn i prosedyren. For å forbedre ernæringsmessig absorpsjon og oksygenutveksling sammenlignet vi organoid modning på orbital shakers og spinnende bioreaktorer som førte til lignende resultater. Vi valgte derfor orbital shaker-alternativet, da det gjør det mulig å redusere de mellomstore volumene betydelig og derfor de totale kostnadene for forsøkene. Viktigst, bruk en annen inkubator for stasjonær og ristende kultur på en orbital shaker for å unngå vibrasjoner som er skadelige for tilhenger av hIPSC-vekst. Vi har brukt denne protokollen på fem distinkte hIPSC-linjer35 som gir opphav til homogene resultater som sikrer robustheten i denne prosedyren.

Karakterisering av slike organoider kan oppnås ved hjelp av flere metoder. For å bevare 3D-romlig informasjon innen organoider, setter vi opp en protokoll som tillater helmontert immunstaining og rydding av hele organoider med påfølgende lysarkanskaffelse. Ulike avregningsmetoder har dukket opp med effektivitet avhengig av utvalgsopprinnelse og tykkelse36,37. Her setter vi opp en enkel, rask og kostnadseffektiv clearingmetode som er avhengig av TDE (2,2'-thiodietanol), et glykolderivat som tidligere ble brukt til å fjerne musehjerne og tarmorganoider38,39. Oppkjøp av immunosterte og klarerte organoider ble utført på et lysarkmikroskop ved hjelp av et 20x objektiv nedsenket i 80% TDE. Sammenlignet med andre 3D-avbildningsmetoder, er lysarkmikroskopi av interesse av flere grunner: raskt oppkjøp, god penetrasjon og redusert fotobleaching. Optimalisering av permeabiliseringstrinnet gjør det mulig å nå effektiv og homogen antistoffinntrengning som gjør det mulig å visualisere basale legemer og axonmer av PC som strekker seg fra alle stamceller av hele organoiden. Videre gjør oppkjøp av frittflytende 150 μm tykke seksjoner ved hjelp av et invertert resonansskanning konfokalt mikroskop med 40x (NA 1.3) eller 63x (NA 1.4) oljemål i stand til å komme videre i oppløsning, samtidig som en betydelig grad av 3D-romlig informasjon, og tillater kvalitativ og kvantitativ analyse av PC-biogenese og funksjon.

Kombinere slike 2D- og 3D-cellebaserte modeller og 3D-bildeanalyse (figur 5) på hIPSCer generert enten ved å omprogrammere ciliopati pasientceller eller ved å bruke CRISPR / CAS9-teknologi for å spesifikt redigere sentrosomale eller ciliære gener, bør tillate betydelig fremgang i forståelsen av PC-ens bidrag under normal og patologisk utvikling av hjernebarken. Det er viktig at genomredigeringsteknologi også gjør det mulig å spesifikt redde pasientmutasjoner for å oppnå isogene kontroll-hIPSCer for å overvinne genetisk heterogenitet som utfordrer påvisning av sykdomsmekanismer. I tillegg er encellede genomiske tilnærminger nå mye brukt over hele feltet og representerer relevante og komplementære tilnærminger til immunstainingsanalyse. Til tross for noen begrensninger og vanskeligheter som ligger i alle nye teknologier, og som i stor grad blir adressert, tilbyr slike 2D- og 3D hIPSC-baserte modeller og karakteriseringsmetodene vi presenterte her kraftige og relevante verktøy for å dissekere PC-involvering i de patologiske mekanismene som ligger til grunn for menneskelige utviklingsmessige neokortiske anomalier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Agence Nationale de la Recherche (ANR) til S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) og N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 og ANR-19-CE16-0002-01). LB støttes av ANR under Investissements d'avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01) og Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-programmet). Imagine Institute støttes av statlig finansiering fra ANR under Investissements d'avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-prosjekter) og som en del av det andre Investissements d'Avenir-programmet (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 181 primær cilium menneskeskapte pluripotente stamceller hIPSCer nevrale stamceller og stamceller human cerebral kortikale utvikling nevrale rosetter dorsale forebrain organoider 2D- og 3D hIPSC-baserte modeller for neokortisk utvikling cerebral organoider sonisk pinnsvin helmontert immunostaining optisk rydding lysplatemikroskop
2D og 3D Human induserte Pluripotente stamcellebaserte modeller for å dissekere primær ciliuminvolvering under neokortisk utvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter