Summary
Mevcut protokol, nitel görüntüleme ve nicel sitometri tahlilleri kullanarak bağırsak murine organoidlerindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu çalışma, seçilen bileşiklerin ROS üzerindeki etkisini test etmek için potansiyel olarak diğer floresan problara genişletilebilir.
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS) bağırsak homeostazında önemli roller oynar. ROS hücre metabolizmasının doğal yan ürünleridir. Antimikrobiyal yanıtlar ve yara iyileşmesinde rol aldıkları için mukozal düzeyde enfeksiyon veya yaralanmaya yanıt olarak üretilirler. Ayrıca, hücre büyümesi ve farklılaşma da dahil olmak üzere çeşitli yolları düzenleyen kritik ikincil habercilerdir. Öte yandan, aşırı ROS seviyeleri, hücreler için zararlı olabilen ve kronik iltihap veya kanser gibi bağırsak hastalıklarını destekleyen oksidatif strese yol açar. Bu çalışma, bağırsak murine organoidlerindeki ROS'yi canlı görüntüleme ve akış sitometrisi ile, piyasada bulunan florojenik bir prob kullanarak tespit etmek için basit bir yöntem sağlar. Burada protokol, bağırsak organoidlerindeki redoks dengesini modüle eden ve GFP ile genetik olarak etiketlenmiş bağırsak kök hücrelerinin analizi ile örneklenen belirli bağırsak hücre tiplerindeki ROS seviyelerini tespit eden bileşiklerin etkisini test etmeyi açıklamaktadır. Bu protokol diğer floresan problarla kullanılabilir.
Introduction
Reaktif oksijen türleri (ROS) hücresel metabolizmanın doğal yan ürünleridir. Ayrıca, süperoksit anion ve hidrojen peroksit1 üreten membran bağlı NADPH-Oxidases (NOX) ve Çift Oksidaz (DUOX) gibi özel enzimatik kompleksler tarafından da aktif olarak üretilebilirler. Antioksidan enzimleri ve ROS çöpçülerini ifade ederek, hücreler redoks dengelerini ince bir şekilde ayarlayabilir ve böylece doku homeostazını koruyabilir2. ROS hücreler için oldukça toksik olmasına ve DNA, protein ve lipitlere zarar verebilmesine rağmen, çok önemli sinyal molekülleridir2. Bağırsak epitelinde, kök ve progenitör hücre çoğalması için orta derecede ROS seviyeleri gereklidir3; yüksek ROS seviyeleri apoptozlarına yol açar4. Kronik oksidatif stres, enflamatuar bağırsak hastalıkları veya kanser gibi birçok gastrointestinal hastalıkla bağlantılıdır. Örnek olarak, Wnt güdümlü bağırsak kanserinin bir fare modelinde, NADPH-oksidazların aktivasyonu yoluyla yüksek ROS üretiminin kanser hücrelerinin hiperproliferasyon için gerekli olduğu bulunmuştur5,6. Bağırsak hücrelerinin, özellikle kök hücrelerin, kök hücrelerin oksidatif stresi nasıl yönettiğini ve hücresel ortamın bu kapasiteyi nasıl etkileyebileceğini tanımlamak, bu hastalığın etiyolojisini daha iyi anlamak için gereklidir7.
Bir dokuda, farklı hücre tipleri işlevlerine ve metabolizmalarına ve değişen oksidan ve antioksidan molekül seviyelerinin ifadelerine göre değişebilen bazal oksidatif bir durum sunar4,7. Ros in vivo'nun izlenmesi çok zor. Redoks durumlarına göre floresan yayan hücre geçirgen boyaları, canlı hücrelerde ve hayvanlarda hücresel ROS'yi görselleştirmek ve ölçmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, etkinliği canlı dokuların içindeki difüzyonlarına ve hızlı okumalarına bağlıdır, bu da onları hayvan modellerinde kullanımını zorlaştırır8.
Geçmişte, bileşiklerin ROS üretimi üzerindeki etkisinin incelenmesi hücre hatları kullanılarak yapılmıştır, ancak bu in vivo durumu yansıtmayabilir. Clevers9 grubu tarafından geliştirilen bağırsak organoid modeli, bağırsak birincil hücrelerinin eks vivo büyümesini sağlar. Matrislerdeki bağırsak mahzenleri kültürü, tanımlanmış büyüme faktörlerinin varlığında, kripto-villus organizasyonuni yeniden üreten organoidler (mini bağırsak) adı verilen üç boyutlu yapılara, iç lümeni kaplayan farklı epitel soyundan hücrelere ve küçük mahzen benzeri çıkıntılarda bulunan bağırsak kök hücrelerine yol açar.
Burada, bu modelden yararlanarak, organoid kültür ortamına ticari olarak mevcut bir ROS duyarlı boya ekleyerek birincil bağırsak hücrelerindeki oksidatif stresi tek hücreli çözünürlükte incelemek için basit bir yöntem tanımlanmıştır.
Plaka okuyucular genellikle toplam popülasyonda ROS üretimini tespit etmek için kullanılır. Bu protokol, genetiği değiştirilmiş hücreler veya spesifik antikor lekeleme ile belirli bir hücre tipinde ROS'yi tespit etmek için akış sitometrisi veya görüntüleme testi kullanır. Bu çalışma fare bağırsak organoid kültürünü ve ros görselleştirmeyi konfokal görüntüleme ve akış sitometrisi ile nicelemesini içerir. Lgr5-GFP fare türevi küçük bağırsak organoidlerini kullanarak, farklı tedaviler üzerine bağırsak kök hücrelerindeki oksidatif stres seviyesini özellikle analiz etmek mümkündür. Bu protokol, seçilen bileşiklerle organoidleri uyarladıktan sonra mikrobiyota türevli muramil-dipeptid (MDP)10 gibi eksojen moleküllerin ROS dengesi üzerindeki etkisini test etmek için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Institut Pasteur Kullanım Komitesi ve 2016-0022 sayılı Fransa Tarım Bakanlığı tarafından onaylandıktan sonra gerçekleştirildi. Tüm adımlar bir doku kültürü başlığı içinde gerçekleştirilir.
