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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von 2D- und 3D-Modellen für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC) der neokortikalen Entwicklung sowie ergänzende Methoden, die eine qualitative und quantitative Analyse der primären Cilium (PC) -Biogenese und -Funktion ermöglichen.

Abstract

Primäre Zilien (PC) sind nicht bewegliche dynamische Organellen auf Mikrotubulibasis, die aus der Oberfläche der meisten Säugetierzellen herausragen. Sie treten während der G1/G0-Phase des Zellzyklus aus dem älteren Zentriole aus, während sie sich zerlegen, wenn die Zellen an der G2/M-Phasengrenze wieder in den Zellzyklus eintreten. Sie fungieren als Signalknotenpunkte, indem sie extrazelluläre Signale erkennen und transduzieren, die für viele Zellprozesse entscheidend sind. Ähnlich wie bei den meisten Zelltypen wurde gezeigt, dass alle neokortikalen neuralen Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) einen PC beherbergen, der es ihnen ermöglicht, spezifische Signale zu erfassen und zu übertragen, die für die normale zerebrale kortikale Entwicklung erforderlich sind. Hier stellen wir detaillierte Protokolle zur Verfügung, um zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) zellbasierte Modelle aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hIPSCs) zu generieren und zu charakterisieren, um die Beteiligung von PC während der neokortikalen Entwicklung weiter zu analysieren. Insbesondere stellen wir Protokolle vor, um die PC-Biogenese und -Funktion in 2D-neuronalen Rosetten-abgeleiteten NSPCs zu untersuchen, einschließlich der Transduktion des Sonic Hedgehog (SHH) -Signalwegs. Um die dreidimensionale (3D) Organisation von zerebralen Organoiden zu nutzen, beschreiben wir eine einfache Methode zur 3D-Bildgebung von in toto immungefärbten zerebralen Organoiden. Nach dem optischen Clearing ermöglicht die schnelle Erfassung ganzer Organoide den Nachweis von Zentrosomen und PC auf neokortikalen Vorläufern und Neuronen des gesamten Organoids. Schließlich beschreiben wir das Verfahren zur Immunfärbung und Klärung dicker frei schwebender Organoidabschnitte, die ein erhebliches Maß an räumlicher 3D-Information erhalten und die hochauflösende Erfassung ermöglichen, die für die detaillierte qualitative und quantitative Analyse der PC-Biogenese und -Funktion erforderlich ist.

Introduction

Primäre Zilien (PC) sind auf Mikrotubuli basierende Organellen, die eine Fülle von chemischen und mechanischen Hinweisen aus der extrazellulären Umgebung wahrnehmen und übertragen. Insbesondere ist PC die zentrale Organelle für die Transduktion des Hedgehog-Signalwegs bei Wirbeltieren1,2. Während die meisten Nervenzellen seit langem gezeigt wurden, dass sie einen PC beherbergen, wurde der Beitrag dieser Organelle bei der Gestaltung des zentralen Nervensystems lange Zeit unterschätzt. Studien zur neokortikalen Entwicklung haben zur Entdeckung mehrerer neuraler Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) geführt, die alle einen PC beherbergen, dessen Standort als entscheidend für die Bestimmung des Schicksals des Vorläufers angesehen wurde3,4,5,6,7. PC hat sich als entscheidend für Zellmechanismen erwiesen, die für eine normale zerebrale kortikale Entwicklung erforderlich sind, einschließlich NSPC-Expansion und -Engagement8,9,10,11,12 sowie apikobasaler Polarität des radialen Gliagerüsts zur Unterstützung der neuronalen Migration13. Darüber hinaus werden PC während der tangentialen Wanderung von Interneuronen zur kortikalen Platte benötigt14,15. Schließlich wurde eine Rolle für den PC bei der Herstellung synaptischer Verbindungen von Neuronen in der Großhirnrinde vorgeschlagen16,17. Insgesamt sprechen diese Ergebnisse für eine entscheidende Rolle von PC bei wichtigen Schritten der zerebralen kortikalen Entwicklung18,19 und erhöhen die Notwendigkeit, ihre Beteiligung an den pathologischen Mechanismen zu untersuchen, die Anomalien der zerebralen kortikalen Entwicklung zugrunde liegen.

Jüngste Studien haben unser Verständnis wichtiger zellulärer und molekularer Unterschiede zwischen kortikaler Entwicklung in menschlichen und tierischen Modellen erheblich verbessert und die Notwendigkeit der Entwicklung menschlicher Modellsysteme betont. Aus dieser Sicht stellen humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSCs) einen vielversprechenden Ansatz dar, um die Krankheitspathogenese in einem relevanten genetischen und zellulären Kontext zu untersuchen. Adhärente zweidimensionale (2D) zellbasierte Modelle oder neuronale Rosetten enthalten NSPCs, die denen in der sich entwickelnden Großhirnrinde ähneln, die sich in rosettenförmigen Strukturen organisieren, die eine korrekte apikobasale Polarität aufweisen20,21,22. Darüber hinaus ermöglicht das dreidimensionale (3D) Kultursystem die Erzeugung dorsaler Organoide des Vorderhirns, die viele Merkmale der menschlichen zerebralen kortikalen Entwicklung rekapitulieren23,24,25,26. Diese beiden komplementären zellbasierten Modellierungsansätze bieten spannende Perspektiven, um die Beteiligung von PC während der normalen und pathologischen Entwicklung der Großhirnrinde zu analysieren.

Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von neuronalen Rosetten und abgeleiteten NSPCs sowie dorsalen Vorderhirn-Organoiden zur Verfügung. Wir bieten auch detaillierte Protokolle zur Analyse der Biogenese und Funktion von PCs auf NSPCs, indem wir die Transduktion des Sonic Hedgehog-Signalwegs testen und die Dynamik entscheidender Moleküle analysieren, die an diesem Signalweg beteiligt sind. Um die Vorteile der 3D-Organisation der zerebralen Organoide zu nutzen, haben wir auch eine einfache und kostengünstige Methode für die 3D-Bildgebung von in toto immungefärbten zerebralen Organoiden eingerichtet, die dank eines Lichtblattmikroskops eine schnelle Erfassung des gesamten Organoids mit hoher Auflösung ermöglicht, die es ermöglicht, PC auf allen Arten von neokortikalen Vorläufern und Neuronen des gesamten Organoids zu visualisieren. Schließlich passten wir die Immunhistochemie auf 150 μm frei schwebenden Schnitten mit anschließender Klärung und Erfassung mit resonanten Scanning-Konfokalmikroskopen an, die eine hochauflösende Bildaufnahme ermöglichten, die für die detaillierte Analyse der PC-Biogenese und -Funktion erforderlich ist. Insbesondere ermöglicht die 3D-Bildgebungssoftware die 3D-Rekonstruktion des PCs mit anschließender Analyse morphologischer Parameter einschließlich Länge, Anzahl und Ausrichtung des PCs sowie die Messung der Signalintensität von Ziliarkomponenten entlang des Axonems.

