Summary
本方案描述了一种使用定性成像和定量细胞术测定法检测肠道小鼠类器官中活性氧（ROS）的方法。这项工作可以潜在地扩展到其他荧光探针，以测试所选化合物对ROS的影响。
Abstract
活性氧（ROS）在肠道稳态中起着至关重要的作用。ROS是细胞代谢的天然副产品。它们是在粘膜水平上对感染或损伤作出反应而产生的，因为它们参与抗菌反应和伤口愈合。它们也是关键的次级信使，调节多种途径，包括细胞生长和分化。另一方面，过量的ROS水平会导致氧化应激，这对细胞有害，有利于肠道疾病，如慢性炎症或癌症。这项工作提供了一种直接的方法，通过使用市售的荧光探针，通过活体成像和流式细胞术检测肠道小鼠类器官中的ROS。在这里，该协议描述了测定调节肠道类器官氧化还原平衡并检测特定肠道细胞类型中的ROS水平的化合物的作用，此处通过分析用GFP遗传标记的肠干细胞来举例说明。该协议可与其他荧光探针一起使用。
Introduction
活性氧（ROS）是细胞代谢的天然副产物。它们也可以由专门的酶复合物主动产生，例如膜结合的NADPH-氧化酶（NOX）和双氧化酶（DUOX），它们产生超氧阴离子和过氧化氢1。通过表达抗氧化酶和ROS清除剂，细胞可以微调其氧化还原平衡，从而保护组织稳态2。虽然ROS可能对细胞具有剧毒并破坏DNA，蛋白质和脂质，但它们是至关重要的信号分子2。在肠上皮中，茎和祖细胞增殖需要适度的ROS水平3;高ROS水平导致其凋亡4。慢性氧化应激与许多胃肠道疾病有关，例如炎症性肠病或癌症。例如，在Wnt驱动的肠癌小鼠模型中，发现癌细胞增殖需要通过激活NADPH-氧化酶来提高ROS的产生5，6。定义肠道细胞，特别是干细胞，干细胞如何管理氧化应激以及细胞环境如何影响这种能力对于更好地了解这种疾病的病因至关重要7。
在组织中，不同的细胞类型呈现基底氧化状态，该状态可能根据其功能和代谢以及不同水平的氧化剂和抗氧化剂分子的表达而变化4，7。 在体内 监测ROS是非常具有挑战性的。已经开发出根据其氧化还原状态发射荧光的细胞渗透染料，以可视化和测量活细胞和动物中的细胞ROS。然而，它们的功效取决于它们在活组织内的扩散和快速读数，使它们难以在动物模型中使用8。
过去，化合物对ROS产生的影响的研究是使用细胞系完成的，但这可能无法反映体内情况。由Clevers9小组开发的肠道类器官模型使肠道原代细胞的离体生长成为可能。在存在确定的生长因子的情况下，在基质中培养肠隐窝，导致称为类器官（迷你肠道）的三维结构，其复制隐窝组织，来自不同上皮谱系的细胞排列在内腔内，肠干细胞驻留在小隐窝样突起中。
在这里，利用该模型，描述了一种简单的方法，通过将市售的ROS敏感染料添加到类器官培养基中，以单细胞分辨率研究原代肠细胞中的氧化应激。
读板器通常用于检测总种群中的ROS产量。该协议使用流式细胞术或成像测定来检测具有转基因细胞或特异性抗体染色的特定细胞类型中的ROS。这项工作涉及小鼠肠道类器官培养和通过共聚焦成像和流式细胞术定量的ROS可视化。使用Lgr5-GFP小鼠衍生的小肠类器官，可以特异性分析不同处理后肠干细胞中的氧化应激水平。该协议可用于测试外源分子（例如微生物群衍生的穆拉米基二肽（MDP）10）在用所选化合物刺激类器官后对ROS平衡的影响。
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Protocol
所有动物实验均在巴斯德使用委员会研究所和法国农业部批准后进行，编号为2016-0022。所有步骤都在组织培养罩内进行。
1. 肠道类器官培养试剂和材料的制备