1. Bağırsak organoidlerini kültleme için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması
- Büyüme kültürü ortamını hazırlamak için, 1x glutamin, 1x penisilin/streptomisin (P/S) çözeltisi, 10 mM HEPES, 50 ng/mL murine EGF, 20 μg/mL murine Noggin 500 ng/mL fare R-Spondin1 ile desteklenmiş gelişmiş DMEM/ F-12'yi karıştırın (bkz. Mahzenin çıkarılması sırasında ortamı oda sıcaklığında (RT) bırakın.
NOT: Kullanılmayan ortamı -20 °C'de aliquotlarda dondurun. Donmaktan ve çözülmekten kaçının. - 50 mL'lik bir tüpü 40 mL Gelişmiş DMEM/F-12 ile doldurun ve buzda tutun.
NOT: Kullanılmayan ortamı 4 °C'de tutun. Organoidlerin geçmesi için kullanılacaktır. - 37 °C'de inkübatörde hücre kültürü plakalarını (μ-Slide 8 kuyu odaları ve/veya 96 kuyu yuvarlak alt) önceden ısıtın.
- Bodrum membran matrisini (BMM) çözün (bkz. Malzeme Tablosu) buz üzerinde aliquots (protokole başlamadan önce veya mahzenleri kaplamadan önce en az 1 saat).
NOT: BMM soğuk tutulmazsa hızla katılaşmayacaktır. - DPBS'ye (DPBS-P/S) %1 penisilin-streptomisiin çözeltisi ekleyerek yıkama/yıkama solüsyonu hazırlayın.
- 100 mm petri kabını 10 mL soğuk DPBS-P/S ile doldurun, altı 15 mL tüpü 10 mL DPBS ile doldurun ve F1'den F6'ya etiketleyin.
- DPBS'de 0,5 M EDTA'dan seyrelterek 30 mL 10 mM EDTA çözeltisi hazırlayın. İki adet 15 mL tüpü 10 mL 10 mM EDTA ile doldurun ve E1 ve E2 olarak etiketleyin.
- Tüm çözeltileri önceden 4°C'de soğutun ve işlem sırasında buzun üzerinde tutun.
2. Bağırsak organoidleri kültürü
- Ulusal kural ve yönetmeliklere göre 8-10 haftalık bir Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) fareyi kurban edin.
- Duodenum (mideden 5 cm) ve ileum (cecum'dan 10 cm) arasındaki bölgeyi kapsayan jejunumun 5-8 cm'sini toplayın ve soğuk DPBS-P/ S'de buzda tutun.
- 5-10 mL soğuk DPBS-P/S ile yıkanarak bağırsak içeriğini temizleyin.
NOT: Ev yapımı yıkama şırıngları, 10 mL'lik bir şırınna nozülüne 200 μL ucu takılarak elde edilebilir. - Top ucu makası kullanarak bağırsağı uzunlamasına açın (bkz. Malzeme Tablosu) (dokuya zarar vermemesi için).
- Torplas kullanarak, dokuyu oda sıcaklığında soğuk DPBS-P/S içeren bir petri kabına aktarın ve durulamak için çalkalayın.
- Plastik bir Pasteur pipet ile bağırsağı aspirasyonla tutun ve 10 mL soğuk 10 mM EDTA içeren E1 etiketli 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tüpü 3 kez ters çevirin ve 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
- Plastik bir Pasteur pipet kullanarak, dokuyu 10 mL DPBS içeren F1 tüpüne aktarın. 2 dakika boyunca girdap (normal girdapta, tüpü elle tutmak ve bağırsağın güzelce dönmesine izin verir).
- Fraksiyonun 10 μL'sini bir petri kabına koyun ve fraksiyonun kalitesini mikroskop altında değerlendirin.
NOT: Tüm girdap adımları maksimum hızda gerçekleştirilir ve her kesir kalitesi mikroskop altında değerlendirilmelidir (Şekil 1). - Plastik bir Pasteur pipet ile bağırsağı aspirasyonla tutun ve 10 mL DPBS ve girdap içeren F2 tüpünde 2 dakika aktarın.
- 10 mL DPBS ve girdap içeren F3 tüpündeki dokuyu 2 dakika boyunca aktararak 2.10 adımını tekrarlayın.
- 10 mM EDTA içeren E2 tüpündeki dokuyu transfer ederek 2.6.
- Tüpü 3 kez ters çevirin ve 5 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
- 10 mL DPBS ve girdap içeren F4 tüpündeki dokuyu 3 dakika boyunca aktararak 2.10 adımını tekrarlayın.
- 10 mL DPBS ve girdap içeren F5 tüpündeki dokuyu 3 dakika boyunca aktararak 2.14 adımını tekrarlayın.
- 10 mL DPBS ve girdap içeren F6 tüpündeki dokuyu 3 dakika boyunca aktararak 2.15 adımını tekrarlayın.
- Villi ve önemli döküntüleri ortadan kaldırmak için yerçekimi ile 70 μm hücre süzgeçleri aracılığıyla süzülen en iyi fraksiyonları 50 mL'lik bir tüpte (buz üzerinde) birleştirin.
NOT: Genellikle, F5 ve F6 çok sayıda mahzen ve daha az döküntü içeren kesirlerdir. - 4 °C'de 150 x g'daki mahzenleri 3 dakika döndürün.