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Protocol

1. Generierung von 2D hIPS zellbasierten Modellen der neokortikalen Entwicklung

  1. Neuronale Rosettenbildung
    1. Beginnen Sie mit hIPSC-Kulturen, die große regelmäßige Kolonien beherbergen, weniger als 10% Differenzierung und nicht mehr als 80% Konfluenz aufweisen.
    2. Spülen Sie die hIPSCs mit 2 ml PBS ab.
    3. Fügen Sie 2 ml NSPC-Induktionsmedium hinzu, das mit dem Rock-Inhibitor (NIM + 10 μM Y-27632) ergänzt wird.
    4. Sezieren Sie jede hIPSC-Kolonie manuell von einer 35-mm-Schüssel mit einer Nadel, um jede Kolonie präzise in horizontaler und vertikaler Richtung zu schneiden, um ein Schachbrettmuster zu erzeugen, das jede Kolonie in gleiche Cluster unterteilt.
    5. Lösen Sie die Kolonie mit einem Zellschaber und übertragen Sie sie auf eine 35-mm-Schüssel mit extrem niedrigem Aufsatz.
    6. Lassen Sie sie über Nacht (ON) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 schweben, damit sie embryoide Körper (EBs) bilden können.
      HINWEIS: Embryoide Körper (EBs) sind definiert als schwimmende Sphäroidcluster oder Aggregate von hIPSCs.
    7. Übertragen Sie die EBs in Poly-L-Ornithin/Laminin (PO/lam)-beschichtete 35 mm Schalen in 2 ml NIM + 10 μM Y-27632.
    8. Tägliche Aktualisierung des NSPC-Induktionsmediums (NIM ohne Y-27632) bis zur Bildung von neuronalen Rosetten, die etwa 12 bis 14 Tage dauert. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop.
      HINWEIS: Nach diesem Schritt können neuronale Rosetten erweitert, differenziert und für die Immunfärbungsanalyse verarbeitet oder dissoziiert werden, um isolierte neurale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) zu erhalten.
  2. Neuronale Rosettenerweiterung und frühe Differenzierung
    1. Schneiden Sie neuronale Rosetten in einem gitterartigen Muster mit einer Nadel und entfernen Sie die Cluster mit einem Zellschaber.
    2. Übertragen Sie die Rosetten in eine 4-Well-Platte mit PO / lam-beschichtetem Glasdeckglas (4-5 Rosetten / Well) in 0,5 ml NSPC-Wartungsmedium (NMM).
    3. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
    4. Aktualisieren Sie NMM jeden zweiten Tag bis zum 20. Tag.
    5. Ab Tag 20 kultivierten neuronale Rosetten in 0,5 ml Zytokin erschöpftes NMM, um eine Differenzierung zu ermöglichen. Aktualisieren Sie das Medium alle 2-3 Tage.
    6. An Tag 30 und Tag 40 (10 oder 20 Tage der Differenzierung) fixieren Sie die Rosetten mit 0,5 ml 4% PFA, 20 min, RT.
  3. PC-Biogenese und Funktionsanalyse an isolierten NSPCs
    1. NSPC-Dissoziation
      1. Schneiden Sie neuronale Rosetten aus Schritt 1.1.8 in einem gitterartigen Muster mit einer Nadel und entfernen Sie die Cluster mit einem Zellschaber. Die Zellen in PO/lam-beschichtete 35 mm Schalen in 2 mL NMM überführen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
      2. Aktualisieren Sie NMM jeden zweiten Tag bis zur Konfluenz (ca. 5-7 Tage).
      3. Nachdem Sie die großen, klaren Zellen, die neuronale Rosetten umgeben, abgekratzt haben, pflücken Sie sie manuell und übertragen Sie sie auf frische PO / lam-beschichtete 35-mm-Schalen, um sich für NSPCs anzureichern und nicht-neurale Zelltypen zu erschöpfen.
      4. Nach ein oder zwei manuellen Passagen (bei Bedarf Schritt 1.3.1.3 wiederholen), die erforderlich sind, um alle kontaminierenden Zelltypen zu entfernen, entfernen Sie das Medium und spülen Sie es mit PBS ab.
      5. 300 μL 0,05% Trypsin zugeben und 5 min bei 37 °C inkubieren, bis sich die meisten Zellen lösen.
      6. Fügen Sie 2 ml des Mediums hinzu, das 10% FBS (DMEM + 10% FBS) enthält, um das Trypsin zu inaktivieren. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig dreimal nach oben und unten, um die Zellklumpen aufzubrechen.
      7. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
      8. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig und resuspen sie die Zellen in NMN.
      9. Die dissoziierten NSPCs als Einzelzellen (1 x 105 Zellen/cm2) in NMM auf PO/lam-beschichtete Schalen aussäen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
      10. Erweitern Sie NSPCs in NMM, indem Sie das Medium jeden zweiten Tag wechseln.
        HINWEIS: NSPCs werden mit hoher Dichte ausgesät, um eine Differenzierung zu vermeiden.
    2. PC-Biogenese-Analyse
      1. Saatgut dissoziierte NSPCs bei 100.000 Zellen/cm2 und inkubierte sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 in NMM für 2 Tage.
      2. Aspirieren Sie das Medium und verhungern Sie NSPCs in zytokinarmem Medium (NSPC-Hungermedium, Supplemental Table 1) für 48 h.
      3. Fixieren Sie NSPCs mit 4% PFA für 20 min bei RT.
      4. Vor der Immunfärbung zweimal mit PBS für 5 min bei RT waschen.
    3. PC-Funktionsanalyse: SHH-Signalweg
      1. Saatgut dissoziierte NSPCs bei 100.000 Zellen/cm2 auf PO/lam-beschichteten 8-Well Chamber Slides (300 μL) oder T25 Schalen (5 ml) und inkubiert in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 in NMM für 2 Tage.
      2. Verhungern von NSPCs im NSPC-Hungermedium (300 μL pro Vertiefung des 8-Well-Kammerobjektträgers und 5 ml im T25-Kolben) für 48 h.
      3. Um den SHH-Signalweg zu induzieren, inkubieren Sie die NSPCs mit dem Hungermedium, das mit rekombinantem SHH (100 ng / ml) oder SAG (500 nM) ergänzt wird. (150 μL pro Vertiefung eines 8-Well-Kammerobjektträgers und 2 ml im T25-Kolben) für 24 h.
      4. Fixieren Sie NSPCs, die auf 8-Well-Kammerobjektträgern kultiviert wurden, in 250 μL 4% PFA pro Vertiefung für 20 min bei RT und waschen Sie sie zweimal mit 250 μL PBS für 5 min bei RT, bevor Sie die Immunfärbungsanalyse durchführen.
      5. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie NSPCs, die in T25-Schalen kultiviert wurden, mit PBS.
      6. 500 μL 0,05% Trypsin zugeben und 5 min bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen lösen.
      7. Fügen Sie 2 ml Medium mit 10% FBS (DMEM + 10% FBS) hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 mL konischen Röhrchen.
      8. Zentrifugiere 300 x g für 5 min und sauge den Überstand vorsichtig ab, um NSPC-Pellets zu erhalten, die vor der RNA-Extraktion und RT-PCR-Analyse bei -80 °C kryokonserviert werden können.

