Summary
Le présent protocole décrit une méthode de détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les organoïdes murins intestinaux à l’aide d’une imagerie qualitative et de tests de cytométrie quantitative. Ce travail peut être potentiellement étendu à d’autres sondes fluorescentes pour tester l’effet de composés sélectionnés sur les ROS.
Abstract
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie intestinale. Les ROS sont des sous-produits naturels du métabolisme cellulaire. Ils sont produits en réponse à une infection ou à une blessure au niveau de la muqueuse car ils sont impliqués dans les réponses antimicrobiennes et la cicatrisation des plaies. Ils sont également des messagers secondaires essentiels, régulant plusieurs voies, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. D’autre part, des niveaux excessifs de ROS conduisent à un stress oxydatif, qui peut être délétère pour les cellules et favoriser les maladies intestinales comme l’inflammation chronique ou le cancer. Ce travail fournit une méthode simple pour détecter les ROS dans les organoïdes murins intestinaux par imagerie en direct et cytométrie en flux, à l’aide d’une sonde fluorogénique disponible dans le commerce. Ici, le protocole décrit le dosage de l’effet des composés qui modulent l’équilibre redox dans les organoïdes intestinaux et détectent les niveaux de ROS dans des types de cellules intestinales spécifiques, illustré ici par l’analyse des cellules souches intestinales génétiquement marquées avec GFP. Ce protocole peut être utilisé avec d’autres sondes fluorescentes.
Introduction
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des sous-produits naturels du métabolisme cellulaire. Ils peuvent également être produits activement par des complexes enzymatiques spécialisés tels que les NADPH-oxydases (NOX) et les oxydases doubles (DUOX) liées à la membrane, qui génèrent des anions superoxydes et du peroxyde d’hydrogène1. En exprimant des enzymes antioxydantes et des piégeurs de ROS, les cellules peuvent ajuster finement leur équilibre redox, protégeant ainsi l’homéostasie tissulaire2. Bien que les ROS puissent être très toxiques pour les cellules et endommager l’ADN, les protéines et les lipides, ce sont des molécules de signalisation cruciales2. Dans l’épithélium intestinal, des taux modérés de ROS sont nécessaires pour la prolifération des cellules souches et progénitrices3; des niveaux élevés de ROS conduisent à leur apoptose4. Le stress oxydatif chronique est lié à de nombreuses maladies gastro-intestinales, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin ou le cancer. À titre d’exemple, dans un modèle murin de cancer intestinal induit par Wnt, une production élevée de ROS par activation des NADPH-oxydases s’est avérée nécessaire pour l’hyperprolifération des cellules cancéreuses5,6. Définir comment les cellules intestinales, en particulier les cellules souches, les cellules souches gèrent le stress oxydatif et comment l’environnement cellulaire peut avoir un impact sur cette capacité est essentiel pour mieux comprendre l’étiologie de cette maladie7.
Dans un tissu, différents types de cellules présentent un état oxydatif basal qui peut varier en fonction de leur fonction et de leur métabolisme et de l’expression de différents niveaux de molécules oxydantes et antioxydantes4,7. La surveillance des ROS in vivo est très difficile. Des colorants perméables cellulaires qui émettent de la fluorescence en fonction de leur état redox ont été développés pour visualiser et mesurer les ROS cellulaires dans les cellules vivantes et les animaux. Cependant, leur efficacité dépend de leur diffusion à l’intérieur des tissus vivants et de leur lecture rapide, ce qui les rend difficiles à utiliser dans les modèles animaux8.
Dans le passé, l’étude de l’effet des composés sur la génération de ROS a été réalisée à l’aide de lignées cellulaires, mais cela peut ne pas refléter la situation in vivo . Le modèle organoïde intestinal, développé par le groupe clevers9, permet la croissance des cellules primaires intestinales ex vivo. La culture de cryptes intestinales dans des matrices, en présence de facteurs de croissance définis, conduit à des structures tridimensionnelles, appelées organoïdes (mini-intestin), qui reproduisent l’organisation crypte-villosité, avec des cellules des différentes lignées épithéliales tapissant une lumière interne, et les cellules souches intestinales résidant dans de petites protubérances ressemblant à des cryptes.
Ici, en tirant parti de ce modèle, une méthode simple est décrite pour étudier le stress oxydatif dans les cellules intestinales primaires à la résolution unicellulaire en ajoutant un colorant sensible aux ROS disponible dans le commerce dans le milieu de culture organoïde.
Les lecteurs de plaques sont souvent utilisés pour détecter la production de ROS dans une population totale. Ce protocole utilise la cytométrie en flux ou le test d’imagerie pour détecter les ROS dans un type cellulaire particulier avec des cellules génétiquement modifiées ou une coloration d’anticorps spécifique. Ce travail implique la culture d’organoïdes intestinaux de souris et la visualisation des ROS par imagerie confocale et quantification par cytométrie en flux. En utilisant des organoïdes de l’intestin grêle dérivés de souris Lgr5-GFP, il est possible d’analyser spécifiquement le niveau de stress oxydatif dans les cellules souches intestinales lors de différents traitements. Ce protocole peut être adapté pour tester l’influence de molécules exogènes, telles que le muramyl-dipeptide (MDP)10 dérivé du microbiote, sur l’équilibre ROS, après avoir stimulé les organoïdes avec les composés sélectionnés.