- Tüpü boşaltın, peletin mekanik olarak bozulacağı ve 5 mL soğuk DMEM/F12 ekleyin.
- Süspansiyonun 10 μL'sini bir petri kabına koyun ve aliquot'ta bulunan mahzen sayısını mikroskop altında manuel olarak sayın.
NOT: Tek hücre veya küçük döküntüleri sayma. - Kuyu başına 300 mahzenin kaplandığını, W'nun kuyu sayısı olduğunu ve N'nin süspansiyonun 10 μL'sinde sayılan mahzen sayısı olduğunu göz önünde bulundurarak, μL'de gerekli olan mahzen süspansiyonunun hacmini (V) hesaplayın. Mahzenleri yeni bir 15 mL tüpe aktarın.
NOT: V = 300 x W x 10/N. Planlanan deneyde küçük bir hacim kullanılırsa, 1,5 mL santrifüj tüpü kullanılabilir. - 200 x g'daki mahzenleri 4 °C'de 3 dakika döndürün.
- Bir pipet kullanarak süpernatant dikkatlice çıkarın.
- Peleti mekanik olarak bozun ve 90 mahzen / μL konsantrasyon elde etmek için büyüme kültürü ortamını hafifçe ekleyin.
- 30 mahzen/μL'lik son konsantrasyona sahip olmak için 2 hacim sulandırılmamış BMM ekleyin.
NOT: BMM katılaşmasını önlemek için tüpü her zaman buzda tutun. - Her kuyuya 10 μL'lik mahzen/BMM karışımı plakası. Akış sitometrisi analizi için yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakaları kullanın. Her birinin ortasına 10 μL ve bir kubbe dağıtın. Görüntüleme için μ-slide 8 kuyusunu kullanın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 10 μL'yi ince bir tabaka olarak biriktirin.
NOT: Organoidleri, derinlemesine görüntülemelerini sağlamak için görüntüleme testini için ince bir tabaka olarak plakalayın. - BMM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı RT'de 5 dakika bekletin. Plakayı 37 °C'de inkübatöre ve 15 dakika boyunca% 5 CO2'ye yerleştirin.
- BMM'yi ayırmamaya dikkat ederek her kuyuya 250 μL büyüme ortamı ekleyin.
- Plakaları 37 °C ve%5 CO2'de inkübatöre yerleştirin.
- Ros analizini kültürün 4 ila 6. Aksi takdirde, ortamı değiştirin ve birkaç ve uzun tomurcuklanan yapının ortaya çıkmasından sonra ve ölü hücreler organoid lümenlerine biriktiğinde organoidleri bölün.
3. Organoidler geçiyor
- Küçük bağırsak organoidlerini, önemli tomurcuklanma yapılarının oluştuğu ve organoidlerin lümenlerinin karanlıklaştığı kültürün 6.
NOT: Organoidin lümeni ölü hücrelerin, döküntülerin ve mukusun birikmesi nedeniyle koyulaşır. Organoidlerin bölünmeden önce aşırı büyümesine izin vermekten kaçının. Bölünme oranı organoidlerin büyümesine bağlıdır. Organoidlerin 6. günde 1:2 ve 10. günde 1:3 oranıyla geçmesi önerilir. - 15 mL'lik bir tüpü 4 mL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ile doldurun ve buzda tutun.
NOT: Burada, 96 kuyulu bir kültür plakası için hacimler sağlanmaktadır. Farklı bir biçim kullanılıyorsa, ses düzeyini buna göre ayarlayın. - Ortamı BMM kubbelerine dokunmadan kuyulardan pipet veya vakum pompası ile dikkatlice emiş ve atın.
- Kuyu başına 100 μL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ekleyin. BMM'yi kırmak ve kuyunun içeriğini 15 mL'lik tüpe aktarmak için pipet yukarı ve aşağı.
- Kuyuyu 200 μL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ile yıkayın ve aynı tüpte toplayın.
NOT: Aynı deneysel durumdan birden fazla kuyu geçiyorsa, kuyuların içeriği aynı 15 mL toplama tüpünde birikebilir. - 15 mL toplama tüpünü 100 x g'da 4°C'de 5 dakika döndürün.
- Süpernatantı atın ve peletin içine 1mL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ekleyin. P1000 ucu kullanarak, bir P10 ucu (filtresiz) ve pipetle en az 20 kez yukarı ve aşağı alın.
- Tüpe 4 mL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ekleyin. 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
- Peletin rahatsız etmeden bir pipet veya vakum pompası ile süpernatantı aspire edin. Ardından, peletin mekanik olarak bozulması.
- Büyüme kültürü ortamında seyreltilmiş BMM ekleyin (2:1 oranı). Karışıma hava kabarcıkları sokmadan dikkatlice yukarı ve aşağı pipet.
- Her kuyuya 10 μL'lik mahzen/BMM karışımı plakası.
- BMM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı RT'de 5 dakika tutun. Plakayı 37 °C'de inkübatöre ve 15 dakika boyunca% 5 CO2'ye yerleştirin.
- Her kuyuya 250 μL büyüme ortamı ekleyin.
NOT: BMM'yi ayırmamaya dikkat edin. - Plakaları 37 °C ve%5 CO2'de inkübatöre yerleştirin.
4. Bağırsak organoidlerindeki oksidatif stresi değerlendirmek için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması
- inhibitör N-asetilsistein (NAC) için 250 mM stok çözeltisi hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu), 245 μL DPBS ile 10 mg'ı yeniden kullanın. 1 mM son konsantrasyonda kullanın.