- 为了制备生长培养基，混合先进的DMEM / F-12补充1x谷氨酰胺，1x青霉素/链霉素（P / S）溶液，10mM的HEPES，50ng / mL的小鼠EGF，20μg/ mL小鼠Noggin 500ng / mL小鼠R-Spondin1（ 见材料表）。在隐窝提取期间将培养基保持在室温（RT）。
注意：将未使用的培养基在-20°C下以等分试样冷冻。 避免冷冻和解冻。 - 在 50 mL 试管中加入 40 mL 高级 DMEM/F-12，并将其放在冰上。
注意：将未使用的培养基保持在4°C。 它将用于类器官的传代。 - 在37°C下在培养箱中预热细胞培养板（μ-Slide 8孔室和/或96孔圆底）。
- 在冰上解冻基底膜基质（BMM）（见 材料表）等分试样（在开始方案之前或在电镀隐窝前至少1小时）。
注意：如果不保持低温，BMM会迅速凝固。 - 准备洗涤/冲洗溶液，将1%青霉素 - 链霉素溶液添加到DPBS（DPBS-P / S）中。
- 在 10 mm 培养皿中加入 10 mL 冷 DPBS-P/S.用 10 mL DPBS 填充六个 15 mL 试管，并在 F1 至 F6 之间贴上标签。
- 通过在DPBS中稀释0.5 M EDTA来制备30 mL的10 mM EDTA溶液。用 10 mL 10 mM EDTA 填充两个 15 mL 试管，并标记它们 E1 和 E2。
- 将所有溶液预冷至4°C，并在手术过程中将其保持在冰上。
2. 肠道类器官培养
- 根据国家规章制度，牺牲一只8-10周龄的LGr5-EGFP-IRES-creERT2（Lgr5-GFP）小鼠。
- 收集5-8厘米的空肠，包括十二指肠（距胃5厘米）和回肠（距盲肠10厘米）之间的区域，并保持在冰上冷的DPBS-P / S中。
- 通过用5-10毫升冷DPBS-P / S冲洗肠道内容物。
注意：通过将200 μL吸头插入10 mL注射器喷嘴即可获得自制冲洗注射器。 - 使用球尖剪刀纵向打开肠道（ 材料表） （以防止损伤组织）。
- 使用镊子将组织转移到室温下含有冷DPBS-P / S的培养皿中，然后摇动以冲洗。
- 使用塑料巴斯德移液器，通过抽吸抓住肠道并将其转移到标有 E1 的15 mL管中，该管含有10 mL冷10 mM EDTA。
- 倒置管子3次，在冰上孵育10分钟。
- 使用塑料巴斯德移液器，将组织转移到含有10 mL DPBS的管 F1 中。涡旋2分钟（在正常涡旋下，用手握住管子并确保肠道旋转良好）。
- 将10μL馏分放入培养皿中，并在显微镜下评估馏分的质量。
注：所有涡旋步骤均以最大速度进行，应在显微镜下评估每个馏分的质量（图1）。 - 使用塑料巴斯德移液器，通过抽吸抓住肠道并将其转移到含有10 mL DPBS的管 F2 中并涡旋2分钟。
- 重复步骤2.10，将组织转移到含有10mL DPBS的管 F3 中并涡旋2分钟。
- 重复EDTA孵育，如步骤2.6所示，将组织转移到含有10mM EDTA的管 E2 中。
- 倒置管子3次，在冰上孵育5分钟。
- 重复步骤2.10，将组织转移到含有10mL DPBS的管 F4 中并涡旋3分钟。
- 重复步骤2.14，将组织转移到含有10mL DPBS的管 F5 中并涡旋3分钟。
- 重复步骤2.15，将组织转移到含有10mL DPBS的管 F6 中并涡旋3分钟。
- 通过70μm细胞过滤器将重力过滤的最佳组分组合到50 mL管（冰上）中，以消除绒毛和重要碎屑。
注意：通常，F5和F6是包含许多隐窝和较少碎片的馏分。 - 在4°C下以150× g 旋转隐窝3分钟。
- 清空试管，机械破坏沉淀，并加入5 mL冷DMEM / F12。
- 将10μL悬浮液放入培养皿中，并在显微镜下手动计算等分试样中存在的隐窝数量。