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Protocol
Toutes les expérimentations animales ont été réalisées après approbation par le Comité d’Utilisation de l’Institut Pasteur et par le Ministère de l’Agriculture Français n° 2016-0022. Toutes les étapes sont effectuées à l’intérieur d’une hotte de culture tissulaire.
1. Préparation de réactifs et de matériaux pour la culture d’organoïdes intestinaux
- Pour préparer le milieu de culture de croissance, mélanger le DMEM/F-12 avancé complété par 1x glutamine, 1x solution de pénicilline/streptomycine (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ng/mL d’EGF murin, 20 μg/mL de Noggin murin 500 ng/mL de R-Spondin1 de souris (voir tableau des matériaux). Laissez le milieu à température ambiante (RT) pendant l’extraction de la crypte.
REMARQUE: Congeler le milieu inutilisé dans des aliquotes à -20 °C. Évitez le gel et le dégel. - Remplissez un tube de 50 mL avec 40 mL de DMEM/F-12 avancé et gardez-le sur la glace.
REMARQUE : Conserver le milieu inutilisé à 4 °C. Il sera utilisé pour le passage des organoïdes. - Préchauffez les plaques de culture cellulaire (μ-Slide 8 chambres de puits et/ou fond rond de 96 puits) dans l’incubateur à 37 °C.
- Dégel de la matrice de membrane basale (BMM) (voir Tableau des matériaux) aliquotes sur la glace (avant de commencer le protocole ou au moins 1 h avant le placage des cryptes).
REMARQUE: Le BMM se solidifiera rapidement s’il n’est pas conservé au froid. - Préparer une solution de lavage/rinçage en ajoutant une solution de pénicilline-streptomycine à 1 % au DPBS (DPBS-P/S).
- Remplissez une boîte de Pétri de 100 mm avec 10 mL de DPBS-P/S froid. Remplissez six tubes de 15 mL avec 10 mL de DPBS et étiquetez-les de F1 à F6.
- Préparer 30 mL de solution d’EDTA de 10 mM par dilution à partir de 0,5 M d’EDTA dans du DPBS. Remplissez deux tubes de 15 mL avec 10 mL d’EDTA de 10 mM et étiquetez-les E1 et E2.
- Gardez toutes les solutions pré-refroidies à 4 °C et conservez-les sur la glace pendant la procédure.
2. Culture d’organoïdes intestinaux
- Sacrifiez une souris Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) de 8 à 10 semaines conformément aux règles et réglementations nationales.
- Recueillir 5 à 8 cm du jéjunum englobant la région située entre le duodénum (5 cm de l’estomac) et l’iléon (10 cm du caecum) et conserver dans le DPBS-P/S froid sur de la glace.
- Nettoyez le contenu intestinal en rinçant avec 5-10 mL de DPBS-P/S froid.
REMARQUE: Les seringues de rinçage faites maison peuvent être obtenues en branchant une pointe de 200 μL sur une buse de seringue de 10 mL. - Ouvrez l’intestin longitudinalement à l’aide de ciseaux à pointe à bille (voir tableau des matériaux) (pour éviter d’endommager les tissus).
- À l’aide d’une pince, transférer le tissu dans une boîte de Pétri contenant du DPBS-P/S froid à température ambiante et le secouer pour le rincer.
- Avec une pipette Pasteur en plastique, prélèvez l’intestin par aspiration et transférez-le dans un tube de 15 mL étiqueté E1 contenant 10 mL d’EDTA froid de 10 mM.
- Inverser le tube 3 fois et incuber sur de la glace pendant 10 min.
- À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, transférer le tissu dans le tube F1 contenant 10 mL de DPBS. Vortex pendant 2 min (sur le vortex normal, en tenant le tube à la main et en veillant à ce que l’intestin tourbillonne bien).
- Mettez 10 μL de la fraction dans une boîte de Pétri et évaluez la qualité de la fraction au microscope.
REMARQUE: Toutes les étapes du vortex sont effectuées à la vitesse maximale et la qualité de chaque fraction doit être évaluée au microscope (Figure 1). - Avec une pipette Pasteur en plastique, saisir l’intestin par aspiration et le transférer dans le tube F2 contenant 10 mL de DPBS et vortex pendant 2 min.
- Répétez l’étape 2.10, en transférant le tissu dans le tube F3 contenant 10 mL de DPBS et le vortex pendant 2 min.
- Répétez l’incubation de l’EDTA comme à l’étape 2.6, en transférant le tissu dans le tube E2 contenant 10 mM d’EDTA.
- Inverser le tube 3 fois et incuber sur de la glace pendant 5 min.
- Répétez l’étape 2.10, en transférant le tissu dans le tube F4 contenant 10 mL de DPBS et le vortex pendant 3 min.
- Répétez l’étape 2.14, en transférant le tissu dans le tube F5 contenant 10 mL de DPBS et le vortex pendant 3 min.
- Répétez l’étape 2.15, en transférant le tissu dans le tube F6 contenant 10 mL de DPBS et le vortex pendant 3 min.
- Combinez les meilleures fractions filtrant par gravité à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube de 50 mL (sur glace) pour éliminer les villosités et les débris importants.
REMARQUE: Habituellement, F5 et F6 sont les fractions contenant de nombreuses cryptes et moins de débris. - Faire tourner les cryptes à 150 x g à 4 °C pendant 3 min.