- 50 mM'lik bir indükleyici Tert-butil hidroperoksit (tBHP) stok çözeltisi hazırlayın, suda% 70, 496,8 μL DPBS ile 3,22 μL seyreltin. 200 μM son konsantrasyonda kullanın.
- Akış sitometrisi çalışması için, DMSO'daki stok çözeltisini 1/10 seyrelterek florojenik bir probun 250 μM çalışma çözeltisini hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). 1 μM son konsantrasyonda kullanın.
NOT: Üreticinin talimatlarında belirtildiği gibi, florojenik prob ışığa ve oksijene duyarlıdır. Stoklar ve aliquotlar çok fazla açık ve kapalı olmamalıdır. - Görüntüleme çalışması için, DMSO'daki stok çözeltisini 1/2 seyrelterek florojenik probun 1,25 mM'lik bir çalışma çözeltisini hazırlayın. 5 μM son konsantrasyonda kullanın.
- Akış sitometrisi testinde ölü hücre ayrımcılığı için kullanılmak üzere DPBS'de 0,1 μg/mL DAPI nihai bir çözelti hazırlayın.
- DPBS'de Hoechst 33342 ila 1.25 mg/mL arasında seyreltin. Görüntüleme testinde nükleer boyama için kullanılacak 5 μg/mL son konsantrasyonda kullanın.
- 37 °C'de fenol kırmızısı olmadan sıcak DMEM.
NOT: Bu adımlar, Şekil 2A'da belirtilen koşulları kullanarak, herhangi bir tahlilde yer alınması gereken negatif ve pozitif denetimlerin kullanılmasını açıklar. Test, anti-veya pro-oksidan bileşikleri test etmek için kullanılabilir. Adımlar aynıdır ve tek fark, bileşiklerin florojenik boyayı kullanmadan önce eklenmesidir.
5. 3D organoidlerde oksidatif stresin konfokal mikroskopi ile görselleştirilmesi
- μ-Slide 8 kuyu odalarına kaplanlanmış organoidleri alın ve 1 mM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için ilgili kuyulara 1 μL NAC stok çözeltisi ekleyin.
- 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın ve% 5 CO2.
- 200 μM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için ilgili kuyulara 1 μL tBHP stok çözeltisi ekleyin.
- 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
- 5 μM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için florojenik probun 1,25 mM seyreltilmesinin kuyusu başına 1 μL ekleyin.
- Son konsantrasyonu elde etmek için Hoescht'in 1,25 mg/mL seyreltilmesinin kuyusu başına 1 μL ekleyin.
- 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
- BMM'yi bozmadan ortamı çıkarın. Yavaşça, fenol kırmızısı olmadan 250μL ılık DMEM ekleyin.
NOT: Uzun vadeli bir satın alma planlanıyorsa, fenol kırmızısı olmadan DMEM'e büyüme faktörleri bileşikleri ekleyin. - Organoidleri, florojenik probu (ROS) algılayan bir terik oda ve gaz kaynağı ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.
NOT: Florojenik prob için eksitasyon/emisyon (ex/em) 644/665, Hoechst (çekirdek) için ex/em 361/486 ve GFP için ex/em (Lgr5-GFP farelerinden bağırsak kök hücresi) 488/510'dur. Kök hücrelerdeki sinyalleri tespit etmek için 63x yağ daldırma hedefi kullanılır. Örnekler arasında lazer ayarlarını değiştirmeyin. ROS üretimine genel bir bakış sağlamak için 20x hedefi kullanılabilir. - ROS sinyali için lazer yoğunluğu ve zamana maruz kalma ayarlamak ve bu sinyalin negatif kontrolde daha düşük olup olmadığını kontrol etmek için pozitif kontrolü kullanın.
- Lazer yoğunluğunu ifade eden GFP organoidlerini tanımlamak ve ayarlamak için slaytı göz merceği ekranı kullanarak.
NOT: Bu adım el ile gerçekleştirilir. - Tüm organoidin dikişli bir görüntüsünü elde etmek için pozisyonları tanımlayın. Organoidlerin bir hücre katmanını gösteren bir bölümünü elde etmek için 25 μm 'lik (adım boyutu 5 μm) bir z yığını kur.
NOT: Kurulumu optimize etmek için mikroskop kullanım kılavuzuna bakın. Canlı hücreler kullanılarak, inkübasyonun bitiminden sonra 1 saat içinde edinim yapılmalıdır. - Görüntüleri açık kaynaklı bir görüntü işleme yazılımında açın (bkz. Malzeme Tablosu).
- z yığınından geçin ve organoidlerin ortasının iyi temsil edildiği bölümü seçin ve seçilen alanla yeni bir görüntü oluşturun.
- Görüntüleri 5.15.1 - 5.15.5 adımlarına göre ölçün.
- Serbest çizgi aracını seçin.
- Çekirdeği takip eden bir çizgi çizin.
NOT: Yalnızca kök hücreler analiz edilirse, yalnızca GFP pozitif hücreleri sunan bölgeleri seçin. - Işık döküntülerini dahil etmeden hücre katmanını çizgiyle kaplayacak şekilde çizgi genişliğini artırın.
- ROS sinyali için kanalı seçin ve seçilen bölgedeki floresan yoğunluğunu ölçün ve değerlere açıklama ekleme.
- Sinyalin olmadığı bir çizgi çizin ve son yoğunluğu elde etmek için önceki değere çıkarılacak arka planın floresan yoğunluğunu ölçün.
6. Akış sitometresi kullanılarak ayrışmış organoidler üzerindeki oksidatif stresin ölçülmesi
- 1 mM'lik son konsantrasyon elde etmek için negatif kontroller için kuyulara 1 μL NAC stok çözeltisi ekleyin.
NOT: 96 kuyulu yuvarlak tabanlı plakalarda kaplanmuş organoidleri kullanın. - 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın ve% 5 CO2.