注意：不要计算单个细胞或小碎片。 - 计算以μL为单位所需的隐窝悬浮液的体积（V），考虑到每孔接种300个隐窝，W是孔数，N是10μL悬浮液中计数的隐窝数。将隐窝转移到新的15 mL管中。
注：V = 300 x W x 10/N。如果在计划的实验中使用小体积，则可以使用1.5 mL离心管。 - 在4°C下以200× g 旋转隐窝3分钟。
- 使用移液器小心地除去上清液。
- 机械破坏沉淀并轻轻加入生长培养基以获得90隐窝/ μL的浓度。
- 加入2体积未稀释的BMM，最终浓度为30隐窝/ μL。小心地上下移液，不要将气泡引入混合物中。
注意：始终将管子放在冰上，以避免BMM凝固。 - 将10μL隐窝/ BMM的板混合到每个孔中。对于流式细胞术分析，使用圆底96孔板。将10μL作为圆顶分布在每个孔的中心。对于成像，使用μ载玻片8孔（见 材料表），并将10μL沉积为薄层。
注：将类器官作为成像测定的薄层，以实现其深入成像。 - 将板在室温下放置5分钟，以使BMM凝固。将板置于37°C和5%CO 2 的培养箱中15分钟。
- 向每个孔中加入250μL生长培养基，注意不要分离BMM。
- 将板置于37°C和5%CO 2的培养箱中。
- 在培养的第4天和第6天之间进行ROS分析。否则，在出现几个长萌芽结构以及当死细胞积聚到类器官腔中时，改变培养基并分裂类器官。
3. 类器官传代
- 从培养的第 6天开始传代小肠类器官，此时已经形成显着的萌芽结构，并且类器官腔已经变暗。
注意：由于死细胞，碎片和粘液的积累，类器官的管腔变暗。避免在分裂前让类器官过度生长。分裂比例取决于类器官的生长。建议在第6天以1：2的比例和第10天以1：3的比例传代类器官。 - 在 15 mL 的试管中加入 4 mL 冷的高级 DMEM/F-12，并将其放在冰上。
注：这里提供了96孔培养板的体积。如果使用其他格式，请相应地调整音量。 - 用移液器或真空泵小心地从孔中吸出介质，不要接触BMM圆顶，然后将其丢弃。
- 每孔加入100μL冷高级DMEM / F-12。上下移液以分解BMM并将孔中的内容物转移到15 mL管中。
- 用200μL冷高级DMEM / F-12洗涤孔，并将其收集在同一管中。
注意：如果从相同的实验条件下传导多个孔，则孔的内容物可以汇集在同一个15 mL收集管中。 - 在4°C下以100 x g 旋转15 mL收集管5分钟。
- 弃去上清液，向沉淀中加入1mL冷高级DMEM / F-12。使用 P1000 吸头时，拿起 P10 吸头（不带过滤器）并上下移液至少 20 次。
- 将 4 mL 冷高级 DMEM/F-12 加入试管中。在4°C下以300 x g 旋转5分钟。
- 用移液管或真空泵吸出上清液，而不会干扰沉淀。然后，机械地破坏颗粒。
- 加入稀释在生长培养基中的BMM（2：1比例）。小心地上下移液，不要将气泡引入混合物中。
- 将10μL隐窝/ BMM的板混合到每个孔中。
- 将板在室温下保持5分钟，以使BMM凝固。将板置于37°C和5%CO 2 的培养箱中15分钟。
- 向每个孔中加入250μL生长培养基。
注：小心不要拆下 BMM。 - 将板置于37°C和5%CO 2的培养箱中。
4. 制备用于评估肠道类器官氧化应激的试剂和材料
- 制备抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）的250mM储备溶液（见 材料表），重悬10mg和245μLDPBS。在1 mM终浓度下使用。
- 制备50mM诱导剂叔丁基过氧化氢（tBHP）的储备溶液，在水中70%，用496.8μLDPBS稀释3.22μL。在200μM最终浓度下使用。
