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Medicine

सुसंस्कृत हड्डी कोशिकाओं और पृथक हड्डी शाफ्ट में अमीनो एसिड की खपत का मूल्यांकन

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/62995
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

यह प्रोटोकॉल एक रेडियोलेबल एमिनो एसिड अपटेक परख प्रस्तुत करता है, जो प्राथमिक कोशिकाओं या पृथक हड्डियों में अमीनो एसिड की खपत का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है।

Abstract

हड्डी का विकास और होमियोस्टेसिस अस्थि निर्माण ओस्टियोब्लास्ट के भेदभाव और गतिविधि पर निर्भर है। ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव क्रमिक रूप से प्रोटीन संश्लेषण और अंततः हड्डी मैट्रिक्स स्राव के बाद प्रसार की विशेषता है। प्रसार और प्रोटीन संश्लेषण के लिए अमीनो एसिड की निरंतर आपूर्ति की आवश्यकता होती है। इसके बावजूद, ओस्टियोब्लास्ट में अमीनो एसिड की खपत के बारे में बहुत कम जानकारी है। यहां हम एक बहुत ही संवेदनशील प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसे रेडियोलेबल अमीनो एसिड का उपयोग करके अमीनो एसिड की खपत को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस विधि को अमीनो एसिड अपटेक में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया गया है जो ओस्टियोब्लास्ट प्रसार या भेदभाव, दवा या विकास कारक उपचार, या विभिन्न आनुवंशिक जोड़तोड़ से जुड़े हैं। महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि का उपयोग सुसंस्कृत सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं में एमिनो एसिड की खपत को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, हमारी विधि को आसानी से अमीनो एसिड के परिवहन के साथ-साथ ग्लूकोज और अन्य रेडियोलेबल पोषक तत्वों को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

अमीनो एसिड कार्बनिक यौगिक होते हैं जिनमें एक परिवर्तनीय साइड चेन के साथ एक एमिनो (-एनएच2) और कार्बोक्सिल (-सीओओएच) कार्यात्मक समूह होते हैं जो प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए विशिष्ट होते हैं। सामान्य तौर पर, अमीनो एसिड प्रोटीन के मूल घटक के रूप में अच्छी तरह से जाना जाता है। हाल ही में, अमीनो एसिड के नए उपयोग और कार्यों को स्पष्ट किया गया है। उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत अमीनो एसिड को मध्यवर्ती मेटाबोलाइट्स उत्पन्न करने के लिए चयापचय किया जा सकता है जो बायोएनर्जेटिक में योगदान करते हैं, एंजाइमेटिक कोफ़ैक्टर्स के रूप में कार्य करते हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को विनियमित करते हैं या अन्य अमीनो एसिड को संश्लेषित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . कई अध्ययनों से पता चलता है कि अमीनो एसिड चयापचय विभिन्नसंदर्भों में सेल प्लूरिपोटेंसी, प्रसार और भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है 3,6,11,12,13,14,15,16,17।

ओस्टियोब्लास्ट स्रावी कोशिकाएं हैं जो कोलेजन टाइप 1 समृद्ध बाह्य अस्थि मैट्रिक्स का उत्पादन और स्राव करती हैं। हड्डी के गठन के दौरान प्रोटीन संश्लेषण की उच्च दर को बनाए रखने के लिए, ओस्टियोब्लास्ट अमीनो एसिड की निरंतर आपूर्ति की मांग करते हैं। इस मांग को पूरा करने के लिए, ओस्टियोब्लास्ट को सक्रिय रूप से अमीनो एसिड प्राप्त करना चाहिए। इसके अनुरूप, हाल के अध्ययनों से ओस्टियोब्लास्ट गतिविधि और हड्डी के गठन में अमीनो एसिड अपटेक और चयापचय के महत्व का पता चलता है 15,16,17,18,19,20।