- 200 μM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için ilgili kuyulara 1 μL tBHP stok çözeltisi ekleyin.
- 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Çok kanallı pipetle, bağlı BMM'yi bozmadan ortamı çıkarın ve başka bir 96 kuyu yuvarlak alt plakaya aktarın. Bu tabağı bir kenara bırak.
- 100 μL tripsin ekleyin ve çok kanallı bir pipetle, BMM'yi yok etmek için en az beş kez pipet yukarı ve aşağı.
- 37 °C ve %5 CO2'de 5 dakikadan fazla kuluçkaya yatmayın.
- Çok kanallı pipetle, organoidleri ayrıştırmak için en az beş kez pipet yukarı ve aşağı.
- RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da dön.
- Plakayı ters çevirerek süpernatant atın. 6.3. adımda toplanan ortamı ilgili kuyulara geri ekleyin ve 5 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri yeniden biriktirin.
- Florojenik probu 1 μM'lik son konsantrasyonda ekleyin.
NOT: Florojenik probu cihazın ayarları için gereken kuyulara eklemeyin (Şekil 2B). - RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da dön.
- Hücreleri 250 μL 0,1 μg/mL DAPI çözeltisi ile yeniden kullanın. Numuneleri uygun Akış sitometri tüplerine aktarın, tüpleri buzda tutun ve analize devam edin.
NOT: Cihazın ayarları için gereken kuyulara DAPI yerine PBS ekleyin (Şekil 2B). - Tek lekeli numuneler kullanarak her florofor için ellenmemiş kontrol ve lazer voltajlarında ileri ve yan dağılım gerilimi ayarlarını optimize edin.
- Uygun bir gating stratejisi kullanarak (Şekil 4A), en az 20.000 olay toplayın.
NOT: 50.000 etkinlik tercih edilmektedir. Detaylı alım ayarları kullanılan enstrümana göre değişiklik gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan protokolün bir kavram kanıtı olarak, Bağırsak kök hücrelerinin Barker ve arkadaşları tarafından kurulan mozaik GFP ekspresyonunun görüntülendiği Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 fare hattından elde edilen mahzenler, başlangıçta bağırsak kök hücrelerini karakterize etmek için kullanıldı10 ve bu hücreleriN GFP ifadelerine göre haritalandırılmasına izin vermek için. Böylece, farklı tedaviler üzerine belirli bir hücre tipi popülasyondaki ROS seviyelerini karşılaştırmak için bir model sağlanır. Bir ROS inhibitörü (NAC) ve seviyelerindeki değişiklikleri görselleştirmek için hücresel ROS'a etki ettikleri bilinen bir indükleyici (tBHP) kullanıldı.
Şekil 1A ve 1B , bağırsak organoid kültürü için kript çıkarma prosedürü sırasında elde edilen F1 ve F4 fraksiyonlarının temsili görüntülerini göstermektedir. Her kesir, çıkarma prosedürü sırasında bir mikroskop veya dürbün altında kontrol edilmeli ve mahzenlerin ayrılmasını izlemeli ve villi, tek hücre veya döküntü yerine mahzenlerde zenginleştirilmiş fraksiyonları tanımlamalıdır. Seçilen fraksiyonlar daha sonra bir araya getirilir ve kalan tüm villi parçalarını çıkarmak ve sadece mahzenlerle bir preparat elde etmek için 70 μm hücre süzgeçten geçirilir (Şekil 1C). Bmm'ye gömülmeden birkaç saat sonra mahzenler kapanmaya başlar ve D1'de yuvarlak organoidler gözlendi (Şekil 1D). 3-5 gün sonra, organoidler "yeni oluşan mahzenleri" temsil eden tomurcuklanan yapılarla görünecektir. Organoidler ROS analizi için hazırdır (Şekil 1E ve 1F).
Konfokal mikroskopi ile oksidatif stresin görüntülenmesi protokolünde, organoidleri içeren slayt, prob ile inkübe edilmiş, Hoechst (ex/em: 361/486), GFP (ex/em: 488/510) ve florojenik prob (ex/em): 644/665) sinyallerini tespit etmek için lazerler ve filtrelerle donatılmış bir konfokal floresan mikroskopla görüntülenmiştir. 20x hava ve 63x yağ daldırma hedefi ile donatılmış bir konfokal mikroskop ROS'un görselleştirilmesine izin verdi. Lgr5-GFP farelerinde, GFP pozitif hücreler Lgr5 eksprese eden bağırsak kök hücreleridir. Ek Şekil 1, çeşitli organoidlerde ROS'a genel bir bakış sağlayan 20x hedefiyle elde edilen temsili görüntüleri göstermektedir. Şekil 3 , GFP, tedavi edilmeyen (NT) veya ROS inhibitörü NAC ile önceden inkübe edilmiş veya inkübe edilmemiş bağırsak organoidlerinin 63x yağ hedefi ile elde edilen ve ROS indükleyici tBHP ile 30 dakika boyunca uyarılmış veya uyarılmış veya değil temsili görüntüleri göstermektedir.
inhibitörün varlığında, organoidin lümeninde bulunan ölü hücrelerden gelen tek sinyal görülebilir. Tedavi edilmeyen organoidde bazal ROS seviyeleri gösterilir ve kök hücrelerin farklılaştırılmış hücrelerden daha yüksek ROS ürettiğini kanıtlar (mikroskop ayarlarına göre, ROS sinyali kök olmayan hücrelerde de görselleştirilebilir). GFP pozitif hücreler, florojenik prob varlığında indükleyici ile daha önemli bir sitoplazmik sinyal sunarak, ros seviyelerinin özellikle tedaviden sonra kök hücrelerde arttığını gösterir.