- Videz le tube, perturbez mécaniquement la pastille et ajoutez 5 mL de DMEM/F12 froid.
- Mettez 10 μL de la suspension dans une boîte de Pétri et comptez manuellement le nombre de cryptes présentes dans l’aliquote au microscope.
REMARQUE: Ne comptez pas les cellules individuelles ou les petits débris. - Calculer le volume (V) de suspension de cryptes requis en μL, en considérant que 300 cryptes sont plaquées par puits, W est le nombre de puits et N est le nombre de cryptes comptées sur 10 μL de la suspension. Transférez les cryptes dans un nouveau tube de 15 mL.
REMARQUE : V = 300 x L x 10/N. Si un petit volume est utilisé dans l’expérience prévue, un tube de centrifugeuse de 1,5 mL peut être utilisé. - Faire tourner les cryptes à 200 x g à 4 °C pendant 3 min.
- Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Perturber mécaniquement la pastille et ajouter doucement le milieu de culture de croissance pour obtenir une concentration de 90 cryptes/μL.
- Ajouter 2 volumes de BMM non dilué pour obtenir une concentration finale de 30 cryptes/μL. Pipeter soigneusement de haut en bas sans introduire de bulles d’air dans le mélange.
REMARQUE: Gardez toujours le tube sur la glace pour éviter la solidification BMM. - Plaque 10 μL des cryptes/BMM se mélangent dans chaque puits. Pour l’analyse par cytométrie en flux, utilisez des plaques à fond rond de 96 puits. Répartir 10 μL au centre de chaque puits sous forme de dôme. Pour l’imagerie, utilisez μ-slide 8 (voir tableau des matériaux) et déposez les 10 μL sous forme de couche mince.
REMARQUE: Plaquez les organoïdes comme une couche mince pour le test d’imagerie afin de permettre leur imagerie en profondeur. - Laissez la plaque pendant 5 min à TA pour permettre au BMM de se solidifier. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min.
- Ajouter 250 μL de milieu de croissance dans chaque puits, en prenant soin de ne pas détacher le BMM.
- Placez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
- Effectuer l’analyse ROS entre les jours 4 et 6 de culture. Sinon, changez le milieu et divisez les organoïdes après l’apparition de plusieurs et longues structures bourgeonnantes et lorsque les cellules mortes s’accumulent dans les lumières organoïdes.
3. Passage des organoïdes
- Commencez à transmettre les organoïdes de l’intestin grêle à partir du 6ème jour de culture, lorsque des structures bourgeonnantes importantes se sont formées et que les lumières organoïdes sont devenues sombres.
REMARQUE: La lumière de l’organoïde devient sombre en raison de l’accumulation de cellules mortes, de débris et de mucus. Évitez de laisser les organoïdes envahir avant de se fendre. Le rapport de fractionnement dépend de la croissance des organoïdes. Il est recommandé de passer les organoïdes avec un rapport de 1:2 au jour 6 et de 1:3 au jour 10. - Remplissez un tube de 15 mL avec 4 mL de DMEM/F-12 avancé froid et gardez-le sur la glace.
REMARQUE: Ici, les volumes pour une plaque de culture de 96 puits sont fournis. Si un format différent est utilisé, réglez le volume en conséquence. - Aspirer soigneusement le fluide avec une pipette ou une pompe à vide des puits sans toucher les dômes BMM et le jeter.
- Ajouter 100 μL de DMEM/F-12 avancé froid par puits. Pipette de haut en bas pour briser le BMM et transférer le contenu du puits dans le tube de 15 mL.
- Lavez le puits avec 200 μL de froid Advanced DMEM/F-12 et collectez-le dans le même tube.
REMARQUE: Si vous passez plusieurs puits de la même condition expérimentale, le contenu des puits peut être regroupé dans le même tube collecteur de 15 mL. - Faire tourner le tube collecteur de 15 mL à 100 x g pendant 5 min à 4°C.
- Jeter le surnageant et ajouter 1 mL de DMEM/F-12 avancé froid à la pastille. À l’aide d’une pointe P1000, prenez une pointe P10 (sans filtre) et pipetez de haut en bas au moins 20 fois.
- Ajouter 4 mL de DMEM/F-12 avancé froid au tube. Tourner à 300 x g pendant 5 min à 4°C.
- Aspirer le surnageant avec une pipette ou une pompe à vide sans déranger le granulé. Ensuite, perturbez mécaniquement la pastille.
- Ajouter le BMM dilué dans un milieu de culture de croissance (rapport 2:1). Pipetez soigneusement de haut en bas sans introduire de bulles d’air dans le mélange.
- Plaque 10 μL des cryptes/BMM se mélangent dans chaque puits.
- Conservez la plaque pendant 5 min à TA pour permettre au BMM de se solidifier. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min.
- Ajouter 250 μL de milieu de croissance dans chaque puits.
REMARQUE: Veillez à ne pas détacher le BMM. - Placez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
4. Préparation de réactifs et de matériaux pour évaluer le stress oxydatif chez les organoïdes intestinaux
- Préparer une solution mère de 250 mM d’inhibiteur de la N-acétylcystéine (NAC) (voir tableau des matériaux), remettre en suspension 10 mg avec 245 μL de DPBS. Utiliser à une concentration finale de 1 mM.