ओस्टियोब्लास्ट तीन प्रमुख स्रोतों से सेलुलर अमीनो एसिड प्राप्त करते हैं: बाह्य वातावरण, इंट्रासेल्युलर प्रोटीन क्षरण और डे नोवो एमिनो एसिड जैवसंश्लेषण। यह प्रोटोकॉल बाह्य वातावरण से अमीनो एसिड अपटेक के मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित करेगा। अमीनो एसिड अपटेक को मापने के लिए सबसे आम तरीके या तो रेडियोलेबल (जैसे, 3एच या 14सी) या भारी आइसोटोप लेबल (जैसे, 13सी) एमिनो एसिड पर निर्भर करते हैं। भारी आइसोटोपोमर परख अमीनो एसिड अपटेक और चयापचय का अधिक अच्छी तरह से और सुरक्षित रूप से विश्लेषण कर सकते हैं, लेकिन इसे पूरा करने में कई दिन लगते हैं क्योंकि नमूने तैयार करने और व्युत्पन्न करने में एक दिन लगता है और नमूने की संख्या21,22 के आधार पर मास स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण करने में कई दिन लगते हैं। तुलनात्मक रूप से, रेडियोलेबल एमिनो एसिड अपटेक परख डाउनस्ट्रीम चयापचय के बारे में जानकारीपूर्ण नहीं हैं, लेकिन सस्ते और अपेक्षाकृत तेज हैं, जो प्रयोग 23,24 की शुरुआत से2-3 घंटे के भीतर पूरा करने में सक्षम हैं। यहां, हम एक आसानी से परिवर्तनीय बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो विट्रो या व्यक्तिगत हड्डी शाफ्ट में सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं या सेल लाइनों में रेडियोलेबल एमिनो एसिड अपटेक का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इन दो प्रोटोकॉल के आवेदन को अन्य रेडियोलेबल अमीनो एसिड और अन्य हड्डी से जुड़े सेल प्रकारों और ऊतकों तक बढ़ाया जा सकता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी माउस प्रक्रियाओं को डलास में टेक्सास साउथवेस्टर्न मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय में पशु अध्ययन समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। विकिरण प्रोटोकॉल डलास में टेक्सास साउथवेस्टर्न मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय में विकिरण सुरक्षा सलाहकार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. कोशिकाओं में अमीनो एसिड अपटेक (प्रोटोकॉल I)

