배양된 뼈 세포와 분리된 뼈축의 아미노산 소비 평가

아미노산은 각 아미노산에 특이적인 가변 측쇄를 가진 아미노(-_NH2) 및 카르복실(-COOH) 작용기를 포함하는 유기 화합물입니다. 일반적으로 아미노산은 단백질의 기본 구성 성분으로 잘 알려져 있습니다. 보다 최근에는 아미노산의 새로운 용도와 기능이 해명되었습니다. 예를 들어, 개별 아미노산은 생체 에너지학에 기여하거나, 효소 보조 인자로서 기능하거나, 활성 산소 종을 조절하거나, 다른 아미노산 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10을 합성하는 데 사용되는 중간 대사 산물을 생성하기 위해 대사 될 수 있습니다. . 많은 연구에서 아미노산 대사가 다양한 맥락에서 세포 다 능성, 증식 및 분화에 중요하다는 것을 보여줍니다 3,6,11,12,13,14,15,16,17.

조골세포는 콜라겐 유형 1이 풍부한 세포외 뼈 기질을 생성하고 분비하는 분비 세포입니다. 뼈가 형성되는 동안 높은 단백질 합성 속도를 유지하기 위해 조골 세포는 아미노산의 지속적인 공급을 요구합니다. 이러한 요구를 충족시키기 위해 조골 세포는 적극적으로 아미노산을 획득해야합니다. 이와 일치하여 최근 연구는 조골 세포 활동 및 골 형성 15,16,17,18,19,20에서 아미노산 흡수 및 대사의 중요성을 보여줍니다.

조골 세포는 세 가지 주요 공급원으로부터 세포 아미노산을 얻습니다 : 세포 외 환경, 세포 내 단백질 분해 및 de novo 아미노산 생합성. 이 프로토콜은 세포 외 환경으로부터의 아미노산 흡수 평가에 초점을 맞출 것이다. 아미노산 흡수를 측정하는 가장 일반적인 방법은 방사성 표지 (예 : ^3H또는 ^14C) 또는 중위 동위 원소 표지 (예 : ^13C) 아미노산에 의존합니다. 중위원소 분석은 아미노산 흡수 및 대사를 보다 철저하고 안전하게 분석할 수 있지만 샘플을 준비하고 유도체화하는 데 하루가 걸리고 샘플 수에 따라 질량분석기에서 분석하는 데 며칠이 걸리기 때문에 완료하는 데 며칠이 걸리기 때문에 완료하는 데 더 많은 시간이 소요됩니다(^21,22). 이에 비해 방사성 표지 된 아미노산 섭취 분석은 하류 대사에 대한 정보가 아니지만 저렴하고 비교적 빠르며 실험^{시작 23,24}에서 2-3 시간 내에 완료 될 수 있습니다. 여기에서는 생체 외 배양 된 1 차 세포 또는 세포주 또는 개별 뼈 샤프트에서 방사성 표지 된 아미노산 흡수를 평가하도록 설계된 쉽게 수정할 수있는 기본 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 두 프로토콜의 적용은 다른 방사성 표지된 아미노산 및 다른 뼈 관련 세포 유형 및 조직으로 확장될 수 있다.

본원에 기재된 모든 마우스 절차는 달라스에 있는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터의 동물 연구 위원회에 의해 승인되었다. 방사선 프로토콜은 달라스에 있는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 의료 센터의 방사선 안전 자문 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 세포의 아미노산 흡수 (프로토콜 I)