2. Bildung von dorsalen Vorderhirn-Organoiden

  1. Einzelzellkultur von hIPSCs
    1. Beginnen Sie mit hIPSC-Kulturen, die große regelmäßige Kolonien beherbergen, die weniger als 10% Differenzierung aufweisen und fast einmal durchquert wurden. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht mehr als 80% konfluent sind.
    2. Waschen Sie die Kolonien mit 2 ml PBS.
    3. 500 μL Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) zugeben und 5 bis 7 min bei 37 °C inkubieren.
    4. Aspirieren Sie das GCDR und fügen Sie 2 ml mTeRS1-Medium hinzu, das mit 5 μM Y-27632 ergänzt wird.
    5. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig 10 Mal auf und ab, um alle Kolonien in einzelne Zellen zu dissoziieren.
    6. Übertragen Sie die Zellen auf vitronectin-beschichtete Schalen und inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
      HINWEIS: Führen Sie vor dem Differenzierungsexperiment mindestens 1 Passage der hIPSCs mit GCDR durch, um die hIPSCs an Einzelzellkulturbedingungen anzupassen.
  2. Lassen Sie hIPSCs an Tag 0 embryonale Körper in EB-Medium bilden, die eine niedrige Konzentration von FGF2 und eine hohe Konzentration an Gesteinsinhibitor enthalten, die für das Überleben von hIPSC erforderlich ist. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.
    1. Waschen Sie die Kolonien mit 2 ml PBS.
    2. 500 μL Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) zugeben und 5 bis 7 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Aspirieren Sie den GCDR und fügen Sie 1 ml EB-Medium hinzu, ergänzt mit 50 μM Y-27632; Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um die Zellen vorsichtig zu lösen und in ein konisches 15-ml-Rohr zu übertragen.
    4. Spülen Sie noch einmal mit 2 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632, und übertragen Sie die verbleibenden Zellen in das konische 15-ml-Rohr. Sofort 3 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632, in das konische Rohr geben und die Lösung mit einer 5-ml-Pipette vorsichtig homogenisieren.
    5. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 100 x g für 5 min.
    6. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig und resuspenieren Sie die Zellen in 6 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632.
    7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 100 x g für 5 min.
    8. Aspirieren Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen in 1 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632. Verwenden Sie eine 1 ml Pipette, um die Zellen sanft in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren.
    9. Unmittelbar nach der Wiederverwendung der Zellen verdünnen und zählen.
    10. Verdünnen Sie das richtige Volumen der Zellsuspension (mit 900.000 Zellen) auf 30 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632 und 4 ng/ml bFGF, und mischen Sie die Lösung vorsichtig.
    11. Platte 9.000 Zellen/Well in eine 96U-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz (300 μL/Well). Um eine störende EB-Bildung zu vermeiden, inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 bis Tag 3 ohne mittlere Veränderung.
  3. Neuronale Induktion (Duale SMAD-Hemmung)
    1. Stellen Sie an Tag 3 sicher, dass EBs 300-400 μm messen und regelmäßige Grenzen anzeigen. Wenn beide Kriterien erreicht sind, ersetzen Sie die Hälfte des Mediums (150 μL) durch Induktionsmedium-1, das Dual-SMAD-Inhibitoren enthält, was zu einer Aufhellung der Kontur der EBs an Tag 6 bis Tag 7 führt, was auf eine neuroektodermale Differenzierung hinweist (ergänzende Tabelle 2).
    2. Ersetzen Sie an Tag 4 3/4 des Mediums (225 μL) durch Induktionsmedium-1.
    3. An Tag 6 und Tag 8: Die Hälfte des Induktionsmediums-1 (150 μL) auffrischen.
  4. Organoid-Einbettung in die Basalmembranmatrix (Tag 10)
    1. Am Tag 10 betten EBs in die wachstumsfaktorreduzierte Basalmembranmatrix (BMM) ein.
      HINWEIS: Verwenden Sie in diesem Schritt immer eine sterile Schere, um die Öffnung der Pipettenspitzen zu schneiden, um eine Beschädigung der Organoide durch wiederholtes Pipettieren zu vermeiden.
    2. Zunächst werden etwa 15-17 Organoide in konische Röhrchen übertragen. Lassen Sie die EBs sich absetzen und entfernen Sie das Medium. 50 μL Induktionsmedium-2 zugeben und in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μL BMM überführen.
    3. Verteilen Sie das Matrix-EB-Gemisch auf die Mitte einer Vertiefung einer Ultra-Low-Attachment-Platte und trennen Sie die EBs, um ein Verschmelzen zu verhindern.
    4. Lassen Sie das BMM im Inkubator bei 37 °C für 45 min erstarren.
    5. Fügen Sie 3 ml des Induktionsmediums-2 in jede Vertiefung hinzu und legen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO2.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass dieser Vorgang so schnell wie möglich durchgeführt wird, da BMM bei Raumtemperatur erstarrt.
  5. Stationäre Kultur von Organoiden, die in die Basalmembranmatrix eingebettet sind
    1. Tag 12, 14: Induktion mittel-2 auffrischen.
    2. Tag 16: Induktionsmedium-2 aktualisieren und unter dem Mikroskop die Ausdehnung neuroepithelialer Schleifen überprüfen.
  6. Basalmembranmatrixdissoziation und Kultur auf einem Orbitalschüttler
    1. Dissoziieren Sie an Tag 17 Organoide von BMM, indem Sie 10 Mal mit einer 5-ml-Pipette auf und ab pipettieren und in differenzierungsmedium-1 (ohne Vitamin A) übertragen. Inkubieren Sie auf einem Orbitalschüttler mit 80 U / min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO2 , um die Nährstoffaufnahme zu verbessern.
      HINWEIS: Verwenden Sie einen anderen Inkubator für die stationäre Kultur und die Kultur auf einem Orbitalschüttler, um Vibrationen zu vermeiden, die für das Wachstum der anhaftenden hIPS-Zellen schädlich sind.
    2. Tag 19: Differenzierung mittel-1 auffrischen.
    3. Tag 21: Differenzierungsmedium-1 in Differenzierungsmedium-2 (mit Vitamin A) ändern.
    4. Von Tag 23 bis Tag 35: Erfrischen Sie Medium mit Differenzierung Medium-2 alle 2-3 Tage.
    5. Von Tag 35 bis Tag 70: Differenzierungsmedium-2 mit 1% BMM auffrischen und alle 2-3 Tage auffrischen.
    6. Sammeln Sie die Organoide nach 28, 42 und 70 +/- 2 Tagen der Differenzierung und fixieren Sie sie über Nacht bei 4 ° C, in 5 ml 4% PFA auf einem 15 ml konischen Röhrchen.
    7. Für eine weitere Toto - oder freischwebende Immunstaining-Analyse werden Organoide dann zweimal in PBS gespült und bei 4 °C in PBS + 0,05% Natriumazid konserviert.
    8. Für die Immunfärbungsanalyse an gefrorenen Abschnitten tauchen Sie 4% PFA-fixierte Organoide in 10 ml 30% Saccharose bei +4 °C ON (oder bis die Organoide sinken). In eine gefrorene Einbettungsmatrix einbetten und bis zur Kryosektion bei -80°C lagern.