- 对于流式细胞术研究，通过将储备溶液稀释在DMSO中1/10来制备250μM荧光探针的工作溶液（见 材料表）。在1μM终浓度下使用。
注：如制造商说明所示，荧光探头对光和氧气敏感。股票和等分试样不应打开和关闭太多次。 - 对于成像研究，通过将储备溶液稀释在DMSO中1/2来制备荧光探针的1.25mM工作溶液。在5μM终浓度下使用。
- 在DPBS中制备0.1μg/ mL DAPI的最终溶液，用于流式细胞术测定中的死细胞鉴别。
- 将Hoechst 33342稀释至1.25 mg / mL的DPBS。以5μg/ mL终浓度使用，用于成像测定中的核染色。
- 在37°C下温暖无酚红的DMEM。
注意：这些步骤描述了使用任何测定中必须包含的阴性和阳性对照，使用 图2A中指示的条件。该测定可用于测试抗氧化或促氧化化合物。步骤是相同的，唯一的区别是在使用荧光染料之前添加化合物的时间。
5. 通过共聚焦显微镜可视化3D类器官中的氧化应激
- 取在μ-Slide 8孔室中接种的类器官，并在相应的孔中加入1μL NAC储备溶液，以获得1mM的最终浓度。
- 在37°C和5%CO 2下孵育1小时。
- 在相应的孔中加入1μLtBHP储备溶液，以获得200μM的最终浓度。
- 在37°C和5%CO 2下孵育30分钟。
- 每孔加入1.25mM稀释的荧光探针1μL，以获得5μM的最终浓度。
- 每孔加入1.25 mg / mL稀释的Hoescht，以获得5μg/ mL的最终浓度。
- 在37°C和5%CO 2下孵育30分钟。
- 取出介质，不干扰BMM。轻轻加入250μL不含酚红的温热DMEM。
注意：如果计划长期收购，请在没有酚红的DMEM中添加生长因子化合物。 - 使用配备热室和气体供应的共聚焦显微镜对类器官进行成像，该气体供应可检测荧光探针（ROS）。
注意：荧光探针的激发/发射（ex/em）为644/665，Hoechst（细胞核）的ex/em为361/486，GFP（来自Lgr5-GFP小鼠的肠干细胞）的ex/em为488/510。63x油浸物镜用于检测干细胞中的信号。请勿在样品之间更改激光设置。20倍目标可用于概述ROS生产。 - 使用正对照设置ROS信号的激光强度和时间暴露，并检查该信号在负极对照中是否较低。
- 使用目镜筛选载玻片来识别表达的GFP类器官并调整激光强度。
注意：此步骤是手动执行的。 - 定义位置以获得整个类器官的拼接图像。设置25μm（步长5μm）的z-stack，以获得显示一层细胞的类器官的一部分。
注：请参阅显微镜用户手册以优化设置。使用活细胞，采集应在孵育结束后1小时内完成。 - 在开源图像处理软件中打开图像（请参见 材质表）。
- 浏览z-stack并选择类器官中间部分，并使用所选区域创建一个新图像。
- 按照步骤 5.15.1 - 5.15.5 量化图像。
- 选择手绘线工具。
- 在原子核后面画一条线。
注意：如果仅分析干细胞，则仅选择显示GFP阳性细胞的区域。 - 增加线宽以用线覆盖细胞层，而不包括腔内碎屑。
- 选择ROS信号的通道，测量所选区域中的荧光强度并注释值。
- 在没有信号的地方画一条线，并测量背景的荧光强度，该荧光强度将被减去到前一个值以获得最终强度。
6. 使用流式细胞仪定量解离类器官上的氧化应激
- 在孔中加入1μL NAC储备溶液进行阴性对照，以获得1mM的最终浓度。
注意：使用镀在96孔圆底板中的类器官。 - 在37°C和5%CO 2下孵育1小时。
- 在相应的孔中加入1μLtBHP储备溶液，以获得200μM的最终浓度。
- 在37°C和5%CO 2下孵育30分钟。