  1. प्लेट 5 x 104 एसटी 2 कोशिकाएं 12-अच्छी तरह से ऊतक संवर्धन प्लेट के प्रत्येक कुएं में। α-एमईएम में प्लेट कोशिकाओं में 10% एफबीएस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 0.1 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप) होता है। चरण 1.12 में सामान्यीकरण के लिए प्रति स्थिति सेल संख्या को निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं के अतिरिक्त कुओं को प्लेट करें। 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. कोशिकाओं को 2-3 दिनों के लिए कल्चर करें जब तक कि कॉन्फ्लुएंट न हो जाएं।
  3. प्रयोग के दिन, निम्नलिखित समाधान तैयार करें: 1x फॉस्फेट बफ़र्ड सलाइन (PBS), pH 7.4 और क्रेब्स रिंगर्स HEPES (KRH) बफर, pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glucose)। प्रीवार्म से 37 डिग्री सेल्सियस तक।
  4. माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 1 एमएल 1x PBS, pH 7.4 के साथ दो बार धोएं।
    नोट: यह प्रोटोकॉल गैर-कॉन्फ्लुएंट कोशिकाओं को तेजी से विभाजित करने के लिए भी उपयुक्त है। इस मामले में, रेडियोधर्मिता को पूर्ण सेल संख्या या डीएनए सामग्री के लिए सामान्य करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, समग्र सेल संख्या और सीपीएम मूल्यों को बढ़ाने के लिए संस्कृति प्लेट या फ्लास्क के आकार को बढ़ाने पर विचार करें। व्यक्तिगत आधार पर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करना महत्वपूर्ण है।
  5. एस्पिरेट 1x PBS और कोशिकाओं को एक बार 1 एमएल केआरएच के साथ धो लें।
  6. केआरएच के प्रति 1 एमएल ग्लूटामाइन स्टॉक के 4 μL [1 μ μL [1 μ μL]-ग्लूटामाइन स्टॉक को पतला करके ग्लूटामाइन वर्किंग मीडिया बनाएं।
    नोट: रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग करने से पहले, कृपया अनुमोदन प्राप्त करने के लिए अपने घर संस्थान में विकिरण सुरक्षा कार्यालय से संपर्क करें। विकिरण से संबंधित सभी प्रक्रियाओं को प्लेक्सीग्लास ढाल के पीछे किया जाना चाहिए।
  7. 0.5 एमएल केआरएच के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जिसमें 5 मिनट के लिए 4 μCi / mL L-[3,4-3 H]-ग्लूटामाइन वर्किंग मीडिया होता है।
  8. रेडियोधर्मी माध्यम को इकट्ठा करें और तरल अपशिष्ट कंटेनर में वितरित करें। प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए बर्फ-ठंडे केआरएच के साथ कोशिकाओं को तीन बार संक्षेप में धोएं। रेडियोधर्मी तरल अपशिष्ट कंटेनर में सभी धोने को इकट्ठा करें और छोड़ दें।
  9. प्रत्येक कुएं में 1% एसडीएस का 1 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को लाइस और समरूप बनाने के लिए 10 गुना ट्राइट्यूरेट करें। सेल लाइसेट को 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। ठोस रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में सेल कल्चर प्लेटों, सीरोलॉजिकल पिपेट और पिपेट युक्तियों को छोड़ दें।
  10. 10 मिनट के लिए >10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनैटेंट को 8 एमएल वाले सिंटिलेशन समाधान वाली सिंटिलेशन शीशियों में स्थानांतरित करें। शानदार शीशियों को जोर से हिलाकर मिलाएं। ठोस रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में ट्यूब और पिपेट युक्तियों को छोड़ दें।
  11. सिंटिलेशन काउंटर का उपयोग करके प्रति मिनट (सीपीएम) गणना में रेडियोधर्मिता पढ़ें। शीशी अपशिष्ट कंटेनर में शानदार शीशियों को फेंक दें।
  12. लाइस्ड, रेडियोधर्मी संस्कृतियों में कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए कोशिकाओं की शेष गैर-रेडियोधर्मी प्लेटों (चरण 1.1 देखें) से कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज, पुन: निलंबित और गणना करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए प्रति गैर-रेडियोधर्मी अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। चरण 1.11 से गैर-रेडियोधर्मी प्लेटों से अनुमानित सेल संख्या तक सीपीएम को सामान्य करें।
  13. प्रयोग के पूरा होने के बाद, सेल कल्चर हुड, बेंच और सभी उपकरणों को रेडियोधर्मिता परिशोधन स्प्रे के साथ परिचालित करें। अंत में, यह सुनिश्चित करने के लिए वाइप परीक्षण करें कि कार्य क्षेत्र विकिरण मुक्त है।

2. ताजा पृथक हड्डी के ऊतकों में एमिनो एसिड अपटेक (प्रोटोकॉल II)