Şekil 4, 405 nm, 488 nm ve 630 nm lazerlerle donatılmış bir Akış sitometresi kullanılarak, ROS inhibitörü veya indükleyici ile uyarılan veya uyarılan bağırsak organoidlerinde ROS üretimini analiz ederken elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Şekil 4A'da sunulan gating stratejisi, ROS üretimini tüm organoid hücre popülasyonu düzeyinde değerlendirmeyi mümkün kılar, fiziksel parametrelere ve DAPI dışlamasına (SSC-A ve FSC-A'ya karşı FSC-A ve FSC-A'ya karşı FSC-A) veya sadece bağırsak kök hücrelerinde, GFP yüksek sinyalli hücreler üzerinde daha fazla kapılı sağlam ve canlı hücreler tanımlar. Şekil 4B, 50.000 etkinliğin toplanması üzerine toplam nüfustaki ROS seviyelerini göstermektedir. Tedavi edilmeyen (NT) hücrelerdeki bazal ROS düzeyleri inhibitör (NAC) ile uyarılmadan sonra azalır ve aksine indükleyici (tBHP) ile meydan okumadan sonra artar. inhibitör ile önceden tedavi edilen ve daha sonra indükleyici ile uyarılan hücreler, sadece indükleyici ile uyarılanlardan daha düşük bir seviye sunar. Sonuçlar daha sonra uygun yazılım kullanılarak analiz edildi ve ortanca floresan yoğunluğu (MFI) elde edildi. Elde edilen değerler, Şekil 4B'nin sağında sunulan grafikte gösterildiği gibi, tedavi edilmeyen hücrelere göre bir oran olarak sunulmaktadır. Şekil 4C, GFP pozitif hücreleri olarak kapılı kök hücrelerde Şekil 4B'de açıklanan parametrelerin aynısını göstererek, NAC tedavisi üzerine ROS seviyesinde 3,5 kat azalma ve uyarılmamış hücreler üzerinde tBHP tedavisinde 4 kat artış göstermektedir. Bu sonuç, bu protokolü takiben, organoidlerin belirli bileşiklerle tedavileri üzerine ros düzeylerindeki farklılıkların tüm hücre popülasyonu düzeyinde veya GFP pozitif kök hücrelerde ölçülmesinin mümkün olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Mahzenlerin ve organoidlerin temsili görüntüleri. (A) EDTA ile ilk inkübasyondan sonra elde edilen, villi (kare), bazı döküntüler (yıldız) ve mahzenler (daire) ile zenginleştirilmiş kesir F1 örneği. (B) Mahzenlerde zenginleştirilmiş kesir F4 örneği. (C) Filtrasyondan sonra elde edilen sadece izole edilmiş mahzenleri 70 μm hücre süzgeçli (ölçek çubuğu, 200 μm) sunan süspansiyon. (D, E ve F). Tipik organoidler sırasıyla 1, 3 ve 5 gün sonra, mahzenleri BMM'ye gömdkten sonra elde edildi (ölçek çubuğu, 100 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Deneysel planın ana hatları. (A) Bu protokolde kullanılan koşullar her deneyde yer aldı: tedavi edilmeyen kuyular (NT), indükleyici ile tedavi edilen kuyular (tert-Butil hidroperoksit - tBHP), inhibitörle tedavi edilen kuyular (N-asetil sistein - NAC) ve inhibitör ve indükleyici ile tedavi edilen kuyular (NAC-tBHP). (B) Akış sitometrisi tahlili için plaka formatı. Her koşul üç taraflı olarak kaplanlıdır (A hattı). B, C ve D hatları, yalnızca florojenik prob, yalnızca DAPI veya lekesiz (NS) numunelerle akış sitometresi ayarı için kuyular içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Organoidlerde ROS boyamanın temsili konfokal görüntüleri. Dikişli görüntüler yüksek hızlı EMCCD Kamera ile donatılmış bir konfokal mikroskop ile elde edildi, Hoechst, GFP ve florojenik probu elde etmek için 405, 488, 640 ve filtreleri 460/50, 535/50, 700/75 lazerleri kullanarak 63x/1.4 yağ hedefi ve yarık 35 μm. Organoidlerin konfokal optik bölümleri tedavi edilmez (NT), ROS inhibitörü (NAC), ROS-indükleyici (tBHP) ile tedavi edilir veya ROS inhibitörü ile önceden tedavi edilir ve daha sonra ROS indükleyicisi (NAC-tBHP) ile uyarılır. Gri, hoechst ile lekeli çekirdek; yeşil, Lgr5-GFP hücrelerinde; kırmızı, florojenik prob (ölçek çubuğu, 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Organoidlerden elde edilen hücrelerde ROS'un temsili akış sitometri analizi. (A) Akış sitometri analizinde kullanılan gating stratejisinin şematik gösterimi: hücre şekli için gating (organoid lümeninde biriken ölü hücrelerin ve döküntülerin hariç tutulması), canlı hücreler için gating (DAPI-lazer 405 içermeyen hücreler), tek hücreler için gating (çiftt ayrımcılığı) ve kök hücreler (GFP pozitif hücreler-lazer 488) (FSC: ileri saçılma, SSC: yan dağılım). ROS sinyali 630 lazer kullanılarak alındı. (B) Solda, farklı örneklerde toplam canlı popülasyonu için ROS sinyallerinin yoğunluğunu gösteren uygun bir yazılımla histogramlar elde edildi (durum başına yaklaşık 10.000 olay gating edildikten sonra) : tedavi edilmemiş; NAC: inhibitör ile tedavi edilir; tBHP indükleyici ile tedavi edilir; NAC-tBHP: inhibitör ve indükleyici-tedavi. Sağda, koşul başına 3 örnekten (ortalama ± SD) (*** P = 0,0003) başlayan bir deneme sırasında elde edilen NT örnekleri üzerinde MFI değerleri için hesaplanan oranın tipik bir örneği. (C) GFP pozitif popülasyonu için B ile aynıdır (durum başına 1.000 olay) (* P = 0,02). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Organoidlerde ROS boyamanın temsili konfokal görüntüleri. Dikişli images yüksek hızlı EMCCD Kamera ile donatılmış bir konfokal mikroskop ile elde edildi, Hoechst, GFP ve florojenik probu elde etmek için 405, 488, 640 ve filtreleri 460/50, 535/50, 700/75 lazerleri kullanarak 20x hedef ve yarık 35 μm. Organoidlerin konfokal optik bölümleri tedavi edilmez (NT), ROS inhibitörü (NAC), ROS-indükleyici (tBHP) ile tedavi edilir veya ROS inhibitörü ile önceden tedavi edilir ve daha sonra ROS indükleyicisi (NAC-tBHP) ile uyarılır. Gri, hoechst ile lekeli çekirdek; yeşil, Lgr5-GFP hücrelerinde; kırmızı, florojenik probda (ölçek çubuğu, 100 μm). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, murine jejunal mahzenleri izole etmek, 3D organoidler halinde kültürlemek ve ROS'a duyarlı florojenik bir probu tüm organoidlerin nitel mikroskopisi ve organoid ayrışmasını takiben tek hücrelerde akış sitometrisi kullanarak nicel ROS ölçümü ile birleştirerek organoidlerde ROS'u analiz etmek için adım adım bir protokol sağlar.