- 使用多通道移液器，在不干扰连接的BMM的情况下取出培养基，然后将其转移到另一个96孔圆形底板上。把这个盘子放在一边。
- 加入100μL胰蛋白酶，并用多通道移液器上下移液至少五次以破坏BMM。
- 在37°C和5%CO 2下孵育不超过5分钟。
- 使用多通道移液器，上下移液至少五次以解离类器官。
- 在室温下以300 x g 旋转5分钟。
- 通过倒置板来丢弃上清液。将步骤6.3中收集的培养基重新加入相应的孔中，并通过上下移液5次来重悬细胞。
- 以1μM的最终浓度加入荧光探针，从250μM稀释液中每孔加入1μL，并在37°C和5%CO 2下孵育30分钟。
注意：不要将荧光探头添加到仪器设置所需的孔中（图2B）。 - 在室温下以300 x g 旋转5分钟。
- 用250μL0.1μg/ mL DAPI溶液重悬细胞。将样品转移到适当的流式细胞术管中，将试管保持在冰上，然后继续进行分析。
注意：将PBS而不是DAPI添加到仪器设置所需的孔中（图2B）。 - 使用单色样品优化未染色控制和激光电极上的正向和侧面散射电压设置。
- 使用适当的门控策略（图 4A），收集至少 20，000 个事件。
注意：首选 50，000 个事件。详细的采集设置因所用仪器而异。
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Representative Results
作为所述方案的概念证明，从Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2小鼠系获得的隐窝被用于其中肠干细胞显示由Barker等人建立的镶嵌GFP表达，以最初表征肠干细胞10 并允许基于其GFP表达绘制这些细胞。因此，提供了一个模型来比较不同处理下特定细胞类型群体中的ROS水平。使用ROS抑制剂（NAC）和诱导剂（tBHP），已知其作用于细胞ROS以可视化其水平的变化。
图1A 和 1B 显示了在肠类器官培养的隐窝提取过程中获得的组分F1和F4的代表性图像。在提取过程中，必须在显微镜或双筒望远镜下检查每个组分，以跟踪隐窝脱离并确定在隐窝中富集的那些组分，而不是绒毛，单细胞或碎片。然后将所选的馏分汇集在一起并通过70μm细胞过滤器以除去绒毛的所有剩余片段并获得仅含隐窝的制剂（图1C）。隐窝在嵌入BMM的几个小时内开始关闭，并且在D1处观察到圆形类器官（图1D）。3-5天后，类器官将出现代表"新形成的隐窝"的萌芽结构。类器官已准备好进行ROS分析（图1E 和 1F）。
在通过共聚焦显微镜成像氧化应激的方案中，用配备激光和滤光片的共聚焦荧光显微镜对含有类器官的载玻片进行成像，以检测Hoechst（ex/em：361/486），GFP（ex/em：488/510）和荧光探针（ex/em）：644/665）信号。配备20倍空气和63倍油浸物镜的共聚焦显微镜可以可视化ROS。在Lgr5-GFP小鼠中，GFP阳性细胞是表达Lgr5的肠干细胞。 补充图1 显示了使用20x物镜获得的代表性图像，提供了几种类器官中ROS的概述。 图3 显示了使用63x油物镜获得的表达GFP的肠道类器官的代表性图像，未经处理（NT），或预孵育或不与ROS抑制剂NAC一起孵育，以及用ROS诱导剂tBHP刺激或不刺激30分钟。
在抑制剂存在的情况下，来自类器官管腔中含有的死细胞的唯一信号是可见的。在未经处理的类器官中，显示了基础ROS水平，证明干细胞产生的ROS高于分化细胞（根据显微镜设置，ROS信号也可能在非干细胞中可视化）。GFP阳性细胞在荧光探针存在下通过诱导剂呈现更显着的细胞质信号，表明ROS水平在治疗后特别在干细胞中增加。