  1. प्रीवार्म केआरएच से 37 डिग्री सेल्सियस तक।
  2. एक 3 दिन पुराने माउस को इच्छामृत्यु करें और बाहों पर त्वचा को हटा दें। कैंची का उपयोग करके कंधे से ह्यूमरी को अलग करें और दोनों ह्यूमरी को विच्छेदित करें। स्केलपेल और फोर्सप्स का उपयोग करके सभी एक्सटेम्पोरल ऊतकों को हटा दें। हड्डी से एपिफिसेस को हटा दें।
    नोट: ह्यूमेरी के अलावा, इस प्रोटोकॉल को नवजात फेमोरा, टिबिया और कैल्वेरिया के साथ-साथ 2- और 4 महीने के चूहों (अप्रकाशित डेटा) से अलग ह्यूमेरी, फेमोरा और टिबिया के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
  3. हड्डी से मज्जा को बाहर निकालें और चरण 2.14 में सामान्य करने के लिए हड्डी शाफ्ट का वजन करें।
  4. हड्डी को डीसेल्यूलराइज करने के लिए 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS में एक ह्यूमरस उबालें। डीसेल्यूलराइज्ड उबली हुई हड्डी का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
    नोट: गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में, पैराफिन ने हिस्टोलॉजिकल दाग के लिए उबली हुई और गैर-उबली हड्डियों को एम्बेड किया ताकि यह पुष्टि की जा सके कि उबलना हड्डी को डीसेलुलर बनाने में प्रभावी था।
  5. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर केआरएच के 1 एमएल में दोनों ह्यूमरी को बराबर करें।
  6. केआरएच में 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-Arginine का एक कार्यशील समाधान बनाएं, जिसमें 1μC/μL L-[2,3,4-3 H]- आर्गिनिन स्टॉक प्रति 1 mL KRH को पतला किया जाए।
    नोट: यह प्रोटोकॉल जो भी रेडियोलेबल पोषक तत्व चुना जाता है, उसके उत्थान का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त है। एल-[2,3,4-3 एच]-ग्लूटामाइन, एल-[14सीयू]-एलानिन, और एल-[2,3-3 एच]-प्रोलाइन का परीक्षण समान परिणामों के साथ किया गया है। आर्जिनिन डेटा इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता को उजागर करने के लिए दिखाया गया है।
    चेतावनी: विकिरण का उपयोग करने वाली सभी प्रक्रियाओं को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करते समय प्लेक्सीग्लास ढाल के पीछे किया जाना चाहिए।
  7. प्रयोगात्मक और उबले हुए नियंत्रण हड्डी दोनों को केआरएच में अलग-अलग इनक्यूबेट करें जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट तक 4 μCi / mL L-[2,3,4-3H]-Arginine होता है।
    नोट: चूहों की उम्र, विभिन्न कंकाल तत्वों और समय पाठ्यक्रम करके रेडियोलेबल अमीनो एसिड के प्रकार सहित विभिन्न स्थितियों के लिए इनक्यूबेशन समय को अनुभवपूर्वक निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। संतृप्ति ज्यादातर लगभग 3-4 घंटे के बाद होती है। अपटेक का मूल्यांकन अपटेक के रैखिक क्रोध में एक समय बिंदु पर किया जाना चाहिए।
  8. रेडियोधर्मी माध्यम को हटा दें और तरल रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में छोड़ दें। प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए केआरएच के बर्फ ठंडे 1 एमएल का उपयोग करके ह्यूमरी को तीन बार धोएं। तरल रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में सभी धोने को छोड़ दें।
  9. प्रत्येक हड्डी को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। आरआईपीए बफर का 500 μL जोड़ें [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8.0); 0.5% NP40 (v/v); 0.5% DOX (w/v); 0.1% SDS (w/v)]। एक रेडियोधर्मी ठोस अपशिष्ट कंटेनर में कल्चर प्लेटों, सीरोलॉजिकल पिपेट और पिपेट युक्तियों को छोड़ दें।
  10. आरआईपीए बफर में कैंची के साथ 100 बार काटकर हुमेरी को समरूप करें।
  11. सोनिकेट (आयाम: 35%, पल्स 1 एस) परिणामस्वरूप 10 सेकंड के लिए समरूप हड्डी।
    नोट: सोनिकेशन एरोसोल का उत्पादन करने के लिए भी जाना जाता है। सोनिकेशन चरणों को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जा सकता है। एरोसोल गठन को कम करने के लिए, ट्यूबों को ओवरफिल नहीं करना महत्वपूर्ण है। छोटे नमूने की मात्रा के सोनिकेशन के परिणामस्वरूप फोमिंग के कारण अपूर्ण सोनिकेशन या नमूना हानि हो सकती है। यदि फोमिंग होती है, तो नमूने को निपटाने के लिए 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  12. कमरे के तापमान पर >10,000 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लाइसेट को स्पष्ट करें। सतह पर तैरने वाले 200 μL को सिंटिलेशन शीशियों में स्थानांतरित करें जिसमें 8 एमएल सिंटिलेशन समाधान होता है। शानदार शीशियों को जोर से हिलाकर मिलाएं। ठोस रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में सभी ठोस रेडियोधर्मी अपशिष्ट (जैसे, उपयोग किए गए ट्यूब, पिपेट टिप्स, प्लेटें, आदि) को छोड़ दें।
  13. सिंटिलेशन काउंटर का उपयोग करके रेडियोधर्मिता (सीपीएम) पढ़ें। सिंटिलेशन शीशियों के लिए नामित रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में इस्तेमाल की गई सिंटिलेशन शीशियों को फेंक दें।
  14. प्रयोगात्मक हड्डी के सीपीएम से उबली हुई हड्डी (बेसल मान) के सीपीएम को घटाएं। चरण 2.3 से हड्डी के वजन के साथ रेडियोधर्मिता को सामान्य करें।
  15. कोशिका संवर्धन हुड, उपकरणों और बेंच को रेडियोधर्मिता परिशोधन के साथ स्प्रे करें। कार्य क्षेत्र विकिरण मुक्त होने की पुष्टि करने के लिए वाइप परीक्षण करें।