- Préparer une solution mère de 50 mM d’inducteur d’hydroperoxyde de tert-butyle (tBHP), à 70 % dans l’eau, diluer 3,22 μL avec 496,8 μL de DPBS. Utiliser à une concentration finale de 200 μM.
- Pour l’étude de cytométrie en flux, préparer une solution de travail de 250 μM d’une sonde fluorogénique (voir Tableau des matériaux) en diluant la solution mère 1/10 dans du DMSO. Utiliser à une concentration finale de 1 μM.
REMARQUE: Comme indiqué dans les instructions du fabricant, la sonde fluorogénique est sensible à la lumière et à l’oxygène. Les stocks et les aliquotes ne doivent pas être ouverts et fermés trop de fois. - Pour l’étude d’imagerie, préparer une solution de travail de 1,25 mM de la sonde fluorogénique en diluant la solution mère 1/2 dans du DMSO. Utiliser à une concentration finale de 5 μM.
- Préparer une solution finale de 0,1 μg/mL de DAPI dans le DPBS, à utiliser pour la discrimination des cellules mortes dans le test de cytométrie en flux.
- Diluer Hoechst 33342 à 1,25 mg/mL dans du DPBS. Utilisation à une concentration finale de 5 μg/mL à utiliser pour la coloration nucléaire dans le test d’imagerie.
- DMEM chaud sans rouge phénol à 37 °C.
REMARQUE : Ces étapes décrivent l’utilisation de témoins négatifs et positifs qui doivent être inclus dans tous les essais, en utilisant les conditions indiquées à la figure 2A. Le test peut être utilisé pour tester des composés anti- ou pro-oxydants. Les étapes sont les mêmes, et la seule différence est lorsque les composés sont ajoutés avant d’utiliser le colorant fluorogène.
5. Visualisation du stress oxydatif dans les organoïdes 3D par microscopie confocale
- Prendre les organoïdes plaqués dans les chambres de puits μ-Slide 8 et ajouter 1 μL de solution mère NAC dans les puits correspondants pour obtenir une concentration finale de 1 mM.
- Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO2.
- Ajouter 1 μL de solution mère tBHP dans les puits correspondants pour obtenir une concentration finale de 200 μM.
- Incuber pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2.
- Ajouter 1 μL par puits de la dilution de 1,25 mM de la sonde fluorogénique pour obtenir une concentration finale de 5 μM.
- Ajouter 1 μL par puits de la dilution de 1,25 mg/mL de Hoescht pour obtenir une concentration finale de 5 μg/mL.
- Incuber pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2.
- Retirez le support sans déranger le BMM. Doucement, ajouter 250μL de DMEM chaud sans rouge phénol.
REMARQUE: Si une acquisition à long terme est prévue, ajoutez des composés de facteurs de croissance au DMEM sans rouge de phénol. - Imagez les organoïdes à l’aide d’un microscope confocal équipé d’une chambre thermique et d’une alimentation en gaz qui détecte la sonde fluorogénique (ROS).
REMARQUE: L’excitation / émission (ex / em) pour la sonde fluorogénique est 644/665, ex / em pour Hoechst (noyaux) est 361/486 et ex / em pour GFP (cellule souche intestinale des souris Lgr5-GFP) est 488/510. Un objectif d’immersion dans l’huile 63x est utilisé pour détecter les signaux dans les cellules souches. Ne modifiez pas les paramètres laser entre les échantillons. Un objectif 20x peut être utilisé pour permettre une vue d’ensemble de la production de ROS. - Utilisez le contrôle positif pour configurer l’intensité du laser et l’exposition temporelle du signal ROS et vérifiez que ce signal est plus faible dans le contrôle négatif.
- À l’aide d’un écran oculaire, la diapositive permet d’identifier les organoïdes GFP exprimant et d’ajuster l’intensité du laser.
REMARQUE : cette étape est effectuée manuellement. - Définissez des positions pour obtenir une image cousue de l’organoïde entier. Configurez une pile z de 25 μm (taille de pas 5 μm) pour obtenir une section des organoïdes montrant une couche de cellules.
REMARQUE: Reportez-vous au manuel d’utilisation du microscope pour optimiser la configuration. En utilisant des cellules vivantes, l’acquisition doit être effectuée dans les 1 h suivant la fin de l’incubation. - Ouvrez les images dans un logiciel de traitement d’images open source (voir Tableau des matériaux).
- Parcourez la pile z et choisissez la section dans laquelle le milieu des organoïdes est bien représenté et créez une nouvelle image avec la zone sélectionnée.
- Quantifiez les images conformément aux étapes 5.15.1 à 5.15.5.
- Sélectionnez l’outil ligne à main levée.
- Tracez une ligne en suivant les noyaux.
REMARQUE: Sélectionnez uniquement les régions présentant des cellules GFP positives si seules les cellules souches sont analysées. - Augmentez la largeur de la ligne pour recouvrir la couche cellulaire avec la ligne sans inclure les débris luminaux.
- Sélectionnez le canal pour le signal ROS et mesurez l’intensité de fluorescence dans la région sélectionnée et annotez les valeurs.
- Tracez une ligne où il n’y a pas de signal et mesurez l’intensité fluorescente de l’arrière-plan qui sera soustraite à la valeur précédente pour obtenir l’intensité finale.
6. Quantification du stress oxydatif sur les organoïdes dissociés à l’aide du cytomètre en flux
- Ajouter 1 μL de solution mère de NAC dans les puits pour les témoins négatifs afin d’obtenir une concentration finale de 1 mM.