图4 显示了使用配备405nm，488nm和630nm激光器的流式细胞仪分析使用ROS抑制剂或诱导剂刺激或不刺激的肠道类器官中的ROS产生时获得的代表性结果。 图4A 中介绍的门控策略使得可以在整个类器官细胞群的水平上评估ROS的产生，根据物理参数和DAPI排除（SSC-A 与 FSC-A和DAPI 与 FSC-A）和FSC-H 与 FSC-A）或仅在肠道干细胞中定义完整和活细胞，进一步门控具有GFP高信号的细胞。 图 4B 显示了收集 50，000 个事件时总总体中的 ROS 水平。未处理（NT）细胞中的基础ROS水平在用抑制剂（NAC）刺激后降低，相反，在用诱导剂（tBHP）激发后增加。用抑制剂预处理然后用诱导剂刺激的细胞比单独用诱导剂刺激的细胞存在更低的水平。然后使用适当的软件分析结果，获得中位荧光强度（MFI）。获得的值以未处理细胞的比率表示，如图 4B右侧所示。 图4C 显示了与 图4B 中描述的干细胞相同的参数，作为GFP阳性细胞门控，显示NAC处理时ROS水平降低3.5倍，tBHP处理后比非刺激细胞增加4倍。该结果表明，遵循该协议，可以量化整个细胞群水平的ROS水平或GFP阳性干细胞在用特定化合物处理类器官时的差异。
图1：隐窝和类器官的代表性图像（A）与EDTA首次孵育后获得的分数F1的示例，富集在绒毛（正方形），有一些碎片（恒星）和隐窝（圆形）。（B）在隐窝中富集的分数F4的示例。（C）悬浮液仅显示用70μm细胞过滤器过滤后获得的分离隐窝（比例尺，200μm）。（D、E 和 F）。将隐窝嵌入BMM（比例尺，100μm）后，分别在1，3和5天后获得典型的类器官。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：实验计划大纲。 （A）该方案中使用的条件包括在每个实验中：未处理的孔（NT），诱导剂处理的孔（叔丁基过氧化氢- tBHP），抑制剂处理的孔（N-乙酰半胱氨酸 - NAC）以及抑制剂和诱导剂处理的孔（NAC-tBHP）。（B）用于流式细胞术测定的板格式。每个条件都一式三份电镀（A行）。B、C 和 D 系列包括仅用于荧光探针、仅使用 DAPI 或非染色 （NS） 样品的流式细胞仪设置孔。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：类器官中ROS染色的代表性共聚焦图像。 使用配备高速EMCCD相机，63x / 1.4油物镜和35μm狭缝的共聚焦显微镜获得拼接图像，使用激光器460，488，640和过滤器460/50，535/50，700/75分别获取Hoechst，GFP和荧光探针。未经处理的类器官的共聚焦光学切片（NT），用ROS抑制剂（NAC），ROS诱导剂（tBHP）处理，或用ROS抑制剂预处理，然后用ROS诱导剂（NAC-tBHP）刺激。灰色，细胞核沾有Hoechst;在绿色中，Lgr5-GFP细胞;红色，荧光探头（比例尺，50μm）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：来自类器官的细胞中ROS的代表性流式细胞术分析。 （A）流式细胞术分析中使用的门控策略的示意图：门控细胞形状（排除死细胞和积聚在类器官腔中的碎片），门控活细胞（未结合DAPI激光405的细胞），单细胞门控（双倍区分）和干细胞（GFP阳性细胞 - 激光488）（FSC：前向散射，SSC：侧散射）。ROS信号是使用630激光器采集的。（B）在左侧，使用适当的软件获得直方图，显示不同样本NT：未处理的总活体种群的强度ROS信号（在每种条件下门控约10，000个事件后）;NAC： 抑制剂治疗;tBHP诱导剂处理;NAC-tBHP：抑制剂和诱导剂治疗。