Bu yöntemin ilk kritik adımı, mahzen çıkarma prosedürüdür. Gerçekten de, mahzenlerin hazırlanmasının kalitesi başarılı organoid oluşumunun anahtarıdır. Bu nedenle, zenginleştirilmiş mahzenler ve az sayıda hücresel döküntü veya ölmekte olan hücrelerle fraksiyonlar elde etmek önemlidir. Ayrışma farenin yaşına ve sağlık durumuna göre değişebileceğinden, mahzenler protokolde belirtilenlere farklı kesirlerde bulunabilir. EDTA inkübasyonlarının sayısı buna göre değiştirilebilir. Kesir 4'den sonra mahzenler kopmuyor gibi görünüyorsa, 3 dk EDTA inkübasyonunun tekrarlanması gerekir. Tersine, ilk EDTA inkübasyonundan sonra mahzenlerin zaten kopmuş olduğunu varsayalım. Bu durumda, ikinci EDTA inkübasyonu gerekli olmayabilir ve DPBS'deki sıralı girdap adımları, enkazdan yoksun yeterli mahzenle kesirler elde edilene kadar yapılmalıdır. Herhangi bir ayrışma olmazsa, toplama tüplerini hazırlamak için Ca2+ ve Mg2+ içermeyen DPBS'nin kullanıldığından emin olun ve EDTA'yı yeni bir çözümle değiştirin. Mahzenler kırılgan yapılardır, bu nedenle mümkün olduğunca buz üzerinde tutulmalı ve izolasyondan sonra hızla kaplanmalıdır.
Organoid yetiştirmek için farklı plakalar ve damla hacimleri kullanılabilir. Örneğin, mahzenler konsantrasyonu, BMM damlasının hacmi ve her kuyuya eklenen ortam ayarlandıktan sonra 24 veya 48 kuyu plakasında da kaplanabilir. Aynı kuyuda 12 veya 6 kuyulu bir plakada birden fazla damla kaplanabilir. Genellikle, mahzenlerin boyutu azalır ve kültürün 1. Kaplamadan 2-3 gün sonra yeni tomurcukların oluşumu gözlenmelidir.
Bağırsak kök hücrelerindeki ROS seviyelerindeki değişiklikleri incelemek için Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 fare hattının avantajı alındı. Bu modelin bir uyarısı, darbeli alelenin seçici susturması ve bunun sonucunda kök hücre yamalarında veya tüm mahzenlerde bulunmayan GFP ifadesinin mozaikizmidir. Görüntüleme protokolü sırasında, tüm organoidler GFP'yi ifade eden kök hücreler sunmaz; bu nedenle, hücrelerin mekansal konumuna güvenmek mümkün olmadıkça tüm organoidler dikkate alınmayacaktır. Bunun yerine, Akış sitomemetrisi protokolündeki GFP negatif hücre popülasyonu analiz edilirken bu dikkate alınmalıdır. Nitekim, mekansal pozisyona güvenmek imkansız olduğundan, GFP negatif popülasyon kök olmayan hücrelerden ve GFP negatif kök hücrelerden oluşacaktır.
Burada ros'un bağırsak organoidlerinde nitel değerlendirilmesi için bir protokol sağlanmaktadır. Bu bölüm için kritik bir husus, kullanılan hedeflerin çalışma mesafesine bağlıdır. Organoidler BMM'de yetiştirilir; kuyunun altına bağlı değildirler, bu da hedef odak planından bir mesafe getirmektedir. Bu nedenle, organoidlerin ince bir BMM tabakasında tabaka haline getirmek, bu sorunu en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. Bu optimize edilmiş ortamda bile, tüm organoidler yeterli görüntülenecek doğru konumda olmayacaktır.
Görüntülerin nicel bir analizi, protokolde açıklandığı gibi ROS sinyal kanalındaki görüntülerin ortalama floresan yoğunluğunu değerlendiren uygun bir görüntü analizi yazılımı kullanılarak yapılabilir. Bu amaçla, istatistiksel olarak anlamlı olacak yeterli sayıda olay elde etmek için yüksek sayıda görüntü elde etmek gerekir. Daha önce de belirtildiği gibi, Lgr5-GFP farelerini kullanarak, tüm organoidler GFP'yi ifade etmeyecek ve önemli sayıda numunenin görüntülenerek görüntülenilmesini gerektirmeyecektir.