3. In toto Immunomarkierung, Clearing und Lightsheet-Akquisition von dorsalen Vorhirn-Organoiden

  1. Fixierung
    1. Sammeln Sie die Organoide in 6-Well-Platten, entfernen Sie das Medium und fixieren Sie sie mit 2 ml 4% PFA bei 4 ° C über Nacht.
    2. Führen Sie drei Wäschen in 2 ml PBS bei Raumtemperatur durch.
    3. Die Organoide in 2 ml Röhrchen überführen und bei 4 °C in 2 mL PBS + 0,05% Natriumazid lagern.
  2. Permeabilisierung
    1. Inkubieren Sie Organoide in 1 ml PBS mit 0,2% Triton X100 bei RT für 1 h. Tun Sie dies zweimal.
    2. Über Nacht in 1 ml PBS mit 0,2 % Triton X100 und 20 % DMSO bei 37 °C inkubieren.
    3. Über Nacht in 1 ml PBS mit 0,1 % Tween20, 0,1 % Triton X100, 0,1 % Desoxycholat, 0,1 % NP40 und 20 % DMSO inkubieren.
    4. Inkubieren in 1 ml PBS mit 0,2% Triton-X100, bei RT, für 1 h. Tun Sie dies zweimal.
  3. Blockierung und Immunmarkierung
    1. Blockierung in 1 ml Blockierungslösung (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Eselserum, 10% DMSO), bei 37 °C, ON.
    2. Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, verdünnt in 250 μL PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/ml Heparin, 5% DMSO und 3% Eselserum, bei 37 °C, für 2 Tage.
    3. 1 ml PBS mit 0,2 % Tween20 und 0,1 μg/ml Heparin wird für 1 h bei 37 °C gewaschen. Tun Sie dies viermal.
    4. 1 ml PBS mit 0,2 % Tween20 und 0,1 μg/ml Heparin über Nacht bei 37 °C waschen.
    5. Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, verdünnt in 250 μL PBS, die 0,2% Tween 20, 0,1 μg/ml Heparin und 3% Eselserum enthalten, bei 37 °C, für 2 Tage.
    6. 1 ml PBS mit 0,2 % Tween 20 und 0,1 μg/ml Heparin wird für 1 h auf einem Rad bei RT gewaschen. Tun Sie dies viermal.
    7. 1 ml PBS mit 0,2 % Tween 20 und 0,1 μg/ml Heparin über Nacht auf einem Rad bei RT waschen.
    8. Waschen Sie in 1 ml PBS, für 24 h, bei RT.
    9. Bei +4 °C in 1 ml PBS und 0,05% Natriumazid bis zur Klärung lagern.
  4. Clearing in TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Inkubieren Sie die Organoide in 1 ml 30% TDE (3 ml TDE + 7 ml PBS) für 24 h bei RT.
    2. Inkubieren sie in 1 ml 60% TDE (6 ml TDE + 4 ml PBS) für 24 h bei RT.
    3. Inkubieren Sie in 1 ml 80% TDE (8 ml TDE + 2 ml PBS) für 24 h bei RT.
  5. Organoideinbettung vor der Erfassung von Lichtblechen
    HINWEIS: Verwenden Sie ein maßgeschneidertes System; hergestellt mit einer 1 ml Spritze mit der Spitze, die mit einem Skalpell geschnitten ist.
    1. 100 ml 4% ige niedrigschmelzende Agarose in 60% TDE-Lösung und Aliquot in 2 mL Röhrchen zubereiten. Konservieren bei +4 °C.
    2. Vor der Organoideinbettung ein Röhrchen mit 1,5 ml 4% niedrigschmelzender Agarose in 60% TDE in einem Wasserbad bei 37 °C vorheizen, bis es sich verflüssigt.
    3. Bereiten Sie in der Zwischenzeit ein maßgeschneidertes Formsystem aus einer 1-ml-Spritze vor, deren Spitze mit einem Skalpell abgeschnitten wird.
    4. Pumpen Sie die Spritze 600 μL der Gellösung mit dem Kolben ein.
    5. Positionieren Sie die Probe mit einer vergrößerten Pipettenspitze, deren Öffnung mit einer sterilen Schere geschnitten wurde.
    6. Füllen Sie die Spritze mit 400 μL Gellösung, so dass die Probe im unteren Drittel der Spritze positioniert ist.
    7. Lassen Sie das Gel polymerisieren und lagern Sie es in 80% iger TDE-Lösung bei 4 °C lichtgeschützt bis zur Aufnahme.
    8. Verwenden Sie für die Erfassung von Lichtbögen ein 20-faches Objektiv, das in 80% TDE-Lösung eingetaucht ist, die in die Probenkammer gegeben wird, um eine genaue Anpassung an den Brechungsindex der Clearing-Methode zu ermöglichen.
    9. Führen Sie die Spritze, die das in Agarose eingebettete Organoid enthält, in den größten Probenhalter ein, der für eine 1-ml-Spritze ausgelegt ist, deren Kolben betätigt werden kann, um das Organoid vor dem Objektiv zu positionieren.
      HINWEIS: Die Erfassung eines ganzen Organoids durch lichte Blätter dauert ca. 5 bis 10 min.

4. Immunfärbung und Beseitigung frei schwebender Abschnitte dorsaler Organoide des Vorderhirns

  1. Fixierung, Agarose-Einbettung und Schnittung der Organoide
    1. Organoide nach 28, 42 und 70 +/- 2 Tagen der Differenzierung in einer 6-Well-Platte sammeln und über Nacht bei 4 °C in 2 ml 4% PFA fixieren.
    2. Zweimal in 2 mL PBS abspülen und bei 4 °C in 2 mL PBS + 0,05% Natriumazid konservieren.
    3. Die fixierten Organoide in 4% niedrigschmelzende Agarose in einer Kunststoffeinbettungsform (7 x 7 mm) einbetten. Entfernen Sie den Agaroseblock vorsichtig aus der Kunststoffform und kleben Sie ihn auf die Vibratomstufe.
    4. Schneiden Sie die eingebetteten Organoide mit einem Vibratom, um 150 μm freischwebende Abschnitte zu erhalten, die in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 500 μL PBS mit einem Pinsel übertragen werden, um eine Beschädigung der Abschnitte zu vermeiden.
      HINWEIS: Niedrigschmelzende Agarose wird empfohlen, da ihre Schmelztemperatur nur etwa 60 °C beträgt. 4% niedrigschmelzende Agarose in PBS-Lösung zubereiten und vor der Organoideinbettung knapp über 37 °C in einem Wasserbad abkühlen lassen.
  2. Permeabilisierung, Blockierung und Immunfärbung
    1. Inkubieren Sie die Abschnitte in 500 μL PBS, die 0,3% Triton X100 enthalten, bei RT, unter Rühren, für 20 min. Tun Sie dies dreimal.
    2. Inkubieren Sie die Abschnitte in 500 μL PBS, die 0,3% Triton X100 und 5% fettfreie Milch enthalten, bei RT, unter Rühren, für 2 h.
    3. Inkubieren Sie die Abschnitte in 250 μL primärer Antikörperlösung (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% fettfreie Milch) unter Rühren bei +4 °C über Nacht.
    4. Waschen Sie die Abschnitte in 500 μL PBS, bei RT, unter Rühren, für 20 min. Tun Sie dies viermal.
    5. Inkubieren Sie die Abschnitte in 250 μL sekundärer Antikörperlösung (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% fettfreie Milch) bei RT unter Rühren für 2 h.
    6. Waschen Sie die Abschnitte in 500 μL PBS, bei RT, unter Rühren, für 20 min. Tun Sie dies viermal.
    7. Lagern Sie die Abschnitte in 500 μL PBS bei +4 ° C bis zur Klärung.
  3. Clearing in TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Inkubieren Sie die Abschnitte in 500 μL von 30% und 60% TDE für jeweils 1 h bei RT und dann in 500 μL von 80% TDE über Nacht bei RT.
    2. Lagern Sie die geräumten Abschnitte in 500 μL 80% TDE bis zur Aufnahme bei +4 °C.
  4. Montage von frei schwebenden Abschnitten vor der Erfassung mit resonanter Konfokalkamera
    1. Montieren Sie einen frei schwebenden Abschnitt in einer versiegelten Kammer, die es ermöglicht, die Probe in 80% TDE-Lösung zu halten, und die so konzipiert ist, dass sie sich an eine motorisierte XY-Stufe konfokaler Mikroskope anpasst.
    2. Legen Sie einen runden Deckglas in das Kammersystem.
    3. Übertragen Sie den geklärten immungefärbten Abschnitt vorsichtig mit einem Pinsel.
    4. Füllen Sie die Kammer mit 80% TDE-Lösung.
    5. Fügen Sie zwei Standard-Deckgläser sowie einen zweiten runden Deckglas und eine Silikondichtung hinzu.
    6. Schrauben Sie den Schraubring der Kammer auf, um das System perfekt abzudichten.