在右边，一个典型的例子，即在实验期间从每个条件3个样品（平均±SD）开始的NT样品中，MFI值与NT样品的计算比率（*** P = 0.0003）。（C） 与 B 中 GFP 阳性人群相同（每种疾病 1，000 个事件）（* P = 0.02）。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充图1：类器官中ROS染色的代表性共聚焦图像。 使用配备高速EMCCD相机，20倍物镜和35μm狭缝的共聚焦显微镜，使用激光器405，488，640和滤光片460/50，535/50，700/75分别获得缝合 的images，分别采集Hoechst，GFP和荧光探针。未经处理的类器官的共聚焦光学切片（NT），用ROS抑制剂（NAC），ROS诱导剂（tBHP）处理，或用ROS抑制剂预处理，然后用ROS诱导剂（NAC-tBHP）刺激。灰色，细胞核沾有Hoechst;在绿色中，Lgr5-GFP细胞;红色，荧光探针（比例尺，100μm）。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
这项工作提供了一个循序渐进的方案，以分离小鼠空肠隐窝，将其培养成3D类器官，并通过将ROS敏感的荧光探针与整个类器官的定性显微镜成像相结合，并在类器官解离后使用流式细胞术对单个细胞进行定量ROS测量来分析类器官中的ROS。
此方法中的第一个关键步骤是加密提取过程。事实上，隐窝制剂的质量是成功形成类器官的关键。因此，获得具有富集隐窝和少量细胞碎片或垂死细胞的馏分至关重要。隐窝可以在与协议中指示的地穴不同的部分中找到，因为解离可能随小鼠的年龄和健康状况而变化。可以相应地修改EDTA孵育的数量。如果隐窝在馏分4后似乎没有分离，则需要重复3分钟的EDTA孵育。相反，假设地穴在第一次EDTA孵育后已经分离。在这种情况下，可能不需要第二次EDTA孵育，并且应该在DPBS中进行顺序涡旋步骤，直到获得具有足够没有碎片的隐窝的馏分。如果没有发生解离，请确保使用不含Ca2 + 和Mg2 + 的DPBS来制备收集管，并用新的溶液代替EDTA。地穴是脆弱的结构，因此应尽可能多地保存在冰上，并在隔离后迅速镀层。
可以使用不同的板和滴量来培养类器官。例如，在调整隐窝浓度，BMM滴的体积以及每个孔中加入的培养基后，也可以将隐窝接种在24或48孔板中。可以将多个液滴滴接种在12孔或6孔板的同一孔中。通常，隐窝的大小减小并在培养的第1天向上舍入以形成小的圆形类器官。新芽的形成应在电镀后2-3天观察。
为了研究肠干细胞中ROS水平的变化，采用了Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2小鼠系的优势。该模型的一个警告是敲入等位基因的选择性沉默以及随之而来的GFP表达的镶嵌性，这可能在干细胞或整个隐窝的斑块中不存在。在成像方案期间，并非所有类器官都会出现表达GFP的干细胞;因此，除非可以依靠细胞的空间位置，否则不会考虑所有类器官。相反，在流式细胞术方案中分析GFP阴性细胞群时，必须考虑这一点。事实上，由于不可能依赖于空间位置，GFP阴性群体将由非干细胞和GFP阴性干细胞组成。
这里提供了一个方案，用于定性评估肠道类器官中的ROS。该部件的一个关键方面与所用物镜的工作距离有关。类器官生长在BMM中;它们不附着在井的底部，与客观的焦点计划有一段距离。因此，将类器官接种在一层薄薄的BMM中至关重要，以尽量减少此问题。即使在这种优化的设置中，并非所有类器官都处于正确的位置以进行充分的成像。
