이 프로토콜은 방사성 표지 된 아미노산 섭취 분석을 제시하며, 이는 일차 세포 또는 분리 된 뼈에서 아미노산 소비를 평가하는 데 유용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
뼈 발달과 항상성은 골 형성 조골 세포의 분화와 활성에 달려 있습니다. 조골 세포 분화는 순차적으로 증식에 이어 단백질 합성과 궁극적으로 골 매트릭스 분비를 특징으로합니다. 증식과 단백질 합성에는 지속적인 아미노산 공급이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 조골 세포의 아미노산 소비에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 여기에서는 방사성 표지 된 아미노산을 사용하여 아미노산 소비를 측정하도록 설계된 매우 민감한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 조골 세포 증식 또는 분화, 약물 또는 성장 인자 치료 또는 다양한 유전자 조작과 관련된 아미노산 흡수의 변화를 정량화하는 데 최적화되어 있습니다. 중요하게도, 이 방법은 시험관 내 또는 생체 외 분리된 뼈 축에서 배양된 세포주 또는 일차 세포에서 아미노산 소비를 정량화하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 방법은 포도당 및 기타 방사성 표지 된 영양소뿐만 아니라 아미노산의 수송을 측정하기 위해 쉽게 적용 될 수 있습니다.
서론
아미노산은 각 아미노산에 특이적인 가변 측쇄를 가진 아미노(-NH2) 및 카르복실(-COOH) 작용기를 포함하는 유기 화합물입니다. 일반적으로 아미노산은 단백질의 기본 구성 성분으로 잘 알려져 있습니다. 보다 최근에는 아미노산의 새로운 용도와 기능이 해명되었습니다. 예를 들어, 개별 아미노산은 생체 에너지학에 기여하거나, 효소 보조 인자로서 기능하거나, 활성 산소 종을 조절하거나, 다른 아미노산 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10을 합성하는 데 사용되는 중간 대사 산물을 생성하기 위해 대사 될 수 있습니다. . 많은 연구에서 아미노산 대사가 다양한 맥락에서 세포 다 능성, 증....
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프로토콜
본원에 기재된 모든 마우스 절차는 달라스에 있는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터의 동물 연구 위원회에 의해 승인되었다. 방사선 프로토콜은 달라스에 있는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 의료 센터의 방사선 안전 자문 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 세포의 아미노산 흡수 (프로토콜 I)
- 5 x 104 ST2 세포를 12-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 플레이트한다. 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 0.1 μg/mL 스트렙토마이신(Pen/Strep)을 포함하는 α-MEM의 플레이트 세포. 세포의 여분의 웰을 플레이트하여 단계 1.12의 정규화에 대한 조건당 세포 수를 정량화한다. 세포를 37°C의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 5%CO2로 배양합니다.
- 합류 할 때까지 2-3 일 동안 세포를 배양하십시오.
- 실험 당일, 다음 용액을 준비한다: 1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4 및 크렙스 링거 헤페스(KRH) 완충액, pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mMMgCl2, NaHCO3, 5 mM 헤페스, 1 mM D-....
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결과
아미노산 수송은 기질 특이성, 동역학, 이온 및 pH 의존성을 포함하는 수많은 특성에 기초하여 별개의 수송 시스템으로 분류된 많은 막 결합 아미노산 수송체에 의해 조절된다25. 예를 들어, 글루타민 흡수는 Na + 의존성 수송 시스템 A, ASC, γ + L 및 N 또는 Na + 독립적 시스템 L에 의해 매개될 수 있습니다. Na+-의존성 시스템은 Li+를 Na+(시스템 N)로 대체하는 능력 또는 아미노산 유사체 2-(메틸아미노)이소부티르산(MeAIB)(시스템 A)에 대한 민감도로 구별됩니다. 이 실험의 목적은 각 수송 시스템에 기인하는 글루타민 소비량을 정의하는 것이 었습니다. L-[3,4-3H]글루타민 흡수는 120mM NaCl을 함유하는 정상 KRH, 120mM 염화콜린을 함유하는 Na+ 유리 KRH, 5mM MeAIB를 함유하는 정상 KRH 또는 120mM LiCl을 함유하는 Na<.......
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토론
본원에 기재된 프로토콜은 시험관내 또는 생체외 중 다양한 실험 순열에 반응하여 아미노산 흡수를 평가하기 위한 빠르고 민감한 접근법을 제공한다. 시판되는 키트(예를 들어, 글루타민 및 글루타메이트 측정 키트)와 비교할 때, 이 방법은 훨씬 더 민감하고, 더 빠르며, 덜 노동 집약적이다16,17,25. 우리의 프로토콜에서, 우리는 Krebs Ringers hepes 버퍼의 흡수를 평가합니다. 우리는 아미노산 흡수를 특성화하기 위해 다양한 조건을 테스트하기 위해 빠르고 쉽게 수정할 수 있는 기본 공식이기 때문에 이 배지를 활용합니다. 예를 들어, 수송 시스템이 Na+에 의존하는지 테스트하기 위해 NaCl을 염화콜린으로 간단히 대체하여 Na+를 유리 KRH로 만들 수 있습니다. 이러한 유연성은 개별 .......
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공개 사항
저자는 공개하지 않습니다.
감사의 글
Karner 연구소는 국립 보건원 R01 보조금 (AR076325 및 AR071967)의 지원을 받고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신 | Gibco | 25200 | |
| 12웰 플레이트 | Corning | 3513 | |
| 1mL 주사기 | BD 정밀 | 309628 | |
| 30G 니들 | BD 정밀 | 305106 | |
| 아르기닌 모노하이드로클로라이드 L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 섬광 카운터 | |||
| 염화칼슘 | 시그마 | C1016 | |
| 염화콜린 | 시그마 | C7077 | |
| D-(+)-포도당 용액 | 시그마 | G8769 | |
| 해부 도구 | 집게, 가위, 스케이프 | ||
| , DPBS | Gibco | 14190 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 | 시그마 | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-글루타민 | PerkinElmer | NET551250UC | |
| 액체 섬광 바이알 | Sigma | Z190535 | |
| 리튬 클로라이드 용액, 8M | Sigma | L7026 | |
| 염화마그네슘 | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | 시그마 | 492016 | |
| 염화칼 | 시그마 | P3911 | |
| 중탄산나트륨 | 시그마 | S6014 | |
| 염화나트륨 | 시그마 | S9888 | |
| 소듐 데옥시콜레이트 | 시그마 | D6750 | |
| 나트륨 도데 실 설페이트 | 시그마 | 436143 | |
| Sonicator | Sonic & 재료 | : VCX130 | |
| 트리스베이스 | 시그마 | 648311 | |
| 울티마 골드 (섬광 용액) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α - (메틸 아미노) 이소 부티르산 | 시그마 | M2383 |
참고문헌
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
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