5. Lichtblatt- und Resonanz-Scanning-Konfokalanalyse

  1. Verarbeiten Sie Lichtblatt- und Resonanzscanning-Aufnahmen mit einer Software, die eine 3D-Visualisierung und -Analyse der gesamten immungefärbten Probe ermöglicht.
    HINWEIS: Eine solche Software ermöglicht es, schnell riesige Daten zu öffnen, um auf einfache Weise Schnappschüsse und Animationen zu erstellen. Es ermöglicht das Verschieben der Probe in verschiedenen Ausrichtungen und das Generieren von 2D-Ansichten dank eines 2D-Slicer-Werkzeugs in verschiedenen Ausrichtungen, z. B. XY und YZ.
  2. Für die automatische Erkennung von Zentrosomen und primären Zilien verwenden Sie einen Spot-Assistenten, der es ermöglicht, ihre Anzahl unter pathologischen im Vergleich zu Kontrollbedingungen zu quantifizieren.
  3. Für die 3D-Rekonstruktion des PCs, die eine präzise Messung ihrer Länge ermöglicht, verwenden Sie einen Filamentassistenten, um den Ausgangspunkt des PCs manuell zu fixieren, und die Software verwendet das Fluoreszenzsignal, um den PC präzise zu rekonstruieren.

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Representative Results

Zellbasierte 2D-hIPS-Modelle zur Untersuchung der primären Cilium-Biogenese und -Funktion
Das hier beschriebene Protokoll wurde aus zuvor veröffentlichten Studien angepasst20,21,22. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung von neuronalen Rosettenstrukturen, die neokortikale Vorläufer und Neuronen enthalten, die denen im sich entwickelnden Neokortex ähneln. Eine detaillierte Validierung kann durch konventionelle Immunstaining-Analyse mit spezifischen Herstellern durchgeführt werden3. Zum Beispiel sollten apikale Vorläufer (AP) mit SOX2 und PAX6 doppelt gefärbt werden, intermediäre Vorläufer (IP) durch TBR2 / EOMES-Färbung und frühgeborene neokortikale Neuronen durch CTIP2-Färbung (Abbildung 1A-C). Solche neuronalen rosettenartigen Strukturen modellieren die interkinetische Kernmigration (INM) von AP, die durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen Phospho-Vimentin, das mitotische Kerne färbt, und TPX2, das die mitotische Spindel färbt, visualisiert werden kann. Diese Marker ermöglichen daher die Analyse mehrerer Merkmale von AP, einschließlich des INM mit Zellteilung, das apikal um das zentrale Lumen herum stattfindet (Abbildung 1D, D'), sowie des Teilungsmodus, der durch Messung des Winkels zwischen der Teilungsebene und der apikalen Oberfläche bestimmt wird. Schließlich kann die Ziliogenese durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen PCNT, die den Basalkörper von PC färben, und ARL13B, das das Axonem färbt, analysiert werden. Auf solchen Rosettenstrukturen erstrecken sich PC vom apikalen Pol von APs in das zentrale Lumen jeder ventrikelartigen Region (Abbildung 1E,E'), während sie auch aus CTIP2+-Neuronen herausragen (Abbildung 1E'').

Die Dissoziation dieser Rosettenstrukturen ermöglicht die Gewinnung isolierter NSPCs, die auf Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten Kulturplatten in NMM mit einer hohen Dichte kultiviert werden, um die Aufrechterhaltung einer stabilen und erweiterbaren Population von NSPCs für mindestens 15 Passagen zu ermöglichen, ohne Karyotyp-Anomalien zu akkumulieren21,27. Um die PC-Biogenese zu analysieren, werden dissoziierte NSPCs bis zum Zusammenfluss kultiviert und für 48 h verhungert. Immunfärbungsanalysen mit Antikörpern, die gegen PC-Marker erhoben wurden, zeigen, dass diese NSPCs PC enthalten (Abbildung 2A). Durch die Kombination von zwei komplementären Open-Source-Tools, Ilastik, einem auf maschinellem Lernen basierenden Bildanalysetool, das für die PC-Segmentierung28 nützlich ist, und CiliaQ, einem Fiji/ImageJ-Plugin-Paket29, das eine 3D-Rekonstruktion des PCs aus konfokalen 3D-Bildstapeln ermöglicht, können mehrere Strukturparameter einfach ausgewertet werden, einschließlich der Anzahl der PCs und ihrer Länge.

Die PC-Funktion von NSPCs kann auch durch Testen der Transduktion des Hedgehog-Signalwegs bewertet werden. Um die Transduktion des SHH-Signalwegs zu beurteilen, werden NSPCs für 48 h ausgehungert und 24 h lang mit rekombinantem SHH (rSHH) oder einem geglätteten Agonisten (SAG) behandelt. Unter Verwendung von Antikörpern, die gegen GPR161, SMO und GLI2 aufgebracht wurden, ermöglicht die Immunfluoreszenzanalyse (IF) das Testen des Transports dieser wichtigen SHH-Signalgeber entlang des PC, wobei GPR161 normalerweise den PC verlässt, während gli2 und SMO sich im PC als Reaktion auf die Aktivierung des SHH-Signalwegs ansammeln (Abbildung 2C-D). Die Analyse von konfokalen 3D-Bildstapeln mit CiliaQ-Werkzeugen ermöglicht die Quantifizierung des GPR161-Austritts aus dem PC sowie der GLI2- und SMO-Akkumulation im PC nach der Aktivierung des SHH-Signalwegs (Abbildung 2F-G). Darüber hinaus zeigt die semi-quantitative RT-PCR-Analyse an mRNA, die aus rSHH- oder SAG-behandelten NSPCs extrahiert wurde, die Induktion von zwei SHH-Zielgenen, GLI1 und PTCH1, die eine normale SHH-Signaltransduktion in NSPCs aus Kontroll-hIPSCs attestieren (Abbildung 2B).

Insgesamt reproduzieren 2D-zellbasierte Modelle der Entwicklung des dorsalen Vorderhirns eindeutig mehrere Aspekte der normalen Entwicklung der Großhirnrinde und stellen vielversprechende Werkzeuge dar, um PC-assoziierte Mechanismen zu sezieren, die Anomalien der neokortikalen Entwicklung unter Verwendung von Kontroll- im Vergleich zu Patienten-hIPSCs zugrunde liegen, die Mutationen in Genen beherbergen, die für menschliche Entwicklungsanomalien der Großhirnrinde verantwortlich sind.

Zellbasierte 3D-hIPS-Modelle zur Untersuchung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung
Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 3A) wurde von den zuvor veröffentlichten Protokollen 23,24,25,26,30 angepasst und erfolgreich auf fünf verschiedenen hIPSC-Kontrolllinien getestet. Es ermöglicht die Erzeugung von hIPSC-abgeleiteten dorsalen Vorderhirn-Organoiden, die im Laufe der Zeit an Größe zunehmen und gleichzeitig große neuroepitheliale Schleifen bilden (Abbildung 3B). Immunmarkierungsanalysen entweder an organoiden Kryosektionen (Kryostat, 20 μm), frei schwebenden Abschnitten (Vibratom, 150 μm) oder in toto können für Qualitätskontrollen durchgeführt werden. An Tag 28 ± 2 bestehen Organoide aus stratifizierten neuroepithelialen Schleifen, die den neuronalen Vorläufermarker SOX2 und den dorsalen Vorderhirnmarker PAX6 koexprimieren und die dorsale Vorderhirnidentität bestätigen. An Tag 42 ± 2 (6 Wochen Differenzierung) sollten diese Schleifen eine komplexere geschichtete Organisation aufweisen. Von der apikalen bis zur basalen Oberfläche dieser Schleifenstrukturen kann eine ventrikuläre Zone (VZ)-ähnliche Region mit SOX2/PAX6-positiven apikalen radialen glialen Vorläufern (aRG) sowie eine subventrikuläre Zone (SVZ)-ähnliche Region mit TBR2-positiven intermediären Vorläufern (IPs) und einer kortikalen Platten(CP)-ähnlichen Region, die CTIP2-positive frühgeborene neokortikale Neuronen enthält, abgegrenzt werden (Abbildung 3C, E). Die apikale Molekülpolarität von aRG kann durch die apikale Anreicherung an der ventrikulären Oberfläche von ZO-1 und N-CADH bewertet werden (Abbildung 4A, Video 1). Die Eigenschaften der aRG-Vorläuferteilung können mit TP2X- und P-VIM-Markern bewertet werden, um INM zu analysieren, was normalerweise zur Ausrichtung von aRG-Mitotikkernen an der ventrikulären Oberfläche der kortikalen Schleifen führt (Abbildung 4B, Video 2). Eine solche Immunmarkierung ermöglicht auch die Messung des Teilungswinkels, um den symmetrischen versus asymmetrischen Teilungsmodus von aRG zu bewerten. P-Vim-positive Vorläufer können auch in der SVZ-ähnlichen Region beobachtet werden und beherbergen einen einzigartigen basalen Prozess, der sich bis zur Basaloberfläche erstreckt und an äußere radiale Glia erinnert (oRG oder basale radiale Glia, Abbildung 4C, Video 2). Während sie an Den Organoiden von Tag 42 fehlen, sollten SATB2-positive spätgeborene Neuronen ab Tag 70 (10 Wochen der Differenzierung) nachgewiesen werden (Abbildung 3D, F), was ein in vivo-ähnliches Timing der neokortikalen neuronalen Differenzierung bestätigt.