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Representative Results

अमीनो एसिड परिवहन को कई झिल्ली-बाध्य अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टरों द्वारा विनियमित किया जाता है जिन्हें सब्सट्रेट विशिष्टता, कैनेटीक्स, साथ ही आयन और पीएच निर्भरता25 सहित कई विशेषताओं के आधार पर अलग-अलग परिवहन प्रणालियों में वर्गीकृत किया गया है। उदाहरण के लिए, ग्लूटामाइन अपटेक को एनए + -निर्भर परिवहन प्रणाली ए, एएससी, γ + एल और एन या एनए + -स्वतंत्र सिस्टम एल द्वारा मध्यस्थ किया जा सकता है। Na+-निर्भर प्रणालियों को Na+ (सिस्टम N) के लिए Li+ को प्रतिस्थापित करने की क्षमता या अमीनो एसिड एनालॉग 2-(मिथाइलमिनो) आइसोब्यूट्रिक एसिड (MeAIB) (सिस्टम ए) के प्रति संवेदनशीलता से अलग किया जाता है। इस प्रयोग का उद्देश्य प्रत्येक परिवहन प्रणाली के लिए जिम्मेदार ग्लूटामाइन की खपत की मात्रा को परिभाषित करना था। ग्लूटामाइन अपटेक को सामान्य केआरएच में कॉन्फ्लुएंट एसटी 2 कोशिकाओं में मापा गया था जिसमें 120 एमएम एनएसीएल, एनए + फ्री केआरएच जिसमें 120 एमएम कोलीन क्लोराइड होता है, सामान्य केआरएच जिसमें 5 एमएम एमईएआईबी या एनए + फ्री केआरएच होता है जिसमें 120 एमएम एलआईसीएल होता है। कुल रेडियोधर्मिता (प्रति मिनट गणना) को सेल नंबर में सामान्यीकृत किया गया था। एनए + हटाने से ग्लूटामाइन अपटेक में 90% की कमी आई। इससे संकेत मिलता है कि सिस्टम एल ग्लूटामाइन अपटेक का 10% हिस्सा है जबकि ग्लूटामाइन अपटेक का 90% एसटी 2 कोशिकाओं में एनए + निर्भर है (चित्रा 2)। एलआई + की उपस्थिति ने केवल एनए + मुक्त स्थिति की तुलना में ग्लूटामाइन अपटेक में 2% की वृद्धि की, जबकि 5 एमएम एमईआईबी ने ग्लूटामाइन अपटेक को प्रभावित नहीं किया। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि ग्लूटामाइन अपटेक का अधिकांश हिस्सा सिस्टम एएससी और γ + एल द्वारा मध्यस्थ है, जबकि सिस्टम एन और सिस्टम ए क्रमशः एनए + -निर्भर ग्लूटामाइन अपटेक के लगभग 2% और 0% के लिए जिम्मेदार हैं।