REMARQUE: Utilisez les organoïdes plaqués dans les plaques à fond rond de 96 puits. - Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO2.
- Ajouter 1 μL de solution mère tBHP dans les puits correspondants pour obtenir une concentration finale de 200 μM.
- Incuber pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2.
- À l’aide d’une pipette multicanal, retirez le fluide sans perturber le BMM attaché et transférez-le sur une autre plaque inférieure ronde de 96 puits. Gardez cette assiette de côté.
- Ajouter 100 μL de trypsine et, à l’aide d’une pipette multicanal, pipeter de haut en bas au moins cinq fois pour détruire le BMM.
- Incuber pendant 5 min au maximum à 37 °C et 5 % de CO2.
- Avec une pipette multicanal, pipette de haut en bas au moins cinq fois pour dissocier les organoïdes.
- Tourner à 300 x g pendant 5 min à RT.
- Jetez le surnageant en inversant la plaque. Rajoutez le milieu recueilli à l’étape 6.3 aux puits correspondants et remettez en suspension les cellules en pipetant 5 fois vers le haut et vers le bas.
- Ajouter la sonde fluorogénique à la concentration finale de 1 μM. Ajouter 1 μL par puits à partir de la dilution de 250 μM et incuber pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO2.
REMARQUE : N’ajoutez pas la sonde fluorogénique aux puits nécessaires aux réglages de l’instrument (Figure 2B). - Tourner à 300 x g pendant 5 min à RT.
- Remettre en suspension les cellules avec 250 μL de solution de DAPI de 0,1 μg/mL. Transférez les échantillons dans les tubes de cytométrie en flux appropriés, maintenez les tubes sur la glace et procédez à l’analyse.
REMARQUE : Ajoutez PBS au lieu de DAPI aux puits nécessaires aux réglages de l’instrument (Figure 2B). - Optimisez les paramètres de tension de diffusion avant et latérale sur les tensions de contrôle et laser non colorées pour chaque fluorophore à l’aide d’échantillons mono-colorés.
- À l’aide d’une stratégie de contrôle appropriée (figure 4A), collectez un minimum de 20 000 événements.
REMARQUE : 50 000 événements sont préférables. Les paramètres d’acquisition détaillés varient en fonction de l’instrument utilisé.
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Representative Results
Comme preuve de concept du protocole décrit, les cryptes obtenues à partir de la lignée de souris Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 ont été utilisées dans lesquelles les cellules souches intestinales présentent une expression mosaïque de GFP, qui a été établie par Barker et al., pour caractériser initialement les cellules souches intestinales10 et permettre de cartographier ces cellules en fonction de leur expression GFP. Un modèle est ainsi fourni pour comparer les niveaux de ROS dans une population de type cellulaire spécifique sur différents traitements. Un inhibiteur des ROS (NAC) a été utilisé et un inducteur (tBHP), connu pour agir sur les ROS cellulaires pour visualiser les changements dans leurs niveaux.
Les figures 1A et 1B montrent des images représentatives des fractions F1 et F4 obtenues au cours de la procédure d’extraction des cryptes pour la culture organoïde intestinale. Chaque fraction doit être vérifiée au microscope ou à la jumelle pendant la procédure d’extraction pour suivre le détachement des cryptes et définir les fractions enrichies en cryptes, plutôt qu’en villosités, cellules individuelles ou débris. Les fractions choisies sont ensuite regroupées et passées à travers une passoire cellulaire de 70 μm pour éliminer tous les fragments de villosités restants et obtenir une préparation avec seulement des cryptes (Figure 1C). Les cryptes commencent à se fermer quelques heures après l’intégration dans BMM, et à D1, des organoïdes ronds ont été observés (Figure 1D). Après 3-5 jours, les organoïdes apparaîtront avec des structures bourgeonnantes représentant les « cryptes nouvellement formées ». Les organoïdes sont prêts pour l’analyse ROS (figures 1E et 1F).
Dans le protocole d’imagerie du stress oxydatif par microscopie confocale, la lame contenant les organoïdes, incubée avec la sonde, a été imagée avec un microscope à fluorescence confocale équipé de lasers et de filtres pour détecter les signaux Hoechst (ex/em: 361/486), GFP (ex/em: 488/510) et la sonde fluorogénique (ex/em): 644/665). Un microscope confocal équipé d’un objectif d’immersion dans l’air 20x et 63x dans l’huile a permis la visualisation des ROS. Chez les souris Lgr5-GFP, les cellules GFP positives sont des cellules souches intestinales exprimant Lgr5. La figure supplémentaire 1 montre des images représentatives obtenues avec l’objectif 20x fournissant une vue d’ensemble du ROS dans plusieurs organoïdes. La figure 3 montre des images représentatives, obtenues avec l’objectif d’huile 63x, d’organoïdes intestinaux exprimant la GFP, non traités (NT), ou pré-incubés ou non avec l’inhibiteur de ROS NAC, et stimulés ou non pendant 30 min avec l’inducteur de ROS tBHP.
En présence de l’inhibiteur, le seul signal des cellules mortes contenues dans la lumière de l’organoïde est visible. Dans l’organoïde non traité, les niveaux de ROS basaux sont montrés, prouvant que les cellules souches produisent des ROS plus élevés que les cellules différenciées (selon les réglages du microscope, le signal ROS peut également être visualisé dans les cellules non souches). Les cellules GFP positives présentent un signal cytoplasmique plus significatif avec l’inducteur en présence de la sonde fluorogénique, démontrant que les niveaux de ROS augmentent particulièrement dans les cellules souches après le traitement.