1. 5 x 10⁴ ST2 세포를 12-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 플레이트한다. 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 0.1 μg/mL 스트렙토마이신(Pen/Strep)을 포함하는 α-MEM의 플레이트 세포. 세포의 여분의 웰을 플레이트하여 단계 1.12의 정규화에 대한 조건당 세포 수를 정량화한다. 세포를 37°C의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 5%_CO2로 배양합니다.
2. 합류 할 때까지 2-3 일 동안 세포를 배양하십시오.
3. 실험 당일, 다음 용액을 준비한다: 1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4 및 크렙스 링거 헤페스(KRH) 완충액, pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM_MgCl2, NaHCO3, 5 mM 헤페스, 1 mM D-글루코스). 37 °C로 예열합니다.
4. 배지를 흡인하고 세포를 1 mL의 1x PBS, pH 7.4로 2회 세척한다.
   참고: 이 프로토콜은 비합류 세포를 빠르게 분할하는 데에도 적합합니다. 이 경우 방사능을 절대 세포 수 또는 DNA 함량으로 정상화하는 것이 중요합니다. 또한 배양 용기 또는 플라스크의 크기를 늘려 전체 세포 수와 cpm 값을 늘리는 것을 고려하십시오. 이것은 개별적으로 경험적으로 결정하는 데 중요합니다.
5. 1x PBS를 흡인하고 1mL KRH로 세포를 한 번 세척합니다.
6. KRH 1mL당 [1μCi μL-1] L-[3,4-3H]^-글루타민 스톡 4μL를 희석하여 4μCi/mL L-[3,4-3H]-글루타민 작업 매체를 만듭니다.
   알림: 방사성 물질을 사용하기 전에 자국 기관의 방사선 안전 사무소에 연락하여 승인을 받으십시오. 방사선과 관련된 모든 절차는 플렉시 유리 실드 뒤에서 수행해야합니다.
7. 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-글루타민 작업 배지를 함유한 KRH 0.5mL로 세포를 5분 동안 배양합니다.
8. 방사성 매체를 수집하고 액체 폐기물 용기에 분배합니다. 세포를 얼음처럼 차가운 KRH로 3회 짧게 씻어 반응을 종결시킨다. 방사성 액체 폐기물 용기에있는 모든 세척물을 모아서 폐기하십시오.
9. 각 웰에 1mL의 1% SDS를 추가하고 10배 분쇄하여 세포를 용해하고 균질화합니다. 세포 용해물을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세포 배양 플레이트, 혈청학적 피펫 및 피펫 팁을 고형 방사성 폐기물 용기에 폐기하십시오.
10. >10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 8mL의 섬광 용액이 들어있는 섬광 바이알로 옮깁니다. 섬광 바이알을 세게 흔들어 혼합합니다. 튜브와 피펫 팁은 고형 방사성 폐기물 용기에 버리십시오.
11. 섬광 계수기를 사용하여 분당 카운트(cpm)로 방사능을 읽습니다. 섬광 바이알은 섬광 바이알 폐기물 용기에 폐기하십시오.
12. 나머지 비방사성 세포 플레이트에서 세포를 트립신화, 재현탁 및 계수하여(1.1단계 참조) 용해된 방사성 배양물에서 세포 수를 추정합니다. 혈구계를 사용하여 각 실험 조건에 대해 비방사성 웰당 세포 수를 계산합니다. 1.11단계의 cpm을 비방사성 플레이트의 추정된 셀 번호로 정규화합니다.
13. 실험 완료 후 방사능 오염 제거제 스프레이로 세포 배양 후드, 벤치 및 모든 기기의 오염을 제거합니다. 마지막으로 와이프 테스트를 수행하여 작업 영역에 방사선이 없는지 확인합니다.

2. 새로 분리 된 뼈 조직의 아미노산 흡수 (프로토콜 II)