हमने हड्डी शाफ्ट एक्स विवो में अमीनो एसिड अपटेक को चिह्नित करने के लिए प्रोटोकॉल I को संशोधित किया। इस प्रयोग में हमने 3-दिवसीय (पी 3) चूहों से अलग लंबी हड्डियों में आर्जिनिन अपटेक कैनेटीक्स को चिह्नित करने के लिए प्रोटोकॉल II का पालन किया। ऐसा करने के लिए, हमने पहले पी 3 चूहों से दोनों ह्यूमरी का विच्छेदन किया। एपिफिसेस को हटा दिया गया था, और मज्जा को बाहर निकाल दिया गया था और प्रत्येक ह्यूमरस को सामान्यीकरण के लिए तौला गया था। विपरीत ह्यूमरस को एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नामित किया गया था और सेलुलर गतिविधि को मारने के लिए उबाला गया था। प्रयोगात्मक और उबले हुए ह्यूमरी को तब 2 घंटे तक रेडियोलेबल 4 μCi / mL L-[2,3,4-3 H]-Arginine के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इस प्रयोग के दौरान आर्जिनिन अपटेक में रैखिक तरीके से वृद्धि हुई (चित्रा 3 ए)। तुलना के लिए, उबले हुए ह्यूमरी ने इस प्रयोग में आर्जिनिन अपटेक की गतिशील वृद्धि का प्रदर्शन नहीं किया, बल्कि एक बेसल रेडियोधर्मिता थी जिसे हड्डी मैट्रिक्स में जांच के सोखने के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। सामान्यीकृत और सही आर्जिनिन अपटेक चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: रेडियोलेबल एमिनो एसिड अपटेक परख का वर्कफ़्लो। विट्रो (प्रोटोकॉल I) और हड्डियों में एमिनो एसिड अपटेक परख का योजनाबद्ध अवलोकन पूर्व विवो (प्रोटोकॉल II)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इन विट्रो में एसटी 2 में एल-[3,4-3 एच]-ग्लूटामाइन अपटेक के काइनेटिक गुण। (ए) एल-[3,4-3 एच]-ग्लूटामाइन अपटेक परीक्षण एसटी 2 कोशिकाओं में सोडियम (एनए +), एमईएआईबी या लिथियम (एलआई +) की उपस्थिति (+) या अनुपस्थिति (-) में किया जाता है। (बी) ग्लूटामाइन अपटेक के लिए सिस्टम ए, एन, एल, या एएससी और γ + एल के अनुमानित योगदान का प्रतिशत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: नवजात ह्यूमरी में एक्स विवो एल-[2,3,4-3एच]-आर्जिनिन अपटेक 3 दिन के सी 57बीएल/6 चूहों से अलग किए गए लाइव और उबले हुए ह्यूमरी में 2 घंटे के समय के दौरान किया गया। (बी) उबले हुए ह्यूमरी के साथ सामान्यीकृत एल-[2,3,4-3एच]-आर्जिनिन अपटेक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न प्रयोगात्मक क्रमपरिवर्तनों के जवाब में अमीनो एसिड अपटेक का मूल्यांकन करने के लिए एक तेज़ और संवेदनशील दृष्टिकोण प्रदान करता है या तो इन विट्रो या एक्स विवो। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (जैसे, ग्लूटामाइन और ग्लूटामेट निर्धारण किट) की तुलना में, यह विधि बहुत अधिक संवेदनशील, तेज और कम श्रम गहन 16,17,25 है। हमारे प्रोटोकॉल में, हम क्रेब्स रिंगर्स एचईपीईएस बफर में अपटेक का मूल्यांकन करते हैं। हम इस मीडिया का उपयोग करते हैं क्योंकि यह एक बेसल सूत्र है जो अमीनो एसिड अपटेक को चिह्नित करने के लिए स्थितियों की एक विविध सरणी का परीक्षण करने के लिए तेजी से और आसान संशोधनों की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, यह परीक्षण करने के लिए कि क्या परिवहन प्रणाली एनए + निर्भर है, हम एनए + मुक्त केआरएच बनाने के लिए एनएसीएल को कोलीन क्लोराइड के साथ बदल सकते हैं। यह लचीलापन व्यक्तिगत अमीनो एसिड के उत्थान की मध्यस्थता करने वाले विभिन्न परिवहन प्रणालियों से पूछताछ करने के लिए फायदेमंद है। अल्फा-एमईएम जैसे बेसल विकास मीडिया भी इस परख के लिए उपयुक्त है। इस मामले में, हम आम तौर पर अल्फा-एमईएम खरीदते हैं जिसमें व्यक्तिगत अमीनो एसिड की कमी होती है, जिसे प्रयोग के लिए रेडियोलेबल अमीनो एसिड के साथ बदल दिया जाता है। उदाहरण के लिए, ग्लूटामाइन अपटेक का मूल्यांकन करने के लिए हम प्राथमिक अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं 15 में ग्लूटामाइन-मुक्त अल्फा-एमईएम का उपयोगकरते हैं। केआरएच की अपनी सरल संरचना के कारण कुछ सीमाएं हैं। केआरएच एक आदर्श विकल्प नहीं है यदि लक्ष्य माध्यमिक सक्रिय परिवहन प्रणालियों जैसे कि सिम्पोर्टर्स और एंटीपोर्टर्स का अध्ययन करना है। उदाहरण के लिए, ग्लूटामाइन के बदले में एसएलसी 7 ए 5 / एसएलसी 3 ए 2 के माध्यम से ल्यूसीन अपटेक होता है। इस मामले में, केआरएच में ग्लूटामाइन की कमी के कारण ल्यूसीन अपटेक को कम करके आंका जा सकता है; बल्कि, इस उदाहरण में ल्यूसीन-मुक्त अल्फा-एमईएम माध्यम का उपयोग बेहतर होगा। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि आइसोटोप 3एच के साथ काम करते समय गीगर काउंटर का उपयोग अनिवार्य नहीं है। हालांकि, यह सलाह दी जाती है कि लोगों को सतर्क करने के लिए शिष्टाचार के रूप में गीगर काउंटर रखें कि आप विकिरण के साथ काम कर रहे हैं।