Immunmarkierungsexperimente mit basalen Markern (Gamma Tubulin) und Axonem (ARL13B) ermöglichen die Visualisierung von PC auf 20 μm Kryosektionen (Abbildung 3G,H). Um die Vorteile der 3D-Organisation von dorsalen Organoiden des Vorderhirns zu nutzen, kann eine Immunfärbung des gesamten Mounts durchgeführt werden. Die Erfassung solcher in toto immungefärbten und gereinigten Organoiden ermöglicht den Nachweis sowohl von Zentrosomen als auch von PC auf allen NSPC-Typen sowie auf neokortikalen Neuronen (Video 3). Um genauere Analysen der PC-Biogenese durchzuführen, kann außerdem eine immunhistochemische Analyse an frei schwebenden dicken Abschnitten (150 μm) dorsaler Vorderhirn-Organoide durchgeführt werden. Nach der Klärung können solche Schnitte mit einem 40x (NA 1.3) oder 63x (NA 1.4) Ölobjektiv eines inversen resonanten Weißlicht-Konfokal-Lasermikroskops erfasst werden, wodurch die Auflösung verbessert und gleichzeitig die räumliche 3D-Information von Organoiden erhalten bleibt. Ein solches konfokales Laserscanning-Mikroskop ermöglicht die schnelle Erfassung dicker Schnitte mit einer präzisen und flexiblen Anregung und Erkennung ohne Störungen (Video 4). Mehrere Strukturelle Parameter des PCs können mit einer 3D-Bildgebungssoftware ausgewertet werden, einschließlich PC-Nummer, Länge und Ausrichtung. Dedizierte Open-Source-, frei verfügbare Tools wie Ilastik28, ein auf maschinellem Lernen basierendes Bildanalyse-Tool sowie das CiliaQ-Plugin-Paket auf Fiji/ImageJ29 sind sehr nützlich für die automatische PC-Segmentierung, die eine anschließende qualitative und quantitative Analyse der PC-Biogenese und -Funktion im Vergleich zu pathologischen Bedingungen ermöglicht.

Figure 1
Abbildung 1: Erzeugung und Charakterisierung von neuronalen 2D-Rosetten. Immunhistochemische Charakterisierung neuronaler Rosettenstrukturen unter Verwendung von (A) SOX2- und PAX6-Antikörpern zum Nachweis von AP, (B) TBR2/EOMES zur Aufdeckung von IP und (C) CTIP2 zur Färbung frühgeborener neokortikaler Neuronen. Proliferierende AP werden mit Phospho-Vimentin- und TPX2-Antikörpern nachgewiesen und befinden sich an der apikalen Oberfläche (D,D'). PC werden durch doppelte Immunfärbung mit PCNT- und ARL13B-Antikörpern nachgewiesen. PC erstrecken sich von jedem AP in das zentrale Lumen jeder Rosette, während sie auch auf IP und frühgeborenen Neuronen (E, E', E'') nachgewiesen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Isolierte NSPCs, die von neuronalen 2D-Rosetten abgeleitet sind, beherbergen funktionsfähige PCs. Die Dissoziation von 2D-neuronalen Rosetten führt zu isolierten NSPCs, die PC beherbergen, nachdem sie 48 h lang verhungert sind, wie ARL13B und PCNT Immunostaining (A) zeigen. NSPCs beherbergen funktionellen PC, wie die RT-PCR-Quantifizierung von zwei SHH-Zielgenen GLI1 und PTCH1 nach 48 h Hunger und anschließender Aktivierung des Signalwegs durch Behandlung mit rekombinantem SHH (rSHH) für 24 h ergab. GLI1 - und PTCH1-Expressionsdaten wurden dreifach durchgeführt und auf ACTB-Expressionsdaten normalisiert. Die Daten wurden mit der 2−ΔΔCt-Methode analysiert und als relative Expression ± REM (Mann-Whitney-Test) (B) dargestellt. IF-Analyse an ausgehungerten NSPCs mit (D) oder ohne (C) rSHH-Behandlung, um die Dynamik von zwei entscheidenden Akteuren des SHH-Signalwegs, GLI2 und GPR161, zu testen, die sich nach der Aktivierung des SHH-Signalwegs ansammeln oder den PC verlassen. Durch die Kombination von Ilastik- und CiliaQ-Werkzeugen für die Analyse konfokaler Bilder wurde die Signalintensität von GPR161 (F) und GLI2 (G) in PC in +/- rSHH-behandelten NSPCs verglichen. ARL13B-Färbung wurde für die PC-Segmentierung verwendet, und wie erwartet blieb die PC-Länge in +/- rSHH-behandelten NSPCs (E) unverändert. Die Daten werden in Box- und Whisker-Plots (Mittelwerte ± SEM) zusammengefasst. p < 0,0001 (Mann-Whitney-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Erzeugung und Charakterisierung dorsaler Vorhirn-Organoide. (A) Schematischer Überblick über das Protokoll zur Erzeugung dorsaler Organoide des Vorderhirns. (B) Repräsentative Hellfeldbilder von Organoiden an den Tagen 1, 3, 7, 24 und 42 der Differenzierung. Konfokale Bilder von 20 μm Kryosektionen von Organoiden am Tag 42 (C) und 70 (D) nach Immunfärbung mit SOX2-, TBR2- und CTIP2-Antikörpern, die jeweils die ventrikuläre Zone (VZ), die subventrikuläre Zone (SVZ) mit TBR2-positiver IP und die preplate-ähnliche Region (CP) mit CTIP2-positiven frühgeborenen neokortikalen Neuronen abgrenzen. Konfokale Bilder von 20 μm Kryosektionen von Organoiden an Tag 42 (E) und 70 (F) nach Immunfärbung mit PAX6-, CTIP2- und SATB2-Antikörpern, die das Auftreten von SATB2-positiven spätgeborenen Neuronen am Tag 70 zeigen. Konfokale Bilder von 20 μm Kryosektionen eines Organoids am Tag 42 nach Immunfärbung mit ARL13B- und PCNT-Antikörpern, die PC am apikalen Pol radialer glialer Vorläufer (G) zeigen, während sie auch auf CTIP2-positiven Neuronen (H) vorhanden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: 3D-Bildgebung dorsaler Vorhirn-Organoide. (A) Leichte Blatterfassung eines gesamten dorsalen Vorderhirn-Organoids (Tag 42), gefärbt mit PAX6-, N-CADH- und CTIP2-Antikörpern, die die multiplen neuroepithelialen Schleifen mit PAX6-positiven radialen Glia-Vorläufern zeigen, die eine korrekte apikobasale Polarität aufweisen, wie die Akkumulation von N-Cadherin an ihrer apikalen Seite und CTIP2-positive frühgeborene neokortikale Neuronen zeigen, die eine preplatartige Region abgrenzen. (B) Lichtblattaufnahme eines gesamten dorsalen Vorderhirn-Organoids (Tag 42), das mit TPX2-, P-Vim- und CTIP2-Antikörpern gefärbt ist und die interkinetische Kernmigration ventrikulärer radialer Glialvorläufer veranschaulicht. (C) Zoomen Sie auf das Lichtblatt, das ein gesamtes dorsales Vorderhirn-Organoid (Tag 42) aufnimmt, das mit TPX2- und P-Vim-Antikörpern gefärbt ist und einen Vorläufer zeigt, der einen einzigartigen basalen Prozess verlängert und in der subventrikulären Zone lokalisiert ist und an einen äußeren radialen glialen Vorläufer erinnert. (D) Resonant Scanner Erfassung eines 150 μm Abschnitts eines dorsalen Vorderhirn-Organoids (Tag 42), gefärbt mit PCNT- und ARL13B-Antikörpern, die PC in NSPCs und neokortikalen Neuronen zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Generierung und Charakterisierung von 2D- und 3D-hIPS-zellbasierten Modellen der dorsalen Vorderhirnentwicklung zur Dissektion der PC-Beteiligung an der Pathophysiologie zerebraler kortikaler Anomalien. hIPS-Zellen dürfen embryoide Körper (EBs) zu Kulturplatten mit geringer Adhäsion bilden und dann in ein Induktionsmedium inkubiert werden, das duale SMAD-Inhibitoren enthält, um eine neuroektodermale Differenzierung zu induzieren. Die Adhäsion von EBs in PO/Lam-beschichtete Schalen ermöglicht die Erzeugung von 2D-neuronalen Rosettenstrukturen, während die frei schwebende Kultur von EBs mit anschließender Einbettung in BMM die Erzeugung dorsaler Vorderhirnorganoide ermöglicht. Der Entzug mitogener Faktoren aus dem adhärenten neuronalen Rosettenmedium fördert den Beginn der Neurogenese, die durch IF-Analyse getestet werden kann. Die Dissoziation von adhärenten neuronalen Rosetten ermöglicht die Erzeugung isolierter NSPC-Kulturen, die für die PC-Biogenese und Funktionsanalyse nützlich sind. Dorsale Vorderhirn-Organoide werden nach 4, 6 oder 10 Wochen der Differenzierung gesammelt und für die anschließende Immunfärbungsanalyse entweder in Toto, auf 150 μm dicken Abschnitten oder 20 μm Kryosektionen fixiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Lichtblattaufnahme eines gesamten dorsalen Vorderhirn-Organoids (Tag 42), das mit PAX6-, CTIP2- und NCADH-Antikörpern immungefärbt wurde. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Lichtblatterfassung eines gesamten dorsalen Vorderhirn-Organoids (Tag 42), das mit TPX2-, P-VIM- und CTIP2-Antikörpern immungefärbt wurde. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 3: Lichtblatterfassung eines gesamten dorsalen Vorderhirn-Organoids (Tag 42), das mit PCNT- und ARL13B-Antikörpern immunogefärbt wurde. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 4: Resonant scanning confocal acquisition of a 150 μm section of a dorsal forebrain organoid (Day 42) immunostained with ARL13B and PCNT antibodies. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