Akış sitometrisi prosedürü sırasında, kritik bir adım organoidlerin tek hücrelere ayrışmasıdır. Eğer ayrışma çok sertse, hücreler ölebilir ve DNA salgılayabilir. Anoikis'e karşı koymak için bir kaya inhibitörü, Y-27632 ve çalışılan yola müdahale etmezlerse dissosasyon tamponu için DNAse eklenebilir. Trypsin seyreltme veya azaltılmış kuluçka süreleri kullanılabilir.
Son olarak, test edilen farklı tedavilerden (anti-veya pro-oksidan) sonra ROS üretimini analiz etmek için en iyi zaman noktasını tanımlamak çok önemlidir. Ros'a dakikalar veya saatler içinde hızla indükleyen ilaçlar söz konusu olduğunda, görüntüleme testi, test edilen bileşiklerden önce florojenik probu ekleyerek maksimum indüksiyonun ne zaman olduğunu belirlemek için kullanılabilir. Organoid stimülasyonundan sonra probun floresan yoğunluğu, farklı günlerde yapılan deneyler arasında değişebilir. Bu nedenle, uyarılmamış numunelerle oranı hesaplamak ve probun reaktivitesini doğrulamak için kontroller (oksidan / antioksidan) eklemek her zaman çok önemlidir. NAC ve tBHP en kesin sonuçları verdikleri için negatif ve pozitif kontroller olarak kullanılmıştır. Yine de, antioksidan olarak resveratrol veya oksidan olarak paraquat / menadion gibi diğer reaktifler kullanılabilir. Florojenik prob ile hücrelerin çok uzun süre inkübasyonu toksik olabilir ve hatta hücre redoks dengesini değiştirebilir, bu nedenle kuluçka süreleri de sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Prob ile lekelenmiş hücreler birkaç saat sonra sabitlenebilir ve analiz edilebilir. Bu durumda, akış sitometri analizi için DAPI canlı ve ölü hücreler arasında ayrım yapamaz. Bunun yerine, fiksasyondan önce canlı/ölü ayrımcılığı için sabitlenebilir bir boya kullanılmalıdır.
Organoidler de birkaç gün boyunca (7'den fazla) yetiştirilebilir, ancak bu, canlı ve proliferatif hücrelerin ve organoid lümenlerinde biriken ölü hücrelerin sayısını artıracak ve özellikle görüntüleme testinde yüksek arka plan üretecektir. Florojenik prob sinyalinde anormal bir artış gözlenirse, uyarıcı bileşikleri yeniden depolamak için kullanılan çözeltinin se başına pro-oksidan (yani etanol) olmadığından emin olun.
Bu protokolü kullanırken göz önünde bulundurulması gereken bir endişe, akış sitometrisi tarafından takip edilen canlı görüntüleme ve hücre ayrışmasının hücrelerde oksidatif strese neden olabileceği ve bir arka plan sinyali oluşturabileceğidir. Deneye göre organoidlerin sabitlenmesi düşünülebilir. Başka bir sınırlama, 3D matriste yetişen organoidlerin derinlemesine görüntülenmesinde zorlanmadan kaynaklanmaktadır. Protokolde belirtildiği gibi, BMM bu yönü sınırlamak için slaytta ince bir katman olarak dağıtılmalıdır.
Burada, protokol piyasada bulunan florojenik boya kullanılarak tasarlanmıştır. Birincil avantajı, organoidlerin çok renkli boyanması ile uyumluluğudur, böylece belirli hücre tipleri. Örneğin, florojenik prob inkübasyonundan hemen sonra hücre yüzeyi belirteçleri için antikor boyama belirli alt tipleri tespit etmek için yapılabilir. Bununla birlikte, prob Superoksit, Nitrit peroksit ve hidrojen peroksit11,12,13'ü tespit debildiği için belirli bir ROS türüne özgü değildir. Bu nedenle, genellikle küresel oksidatif stresi tespit etmek için kullanılır. Sadece sitosoleik prob olarak ticarileştirilmesine rağmen, seçilen florojenik probun mitokondri14'e ulaştığı tespit edilebilir. Özgüllüğü farklı hücresel bağlamlar arasında değişebileceğinden, mümkün olduğunda ROS'u ölçmek için diğer tamamlayıcı yaklaşımları kullanmanızı öneririz. Mitokondri tarafından üretilen süperoksit anionlarını tespit etmek için özel problar gibi alternatif boyalar kullanılabilir10. Luciferin bazlı problar15,16 gibi yüksek hassasiyete sahip belirli ROS türlerini tespit etmek için bir chemiluminescent prob repertuarı da geliştirilmiştir. Bunlar in vivo görüntüleme ile uyumlu olma avantajına sahiptir, ancak ROS üretimini belirli hücre türleriyle eşlemek için kullanılamaz. Son olarak, bu protokol diğer organoid türlerine, örneğin insan biyopsilerinden elde edilen kolonik organoidlere uygulanabilir. Bu durumda, kültür büyüme ortamı buna göre uyarlanmalıdır17. Bağırsak hücrelerindeki redoks makinelerini daha fazla analiz etmek için, bu protokolde açıklanan organoid kültürü ve ayrıştırma prosedürleri, tüm organoidler veya Floresan aktif hücre sıralanmış (FACS) organoid hücreleri üzerinde transkriptomik ve proteomik yaklaşımlarla birleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) hibe 17-CE14-0022 (i-Stress) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