दूसरे प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण और अनिवार्य नियंत्रण विपरीत हड्डी का उबलना है। यह आवश्यक है क्योंकि हड्डी मैट्रिक्स हड्डी की कोशिकाओं द्वारा सुगम परिवहन से स्वतंत्र रेडियोधर्मी अमीनो एसिड को अवशोषित कर सकता है। हड्डी को डीसेल्यूलराइज करके, हम हड्डी मैट्रिक्स द्वारा फंसे विकिरण की मात्रा का अनुमान लगा सकते हैं और इसे तेज को सामान्य करने के लिए बेसलाइन रेडियोधर्मिता के रूप में उपयोग कर सकते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण नियंत्रण एपिफिसेस और मज्जा को हटाने के बाद हड्डियों का वजन करना है। हड्डी के वजन का उपयोग हड्डी शाफ्ट के आकार के सापेक्ष अपटेक को सामान्य करने के लिए किया जाता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि हड्डियों का आकार एपिफिसेस को हटाने के दौरान परिवर्तनशीलता से लेकर आनुवंशिक उत्परिवर्तन तक कई कारकों के कारण भिन्न हो सकता है जो विकास को प्रभावित करते हैं। एक वैकल्पिक विधि सामान्यीकरण के लिए हड्डी शाफ्ट की डीएनए सामग्री को निर्धारित करना है। हमारे अनुभव में, डीएनए सामग्री को सामान्य करना हड्डी के वजन के बराबर है लेकिन रेडियोधर्मी सामग्री से निपटने के लिए अधिक कदम जोड़ता है। इस प्रकार, हम हड्डी के वजन को सामान्य करना पसंद करते हैं।