ERGÄNZENDE DATEIEN: Bitte klicken Sie hier, um die Tabellen herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Rezeptur der Medien, die für die Erzeugung von 2D-neuronalen Rosetten und NSPCs verwendet werden.

Ergänzende Tabelle 2: Rezeptur der Medien, die zur Erzeugung dorsaler Organoide des Vorderhirns verwendet werden.

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Discussion

PC werden heute als Schlüsselorganellen angesehen, die entscheidende Schritte während der normalen zerebralen kortikalen Entwicklung regulieren18,19,31 einschließlich NSPC-Expansion und -Engagement8,9,10,11,12 sowie neuronale Migration13,14 und Synaptogenese16,17 . Neben der Analyse in Tiermodellen oder humanem fetalem Hirngewebe ist die Generierung hochinnovativer und relevanter patientenabgeleiteter hIPSC-basierter Modelle der neokortikalen Entwicklung unerlässlich, um die Rolle des PC sowohl während der normalen als auch der pathologischen zerebralen kortikalen Entwicklung zu analysieren.

Das hier beschriebene 2D-hIPSC-basierte Modellierungsprotokoll wurde aus drei wichtigen Publikationen angepasst20,21,22. Die neuroepitheliale Differenzierung wird durch eine duale SMAD-Hemmung unter Verwendung niedermolekularer Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege (SB-431542) und BMP (LDN-193189) induziert22. Die Zellen sind nach 20 Tagen der Differenzierung in rosettenförmigen Strukturen organisiert, die NSPCs sowie neokortikale Tiefenschichtneuronen enthalten. Darüber hinaus zeigen diese rosettenartigen Strukturen eine korrekte apikobasale Polarität, interkinetische Kernmigration von apikalen Vorläufern sowie PC, das sich von allen NSPCs und Neuronen erstreckt. Nach Der Dissoziation dieser Rosettenstrukturen erhält man eine homogene und stabile Population kortikaler Vorläuferzellen21. Wenn sie bis zum Zusammenfluss kultiviert und für 48 h ausgehungert sind, beherbergen diese kortikalen Vorläufer PC, für die die Morphologie, Anzahl und Länge leicht analysiert werden können, indem Ilastik28 und CiliaQ28,29 Plugin-Paket auf Fiji / ImageJ kombiniert werden. Darüber hinaus kann die PC-Funktion durch die Verwendung von Zytokinen zur Induktion des SHH-Signalwegs auch von IF verwendet werden, um die Dynamik wichtiger Signalwegakteure entlang des PC wie GLI2, SMO und GPR161 zu testen. Darüber hinaus ermöglichen semi-quantitative RT-PCR-Assays das Testen der Induktion der SHH-Zielgenexpression, einschließlich GLI1 und PTCH1, als Reaktion auf die Aktivierung des SHH-Signalwegs. Andere Signalwege, die von der PC-Funktion abhängen, sollten ebenfalls getestet werden, einschließlich WNT- und IGF-Signalwege2,32,33. Abschließend zu diesem 2D-Modellierungsansatz, der mehrere Aspekte der normalen Entwicklung der Großhirnrinde eindeutig reproduziert, stellt er ein nützliches und relevantes Werkzeug zum Testen der PC-Biogenese und -Funktion unter normalen und pathologischen Bedingungen dar und sollte dazu beitragen, weitere Einblicke in die Beteiligung von PC während der neokortikalen Entwicklung zu gewinnen.