1. KRH를 37°C로 예열합니다.
2. 3 일 된 마우스를 안락사시키고 팔의 피부를 제거하십시오. 가위를 사용하여 어깨에서 상완골을 분리하고 양쪽 상완골을 해부합니다. 메스와 집게를 사용하여 모든 즉석 조직을 제거하십시오. 뼈에서 골단을 제거하십시오.
   참고: 상완골 외에도 이 프로토콜은 신생아 대퇴골, 경골 및 종골뿐만 아니라 2개월 및 4개월 된 마우스에서 분리된 상완골, 대퇴골 및 경골에 적용할 수 있습니다(미공개 데이터).
3. 뼈에서 골수를 씻어내고 2.14단계에서 정상화하기 위해 뼈 축의 무게를 잰다.
4. 상완골 하나를 100°C에서 1x PBS로 10분 동안 끓여 뼈를 탈세포화합니다. 탈세포화된 삶은 뼈는 음성 대조군으로 사용됩니다.
   참고: 품질 관리로 파라핀은 끓이는 것이 뼈를 탈세포화하는 데 효과적이라는 것을 시각적으로 확인하기 위해 조직학적 염색을 위해 삶은 뼈와 비삶은 뼈를 내장합니다.
5. 1 mL의 KRH에서 상완골 양쪽을 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 평형화시킨다.
6. 1mL KRH 당 1μCi / μL L- [2,3,4-3 H]- 아르기닌 스톡 4 μL를 희석하여 KRH 중 4 μCi / mL L- [2,3,4-3 H]- 아르기닌의 작업 용액을 만듭니다.
   알림: 이 프로토콜은 선택된 방사성 표지 영양소의 섭취를 평가하는 데 적합합니다. L- [2,3,4-3 H]- 글루타민, L- [¹⁴C_U]- 알라닌 및 L- [2,3-3 H]- 프롤린은 유사한 결과로 테스트되었습니다. 아르기닌 데이터는이 프로토콜의 유용성을 강조하기 위해 표시됩니다.
   주의 : 방사선을 사용하는 모든 절차는 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 사용하는 동안 플렉시 유리 실드 뒤에서 수행해야합니다.
7. 실험 및 끓인 대조군 뼈를 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-아르기닌이 함유된 KRH에서 37°C에서 최대 90분 동안 별도로 배양합니다.
   참고 : 시간 경과를 수행하여 마우스의 나이, 다른 골격 요소 및 방사성 표지 된 아미노산의 유형을 포함한 다양한 조건에 대한 배양 시간을 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다. 포화는 대부분 약 3-4 시간 후에 발생합니다. 흡수는 선형 흡수 분노의 시점에서 평가되어야 합니다.
8. 방사성 매체를 제거하고 액체 방사성 폐기물 용기에 버립니다. 얼음처럼 차가운 KRH 1 mL를 이용하여 상완골을 3회 세척하여 반응을 종결시킨다. 액체 방사성 폐기물 용기의 모든 세척물을 폐기하십시오.
9. 각 뼈를 1.5mL 튜브에 옮깁니다. 500 μL의 RIPA 완충액 [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM 트리스 (pH 8.0); 0.5 % NP40 (v / v); 0.5 % DOX (w / v); 0.1 % SDS (w / v)]를 첨가한다. 배양 플레이트, 혈청학적 피펫 및 피펫 팁을 방사성 고형 폐기물 용기에 폐기합니다.
10. RIPA 버퍼에서 가위로 100 번 절단하여 상완골을 균질화합니다.
11. 초음파 처리 (진폭 : 35 %, 펄스 1 초) 10 초 동안 균질화 된 뼈.
    참고: 초음파 처리는 또한 에어로졸을 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 초음파 처리 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행 할 수 있습니다. 에어로졸 형성을 줄이려면 튜브를 과도하게 채우지 않는 것이 중요합니다. 작은 샘플 볼륨의 초음파 처리는 거품으로 인해 불완전한 초음파 처리 또는 샘플 손실을 초래할 수 있습니다. 거품이 발생하면 샘플을 5분 동안 원심분리하여 침전시킵니다.
12. 실온에서 >10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 용해물을 명확히 한다. 200 μL의 상청액을 8 mL의 섬광 용액이 들어있는 섬광 바이알에 옮깁니다. 섬광 바이알을 세게 흔들어 혼합합니다. 모든 고형 방사성 폐기물(예: 사용한 튜브, 피펫 팁, 플레이트 등)을 고형 방사성 폐기물 용기에 폐기하십시오.
13. 섬광 계수기를 사용하여 방사능(cpm)을 읽습니다. 사용한 섬광 바이알은 섬광 바이알용으로 지정된 방사성 폐기물 용기에 폐기하십시오.
14. 실험뼈의 cpm에서 삶은 뼈의 cpm (기초 값)을 뺍니다. 2.3 단계에서 뼈 무게로 방사능을 정상화하십시오.
15. 세포 배양 후드, 기구 및 벤치에 방사능 오염 제거제를 분사합니다. 와이프 테스트를 수행하여 작업 영역에 방사선이 없는지 확인합니다.