La figure 4 montre des résultats représentatifs obtenus lors de l’analyse de la production de ROS dans des organoïdes intestinaux stimulés ou non avec un inhibiteur ou un inducteur de ROS, à l’aide d’un cytomètre en flux équipé de lasers de 405 nm, 488 nm et 630 nm. La stratégie de contrôle présentée à la figure 4A permet d’évaluer la production de ROS au niveau de l’ensemble de la population de cellules organoïdes, en définissant des cellules intactes et vivantes en fonction de paramètres physiques et de l’exclusion DAPI (SSC-A vs FSC-A et DAPI vs FSC-A) et FSC-H vs FSC-A) ou uniquement dans les cellules souches intestinales, en outre fermées sur les cellules à signal GFP élevé. La figure 4B montre les niveaux de ROS dans la population totale après la collecte de 50 000 événements. Les taux de ROS basaux dans les cellules non traitées (NT) diminuent après stimulation avec l’inhibiteur (NAC), et au contraire, augmentent après une provocation avec l’inducteur (tBHP). Les cellules prétraitées avec l’inhibiteur puis stimulées avec l’inducteur présentent un niveau inférieur à celles stimulées avec l’inducteur seul. Les résultats ont ensuite été analysés à l’aide d’un logiciel approprié, obtenant l’intensité fluorescente médiane (IMF). Les valeurs obtenues sont présentées sous forme de rapport sur les cellules non traitées, comme le montre le graphique présenté à droite de la figure 4B. La figure 4C montre les mêmes paramètres décrits à la figure 4B dans les cellules souches, contrôlées comme des cellules GFP positives, montrant une diminution de 3,5 fois du niveau de ROS lors du traitement NAC et une augmentation de 4 fois lors du traitement tBHP sur les cellules non stimulées. Ce résultat démontre qu’en suivant ce protocole, il est possible de quantifier les différences dans les niveaux de ROS au niveau de l’ensemble de la population cellulaire ou dans les cellules souches GFP positives lors de leur traitement des organoïdes avec des composés spécifiques.
Figure 1 : Images représentatives de cryptes et d’organoïdes. (A) Exemple de fraction F1 obtenue après la première incubation avec de l’EDTA, enrichie en villosités (carré), avec quelques débris (étoile) et cryptes (cercle). (B) Exemple de fraction F4 enrichie en cryptes. (C) Suspension ne présentant que des cryptes isolées obtenues après la filtration avec une passoire cellulaire de 70 μm (barre d’échelle, 200 μm). (D, E et F). Les organoïdes typiques ont été obtenus après 1, 3 et 5 jours respectivement, après avoir incorporé les cryptes dans BMM (barre d’échelle, 100 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Aperçu du plan expérimental. (A) Conditions utilisées dans ce protocole incluses dans chaque expérience : puits non traités (NT), puits traités par inducteurs (hydroperoxyde de tert-butyle - tBHP), puits traités par inhibiteurs (N-acétyl cystéine - NAC) et puits traités par inhibiteurs et inducteurs (NAC-tBHP). (B) Format de plaque pour le test de cytométrie en flux. Chaque condition est plaquée en triple exemplaire (ligne A). Les lignes B, C et D comprennent des puits pour le réglage du cytomètre en flux avec uniquement la sonde fluorogénique, uniquement des échantillons DAPI ou non colorés (NS). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images confocales représentatives de la coloration ros dans les organoïdes. Les images cousues ont été obtenues avec un microscope confocal équipé d’une caméra EMCCD haute vitesse, d’un objectif d’huile 63x/1,4 et d’une fente de 35 μm, en utilisant les lasers 405, 488, 640 et les filtres 460/50, 535/50, 700/75 pour acquérir respectivement Hoechst, GFP et la sonde fluorogénique. Coupes optiques confocales d’organoïdes non traités (NT), traités avec l’inhibiteur ROS (NAC), avec l’inducteur ROS (tBHP), ou prétraités avec l’inhibiteur ROS puis stimulés avec l’inducteur ROS (NAC-tBHP). En gris, noyaux colorés avec Hoechst; dans les cellules vertes Lgr5-GFP; en rouge, la sonde fluorogénique (barre d’échelle, 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse par cytométrie en flux représentative des ROS dans les cellules dérivées d’organoïdes. (A) Représentation schématique de la stratégie de contrôle utilisée dans l’analyse de cytométrie en flux: contrôle de la forme cellulaire (exclusion des cellules mortes et des débris accumulés dans la lumière organoïde), contrôle des cellules vivantes (cellules n’incorporant pas le laser DAPI 405), contrôle des cellules simples (discrimination doublet) et cellules souches (cellules positives GFP-laser 488) (FSC: diffusion avant, SSC: diffusion latérale). Le signal ROS a été acquis à l’aide du laser 630. (B) À gauche, des histogrammes ont été obtenus à l’aide d’un logiciel approprié montrant l’intensité des signaux ROS pour l’ensemble de la population vivante (après avoir examiné environ 10 000 événements par condition) dans les différents échantillons NT: non traités; NAC: traité par inhibiteur; tBHP induit-traité; NAC-tBHP : traitement par inhibiteur et inducteur. À droite, un exemple typique du rapport calculé pour les valeurs DM sur les échantillons NT obtenus au cours d’une expérience à partir de 3 échantillons par condition (moyenne ± ET) (*** P = 0,0003). (C) Identique à B pour la population positive à la PGB (1 000 événements par condition) (* P = 0,02). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Images confocales représentatives de la coloration ros dans les organoïdes. Les images cousus ont été obtenus avec un microscope confocal équipé d’une caméra EMCCD haute vitesse, d’un objectif 20x et d’une fente de 35 μm, en utilisant les lasers 405, 488, 640 et les filtres 460/50, 535/50, 700/75 pour acquérir respectivement Hoechst, GFP et sonde fluorogénique. Coupes optiques confocales d’organoïdes non traités (NT), traités avec l’inhibiteur ROS (NAC), avec l’inducteur ROS (tBHP), ou prétraités avec l’inhibiteur ROS puis stimulés avec l’inducteur ROS (NAC-tBHP). En gris, noyaux colorés avec Hoechst; dans les cellules vertes Lgr5-GFP; en sonde fluorogénique rouge (barre d’échelle, 100 μm). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce travail fournit un protocole étape par étape pour isoler les cryptes jéjunales murines, les cultiver en organoïdes 3D et analyser les ROS dans les organoïdes en combinant une sonde fluorogénique sensible aux ROS avec une imagerie microscopique qualitative des organoïdes entiers et une mesure quantitative des ROS en utilisant la cytométrie en flux sur des cellules individuelles après la dissociation organoïde.
La première étape critique de cette méthode est la procédure d’extraction des cryptes. En effet, la qualité de la préparation des cryptes est la clé d’une formation réussie d’organoïdes. Il est donc essentiel d’obtenir des fractions avec des cryptes enrichies et peu de débris cellulaires ou de cellules mourantes. Les cryptes peuvent être trouvées en différentes fractions de celles indiquées dans le protocole, car la dissociation peut varier en fonction de l’âge et de l’état de santé de la souris. Le nombre d’incubations d’EDTA peut être modifié en conséquence. Si les cryptes ne semblent pas se détacher après la fraction 4, une incubation EDTA de 3 minutes doit être répétée. Inversement, supposons que les cryptes se détachent déjà après la première incubation d’EDTA. Dans ce cas, la deuxième incubation d’EDTA peut ne pas être nécessaire, et les étapes séquentielles du vortex dans DPBS doivent être effectuées jusqu’à ce que les fractions soient obtenues avec suffisamment de cryptes dépourvues de débris. Si aucune dissociation ne se produit, assurez-vous que le DPBS sans Ca2+ et Mg2+ est utilisé pour préparer les tubes collecteurs et remplacez l’EDTA par une nouvelle solution. Les cryptes sont des structures fragiles, elles doivent donc être conservées autant que possible sur la glace et rapidement plaquées après l’isolement.
Différentes plaques et volumes de gouttes peuvent être utilisés pour cultiver des organoïdes. Par exemple, les cryptes peuvent également être plaquées dans 24 ou 48 plaques de puits après ajustement de la concentration des cryptes, du volume de la goutte BMM et du milieu ajouté dans chaque puits. Plusieurs gouttes peuvent être plaquées dans le même puits dans une plaque de 12 ou 6 puits. Généralement, les cryptes diminuent en taille et s’arrondissent pour former de petits organoïdes ronds au jour 1 de la culture. La formation de nouveaux bourgeons doit être observée 2-3 jours après le placage.
Pour étudier les changements dans les niveaux de ROS dans les cellules souches intestinales, l’avantage de la lignée de souris Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 a été pris. Une mise en garde de ce modèle est le silence sélectif de l’allèle frappé et le mosaïcisme conséquent de l’expression GFP, qui peut être absent dans des plaques de cellules souches ou des cryptes entières. Au cours du protocole d’imagerie, tous les organoïdes ne présenteront pas de cellules souches exprimant la GFP; par conséquent, tous les organoïdes ne seront pas pris en compte à moins qu’il ne soit possible de se fier à la position spatiale des cellules. Au lieu de cela, cela doit être pris en compte lors de l’analyse de la population de cellules GFP négatives dans le protocole de cytométrie en flux. En effet, comme il est impossible de se fier à la position spatiale, la population GFP-négative sera composée de cellules non souches et de cellules souches GFP-négatives.
Ici, un protocole est fourni pour l’évaluation qualitative des ROS dans les organoïdes intestinaux. Un aspect critique pour cette partie est lié à la distance de travail des objectifs utilisés. Les organoïdes sont cultivés dans BMM; ils ne sont pas attachés au fond du puits, ce qui introduit une distance par rapport au plan de concentration objectif. Pour cette raison, il est essentiel de plaquer les organoïdes dans une fine couche de BMM, afin de minimiser ce problème. Même dans ce réglage optimisé, tous les organoïdes ne seront pas dans la bonne position pour être correctement imagés.
Une analyse quantitative des images peut être effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images approprié, évaluant l’intensité fluorescente moyenne des images dans le canal de signal ROS tel que décrit dans le protocole. À cette fin, il est nécessaire d’acquérir un nombre élevé d’images pour obtenir un nombre suffisant d’événements statistiquement significatifs. Comme mentionné précédemment, en utilisant les souris Lgr5-GFP, tous les organoïdes n’exprimeront pas GFP, ce qui nécessite un nombre considérable d’échantillons à imager.