Ergänzend zu 2D-hIPSC-basierten Modellierungsansätzen bieten dorsale Vorderhirn-Organoide beispiellose Möglichkeiten, die normale und pathologische zerebrale Entwicklung in vitro zu untersuchen, da sie viele Merkmale und Merkmale der sich früh entwickelnden menschlichen Großhirnrinde rekapitulieren. Derzeit werden zwei Haupttypen von Protokollen verwendet: die intrinsische und die geführte Methode. Das von Lancaster und Kollegen23 entwickelte intrinsische Protokoll beruht auf der intrinsischen Fähigkeit von IPSCs, sich mit minimalen externen Faktoren selbst zu organisieren, und führt zu zerebralen Organoiden, die Rudimente verschiedener Hirnregionen enthalten, die eine einzigartige Gelegenheit bieten, die Interaktionen zwischen verschiedenen Gehirnregionen zu modellieren. Die hohe Variabilität und Heterogenität, die einer solchen Modellierungsstrategie innewohnt, stellt jedoch erhebliche Herausforderungen an die Reproduzierbarkeit dar. Geführte Organoid-Differenzierungsprotokolle ermöglichen die Erzeugung von hirnregionsspezifischen Organoiden mit minimaler Heterogenität24,25,26. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, erfolgreich dorsale Vorderhirn-Organoide mit ventrikelartigen Strukturen zu erzeugen, die wichtige Prozesse der frühen menschlichen zerebralen kortikalen Entwicklung rekapitulieren. Das erste kritische Problem besteht darin, mit hochwertigen hIPSC-Kulturen zu beginnen, die große regelmäßige Kolonien beherbergen, die eine Differenzierung von weniger als 10% aufweisen und fast einmal als Monoschicht durchlaufen wurden, um die hIPCs an einzellige Kulturbedingungen anzupassen. Um die Organoidheterogenität, eine der größten Herausforderungen auf diesem Gebiet, zu begrenzen, ist die Bildung von EBs mit einer homogenen Größe eine Voraussetzung, die die Notwendigkeit einer Dissoziation von hIPSC-Kolonien in eine Einzelzellsuspension impliziert, die eine Aussaat bei der definierten Zelldichte ermöglicht. Ein weiterer kritischer Schritt ist die BMM-Aufnahme von EBs, die zur Unterstützung der 3D-Struktur und der neuroepithelialen Expansion benötigt werden. Wir bevorzugten die Gruppeninklusion von etwa fünfzehn Organoiden gegenüber der individuellen Inklusion, auch wenn es sich um einen zusätzlichen Schritt, die BMM-Dissoziation, handelt. Es hat sich gezeigt, dass die BMM-Dissoziation vor der Schüttelkultur die Variabilität innerhalb und zwischen Organoidchargen reduziert, was zu einer höheren Reproduzierbarkeit führt34. Darüber hinaus ermöglicht es die Beseitigung von Zellprozessen, die sich bis in das BMM erstrecken, die für die folgenden Differenzierungsschritte nicht nachteilig sind, es aber schwierig machen, Organoide für die Qualitätskontrolle in den nachfolgenden Schritten des Verfahrens zu beobachten. Um die Nahrungsaufnahme und den Sauerstoffaustausch zu verbessern, verglichen wir die Organoidreifung auf Orbitalschüttlern und spinnenden Bioreaktoren, was zu ähnlichen Ergebnissen führte. Wir haben uns daher für die Orbital-Shaker-Option entschieden, da sie es ermöglicht, die Mittleren Volumina und damit die Gesamtkosten der Experimente deutlich zu reduzieren. Wichtig ist, dass Sie einen anderen Inkubator für stationäre und Schüttelkultur auf einem Orbitalschüttler verwenden, um Vibrationen zu vermeiden, die dem anhaftenden hIPSC-Wachstum schaden. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich auf fünf verschiedene Kontrolllinien hIPSC35 angewendet, die zu homogenen Ergebnissen führen, die die Robustheit dieses Verfahrens gewährleisten.

Die Charakterisierung solcher Organoide kann mit mehreren Methoden erreicht werden. Um die räumlichen 3D-Informationen innerhalb von Organoiden zu erhalten, haben wir ein Protokoll eingerichtet, das die Immunfärbung des gesamten Mounts und das Clearing ganzer Organoide mit anschließender Lichtblatterfassung ermöglicht. Je nach Probenherkunft und Dicke haben sich unterschiedliche Clearingmethoden mit Effizienz herausgebildet36,37. Hier haben wir eine einfache, schnelle und kostengünstige Clearing-Methode eingerichtet, die auf TDE (2,2'-Thiodiethanol) basiert, einem Glykolderivat, das zuvor zur Reinigung von Gehirn- und Darmorganoiden der Maus verwendet wurde38,39. Die Erfassung von immungefärbten und abgeklärten Organoiden wurde an einem Lichtblattmikroskop unter Verwendung eines 20-fachen Objektivs durchgeführt, das zu 80% in TDE eingetaucht war. Im Vergleich zu anderen 3D-Bildgebungsmethoden ist die Lichtblattmikroskopie aus mehreren Gründen von Interesse: schnelle Erfassung, gute Penetration und reduziertes Photobleichen. Die Optimierung des Permeabilisierungsschritts ermöglicht eine effiziente und homogene Antikörperpenetration, die es ermöglicht, Basalkörper und Axoneme von PC zu visualisieren, die sich von allen Vorläufer- und neuronalen Zelltypen des gesamten Organoids erstrecken. Darüber hinaus ermöglicht die Erfassung von frei schwebenden 150 μm dicken Abschnitten mit einem invertierten resonanten Scannen-Konfokalmikroskop mit 40x (NA 1.3) oder 63x (NA 1.4) Ölobjektiven eine weitere Auflösung, wobei ein erheblicher Grad an 3D-Rauminformationen erhalten bleibt und eine qualitative und quantitative Analyse der PC-Biogenese und -Funktion ermöglicht wird.

Die Kombination solcher 2D- und 3D-zellbasierten Modelle und 3D-Bildgebungsanalysen (Abbildung 5) an hIPSCs, die entweder durch Reprogrammierung von Ciliopathie-Patientenzellen oder durch die Verwendung der CRISPR/CAS9-Technologie zur spezifischen Bearbeitung zentrosomaler oder ziliarer Gene erzeugt werden, sollte signifikante Fortschritte beim Verständnis des Beitrags des PC während der normalen und pathologischen Entwicklung der Großhirnrinde ermöglichen. Wichtig ist, dass die Genom-Editing-Technologie es auch ermöglicht, Patientenmutationen gezielt zu retten, um isogene Kontroll-hIPSCs zu erhalten, um die genetische Heterogenität zu überwinden, die den Nachweis von Krankheitsmechanismen in Frage stellt. Darüber hinaus sind einzellige genomische Ansätze heute auf dem gesamten Gebiet weit verbreitet und stellen relevante und komplementäre Ansätze für die Immunfärbungsanalyse dar. Trotz einiger Einschränkungen und Schwierigkeiten, die allen aufkommenden Technologien innewohnen und die umfassend behandelt werden, bieten solche 2D- und 3D-hIPSC-basierten Modelle und die hier vorgestellten Charakterisierungsmethoden leistungsstarke und relevante Werkzeuge, um die PC-Beteiligung an den pathologischen Mechanismen zu analysieren, die neokortikalen Anomalien der menschlichen Entwicklung zugrunde liegen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Agence Nationale de la Recherche (ANR) an S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) und N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 und ANR-19-CE16-0002-01) unterstützt. LB wird vom ANR im Rahmen des Programms Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) und der Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-Programm) unterstützt. Das Imagine Institute wird durch staatliche Mittel des ANR im Rahmen des Programms Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-Projekte) und im Rahmen des zweiten Programms Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

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References

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Developmental Biology primäres Cilium humane induzierte pluripotente Stammzellen hIPSCs neurale Stamm- und Vorläuferzellen humane zerebrale kortikale Entwicklung neuronale Rosetten dorsale Vorderhirnorganoide 2D- und 3D-hIPSC-basierte Modelle der neokortikalen Entwicklung zerebrale Organoide Sonic Hedgehog Whole-Mount-Immunostaining optisches Clearing Lichtblattmikroskop
2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung
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