可以使用适当的图像分析软件对图像进行定量分析，评估ROS信号通道中图像的平均荧光强度，如协议中所述。为此，有必要获取大量图像，以获得足够数量的事件以具有统计显著性。如前所述，使用Lgr5-GFP小鼠，并非所有类器官都会表达GFP，需要对大量样品进行成像。
在流式细胞术过程中，一个关键步骤是将类器官解离成单个细胞。如果解离过于苛刻，细胞可能会死亡并释放DNA。岩石抑制剂Y-27632用于抵消无名气，如果DNAse不干扰研究的途径，则可以将其添加到解离缓冲液中。可以使用胰蛋白酶稀释或减少孵育时间。
最后，在测试不同处理（抗氧化剂或促氧化剂）后，确定分析ROS产生的最佳时间点至关重要。对于在几分钟或几小时内快速诱导ROS的药物，成像测定可用于通过在测试化合物之前添加荧光探针来确定何时存在最大诱导。类器官刺激后探针的荧光强度可能因不同日期进行的实验而异。因此，始终计算与非刺激样品的比率并添加对照（氧化剂/抗氧化剂）以验证探针的反应性至关重要。NAC和tBHP被用作阴性和阳性对照，因为它们给出了最确凿的结果。不过，也可以使用其他试剂，例如白藜芦醇作为抗氧化剂或百草枯/甲萘醌作为氧化剂。用荧光探针孵育细胞太长时间可能是有毒的，甚至会改变细胞氧化还原平衡，因此孵育时间也必须严格控制。用探针染色的细胞可以在几个小时后固定和分析。在这种情况下，对于流式细胞术分析，DAPI无法区分活细胞和死细胞。相反，在固定之前应使用用于活/死辨别的可固定染料。
类器官也可以生长数天（超过7天），但这会增加活细胞和增殖细胞的数量以及积聚在类器官腔中的死细胞的数量，从而产生高背景，特别是在成像测定中。如果观察到荧光探针信号异常增加，请确保用于重悬刺激性化合物的溶液本身不是促氧化剂（即乙醇）。
使用该协议时要考虑的一个问题是，实时成像和细胞解离，然后进行流式细胞术可能会在细胞中诱导氧化应激并产生背景信号。根据实验可以考虑固定类器官。另一个限制来自在3D基质中生长的类器官的深入成像的困难。如协议中所述，BMM应作为薄层分布在载玻片上以限制这一方面。
在这里，该协议是使用市售的含氟染料设计的。其主要优点是它与类器官的多色染色相容性，因此特定的细胞类型。例如，可以在荧光探针孵育后立即对细胞表面标志物进行抗体染色以检测特定的亚型。然而，该探针并非特定于特定的ROS物种，因为它可以检测超氧化物，过氧化亚硝酸盐和过氧化氢11，12，13。因此，它通常用于检测全局氧化应激。虽然作为纯细胞质探针商业化，但可以发现所选的荧光探针可以到达线粒体14。由于其特异性可能因不同的细胞环境而异，我们建议在可能的情况下使用其他互补方法来测量ROS。可以使用替代染料，例如检测线粒体生成的超氧阴离子的探针10。还开发了一系列化学发光探针，以检测具有高灵敏度的特定ROS物种，例如基于荧光素的探针15，16。它们具有与 体内 成像兼容的优点，但不能用于绘制具有特定细胞类型的ROS产生图谱。最后，该协议可应用于其他类型的类器官，例如，来自人体活检的结肠类器官。在这种情况下，应相应地调整培养基17。为了进一步分析肠细胞内的氧化还原机制，该方案中描述的类器官培养和解离程序可以与整个类器官或荧光活化细胞分选（FACS）类器官细胞的转录组学和蛋白质组学方法相结合。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了法国国家研究机构（ANR）拨款17-CE14-0022（i-Stress）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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