아미노산 수송은 기질 특이성, 동역학, 이온 및 pH 의존성을 포함하는 수많은 특성에 기초하여 별개의 수송 시스템으로 분류된 많은 막 결합 아미노산 수송체에 의해 조절된다25. 예를 들어, 글루타민 흡수는 Na + 의존성 수송 시스템 A, ASC, γ + L 및 N 또는 Na + 독립적 시스템 L에 의해 매개될 수 있습니다. Na+-의존성 시스템은 Li+를 Na+(시스템 N)로 대체하는 능력 또는 아미노산 유사체 2-(메틸아미노)이소부티르산(MeAIB)(시스템 A)에 대한 민감도로 구별됩니다. 이 실험의 목적은 각 수송 시스템에 기인하는 글루타민 소비량을 정의하는 것이 었습니다. L-[3,4-3H]글루타민 흡수는 120mM NaCl을 함유하는 정상 KRH, 120mM 염화콜린을 함유하는 Na+ 유리 KRH, 5mM MeAIB를 함유하는 정상 KRH 또는 120mM LiCl을 함유하는 Na+ 유리 KRH의 합류성 ST2 세포에서 측정되었다. 총 방사능(분당 카운트)은 세포 수로 정규화되었다. Na+ 제거로 글루타민 흡수가 90% 감소했습니다. 이는 시스템 L이 글루타민 흡수의 10%를 차지하는 반면 ST2 세포에서 글루타민 흡수의 90%는 Na+ 의존적임을 나타냅니다(그림 2). Li+의 존재는 Na+ 유리 조건에 비해 글루타민 흡수를 2% 증가시켰지만 5mM MEAIB는 글루타민 흡수에 영향을 미치지 않았습니다. 이 데이터는 대부분의 글루타민 흡수가 시스템 ASC 및 γ + L에 의해 매개되는 반면 시스템 N과 시스템 A는 각각 Na + 의존성 글루타민 흡수의 약 2 % 및 0 %를 담당한다는 것을 나타냅니다.

우리는 생체 외 뼈축에서 아미노산 흡수를 특성화하기 위해 프로토콜 I을 수정했습니다. 이 실험에서 우리는 프로토콜 II를 따라 3 일 된 (p3) 마우스에서 분리 된 긴 뼈에서 아르기닌 흡수 동역학을 특성화했습니다. 이를 위해 먼저 p3 마우스에서 두 상완골을 모두 해부했습니다. 골단을 제거하고 골수를 뽑아 내고 정상화를 위해 각 상완골의 무게를 측정했습니다. 반대쪽 상완골은 음성 대조군으로 지정되었으며 세포 활동을 죽이기 위해 끓였습니다. 실험적이고 끓인 상완골을 방사성 표지 된 4μCi / mL L- [2,3,4-3 H]- 아르기닌과 함께 최대 2 시간 동안 배양 하였다. 아르기닌 흡수는이 실험 과정에서 선형 방식으로 증가했습니다 (그림 3A). 비교를 위해, 끓인 상완골은이 실험에서 아르기닌 흡수의 동적 증가를 나타내지 않았지만 오히려 뼈 매트릭스에서 프로브의 흡착에 기인 한 기저 방사능을 가졌다. 표준화되고 보정된 아르기닌 흡수는 도 3B에 도시되어 있다.

그림 1: 방사성 표지된 아미노산 흡수 분석의 워크플로우. 시험관 내 (프로토콜 I) 및 생체 외 뼈 (프로토콜 II)의 아미노산 흡수 분석의 개략적 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 시험관 내 ST2에서 L-[3,4-3H]-글루타민 흡수의 동역학적 특성. (A) L- [3,4-3 H]- 글루타민 흡수 분석은 ST2 세포에서 나트륨 (Na +), MeAIB 또는 리튬 (Li+)의 존재 (+) 또는 부재 (-)에서 수행됩니다. (B) 글루타민 흡수에 대한 시스템 A, N, L 또는 ASC 및 γ + L의 예상 기여도의 백분율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 생체 외 L-[2,3,4-3 H]-신생아 상완골의 아르기닌 흡수. (A) L- [2,3,4-3 H]- 아르기닌 흡수는 3 일 된 C57BL / 6 마우스에서 분리 된 생균 및 끓인 상완골에서 2 시간의 시간 과정에 걸쳐 수행되었습니다. (B) 끓인 상완골로 표준화 된 L- [2,3,4-3 H]- 아르기닌 흡수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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