इन प्रोटोकॉल को सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें एटीडीसी 5, एमसी 3 टी 3, 293, या अन्य प्राथमिक कोशिकाएं जैसे कैल्वेरियल ओस्टियोब्लास्ट, चोंड्रोसाइट्स, अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाएं, अस्थि मज्जा मैक्रोफेज और ओस्टियोक्लास्ट शामिल हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल अन्य रेडियोधर्मी आइसोटोप (जैसे, 14सी और 35एस) के साथ-साथ अमीनो एसिड, ग्लूकोज और फैटी एसिड सहित विभिन्न पोषक तत्वों का मूल्यांकन करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल II को वयस्क हड्डियों और पेलेट संस्कृतियों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, इनक्यूबेशन समय के समायोजन पर विचार किया जाता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल अत्यधिक अनुकूलनीय है, प्रयोगों का संचालन करने से पहले नए आइसोटोप लेबल अणुओं या नई सेल लाइनों के कैनेटीक्स को चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। परिवहन कैनेटीक्स विभिन्न अणुओं, विभिन्न आइसोटोप या विभिन्न सेल प्रकारों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

कार्नेर प्रयोगशाला को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान आर 01 अनुदान (एआर076325 और एआर071967) द्वारा सीएमके को समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin Gibco 25200
12-well plate Corning 3513
1 mL syringe BD precision 309628
30G Needle BD precision 305106
Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi PerkinElmer NET1123001MC
Beckman LS6500 scintillation counter
Calcium chloride Sigma C1016
Choline chloride Sigma C7077
D-(+)-Glucose solution Sigma G8769
Dissection Tool Forceps, scissors, scapels
DPBS Gibco 14190
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma E9884
HEPES(1M) Gibco 15630
L-[3,4-3H(N)]-Glutamine PerkinElmer NET551250UC
Liquid scintilation vials Sigma Z190535
Lithium chloride solution, 8M Sigma L7026
Magnesium chloride Sigma M8266
MEMα Gibco 12561
Microcentrifuge tube, 15mL Biotix 89511-256
NP-40 Sigma 492016
Potassium chloride Sigma P3911
Sodium bicarbonate Sigma S6014
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium Deoxycholate Sigma D6750
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Sonicator Sonic&Materials VCX130
Tris Base Sigma 648311
Ultima Gold (Scintillation solution) PerkinElmer 6013329
α-(Methylamino)isobutyric acid Sigma M2383

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References

  1. Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
  2. Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
  3. Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
  4. Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
  5. Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
  6. Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
  7. Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
  8. Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
  9. Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
  10. Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
  11. Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
  12. Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
  13. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  14. Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
  15. Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
  16. Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
  17. Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
  18. Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
  19. Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
  20. Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
  21. Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
  22. Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
  23. Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
  24. Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
  25. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).

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चिकित्सा अंक 182
सुसंस्कृत हड्डी कोशिकाओं और पृथक हड्डी शाफ्ट में अमीनो एसिड की खपत का मूल्यांकन
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Shen, L., Karner, C. M. Evaluation… More

Shen, L., Karner, C. M. Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts. J. Vis. Exp. (182), e62995, doi:10.3791/62995 (2022).

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