Au cours de la procédure de cytométrie en flux, une étape critique est la dissociation des organoïdes en cellules individuelles. Si la dissociation est trop dure, les cellules peuvent mourir et libérer de l’ADN. Un inhibiteur de roche, Y-27632, pour contrer l’anoikis, et DNAse peuvent être ajoutés au tampon de dissociation s’ils n’interfèrent pas avec la voie étudiée. Une dilution de la trypsine ou des temps d’incubation réduits peuvent être utilisés.
Enfin, il est crucial de définir le meilleur moment pour analyser la production de ROS après les différents traitements (anti- ou pro-oxydants) testés. Dans le cas de médicaments qui induisent rapidement des ROS en quelques minutes ou quelques heures, le test d’imagerie peut être utilisé pour déterminer quand il y a l’induction maximale en ajoutant la sonde fluorogénique avant les composés testés. L’intensité de fluorescence de la sonde après stimulation des organoïdes peut varier d’une expérience à l’autre effectuée à différents jours. Par conséquent, il est crucial de toujours calculer le rapport avec les échantillons non stimulés et d’ajouter des témoins (oxydant / antioxydant) pour vérifier la réactivité de la sonde. Le NAC et le tBHP ont été utilisés comme témoins négatifs et positifs, car ils ont donné les résultats les plus concluants. Pourtant, d’autres réactifs peuvent être utilisés, tels que le resvératrol comme antioxydant ou le paraquat / ménadione comme oxydants. L’incubation de cellules pendant trop longtemps avec la sonde fluorogénique peut être toxique et même modifier l’équilibre redox cellulaire, de sorte que les temps d’incubation doivent également être étroitement contrôlés. Les cellules colorées avec la sonde peuvent être fixées et analysées quelques heures plus tard. Dans ce cas, pour l’analyse de cytométrie en flux, le DAPI ne peut pas faire de distinction entre les cellules vivantes et mortes. Au lieu de cela, un colorant réparable pour la discrimination vivante / morte doit être utilisé avant la fixation.
Les organoïdes peuvent également être cultivés pendant plusieurs jours (plus de 7), mais cela augmentera le nombre de cellules vivantes et prolifératives et les cellules mortes qui s’accumulent dans les lumières organoïdes, générant un arrière-plan élevé, en particulier dans le test d’imagerie. Si une augmentation anormale du signal de la sonde fluorogénique est observée, assurez-vous que la solution utilisée pour remettre en suspension les composés stimulants n’est pas pro-oxydante en soi (c.-à-d. l’éthanol).
Une préoccupation à considérer lors de l’utilisation de ce protocole est que l’imagerie en direct et la dissociation cellulaire suivies d’une cytométrie en flux peuvent induire un stress oxydatif dans les cellules et générer un signal de fond. La fixation des organoïdes peut être envisagée selon l’expérience. Une autre limitation provient de la difficulté de l’imagerie en profondeur des organoïdes cultivés dans une matrice 3D. Comme mentionné dans le protocole, le BMM doit être distribué sur la diapositive sous forme de couche mince pour limiter cet aspect.
Ici, le protocole est conçu à l’aide d’un colorant fluorogène disponible dans le commerce. Son principal avantage est sa compatibilité avec la coloration multicolore des organoïdes afin que des types de cellules spécifiques. Par exemple, la coloration des anticorps pour les marqueurs de surface cellulaire immédiatement après l’incubation de la sonde fluorogénique peut être effectuée pour détecter des sous-types particuliers. Cependant, la sonde n’est pas spécifique à une espèce ROS spécifique car elle peut détecter le superoxyde, le peroxyde de nitrite et le peroxyde d’hydrogène11,12,13. Pour cette raison, il est généralement utilisé pour détecter le stress oxydatif global. Bien que commercialisée en tant que sonde cytosolique uniquement, la sonde fluorogénique sélectionnée pourrait atteindre les mitochondries14. Comme sa spécificité peut varier entre différents contextes cellulaires, nous suggérons d’utiliser d’autres approches complémentaires pour mesurer les ROS lorsque cela est possible. Des colorants alternatifs tels que des sondes spécifiques pour détecter les anions superoxydes générés par les mitochondries pourraient être utilisés10. Un répertoire de sondes chimiluminescentes a également été développé pour détecter des espèces ROS spécifiques à haute sensibilité, telles que les sondes à base de luciférine15,16. Ceux-ci ont l’avantage d’être compatibles avec l’imagerie in vivo, mais ne peuvent pas être utilisés pour cartographier la production de ROS avec des types de cellules spécifiques. Enfin, ce protocole peut être appliqué à d’autres types d’organoïdes, par exemple, les organoïdes coliques dérivés de biopsies humaines. Dans ce cas, le milieu de culture doit être adapté en conséquence17. Pour analyser davantage la machinerie redox dans les cellules intestinales, les procédures de culture et de dissociation des organoïdes décrites dans ce protocole peuvent être combinées avec des approches transcriptomiques et protéomiques sur des organoïdes entiers ou des cellules organoïdes triées par cellules activées par fluorescence (FACS).
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Français subvention 17-CE14-0022 (i-Stress) de l’Agence nationale de la recherche (ANR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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