Summary
يقدم هذا البروتوكول مقايسة امتصاص الأحماض الأمينية المشعة ، وهو مفيد لتقييم استهلاك الأحماض الأمينية إما في الخلايا الأولية أو في العظام المعزولة.
Abstract
يعتمد نمو العظام والتوازن على تمايز ونشاط الخلايا العظمية المكونة للعظام. يتميز تمايز Osteoblast بالتتابع عن طريق الانتشار يليه تخليق البروتين وفي النهاية إفراز مصفوفة العظام. يتطلب الانتشار وتخليق البروتين إمدادات ثابتة من الأحماض الأمينية. على الرغم من ذلك ، لا يعرف سوى القليل جدا عن استهلاك الأحماض الأمينية في الخلايا العظمية. هنا نصف بروتوكولا حساسا للغاية تم تصميمه لقياس استهلاك الأحماض الأمينية باستخدام الأحماض الأمينية المشعة. تم تحسين هذه الطريقة لتحديد التغيرات في امتصاص الأحماض الأمينية المرتبطة بانتشار الخلايا العظمية العظمية أو التمايز أو علاجات الأدوية أو عوامل النمو أو التلاعب الجيني المختلف. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة بالتبادل لتحديد استهلاك الأحماض الأمينية في خطوط الخلايا المستزرعة أو الخلايا الأولية في المختبر أو في أعمدة العظام المعزولة خارج الجسم الحي. أخيرا ، يمكن تكييف طريقتنا بسهولة لقياس نقل أي من الأحماض الأمينية وكذلك الجلوكوز والمواد المغذية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية.
Introduction
الأحماض الأمينية هي مركبات عضوية تحتوي على مجموعات وظيفية أمينية (-NH2) وكربوكسيل (-COOH) مع سلسلة جانبية متغيرة خاصة بكل حمض أميني. بشكل عام ، تعرف الأحماض الأمينية بأنها المكون الأساسي للبروتين. في الآونة الأخيرة ، تم توضيح الاستخدامات الجديدة ووظائف الأحماض الأمينية. على سبيل المثال ، يمكن استقلاب الأحماض الأمينية الفردية لتوليد مستقلبات وسيطة تساهم في الطاقة الحيوية ، أو تعمل كعوامل مساعدة إنزيمية ، أو تنظم أنواع الأكسجين التفاعلية أو تستخدم لتوليف الأحماض الأمينية الأخرى1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . تظهر العديد من الدراسات أن استقلاب الأحماض الأمينية أمر بالغ الأهمية لتعدد قدرات الخلايا وانتشارها وتمايزها في سياقات مختلفة3،6،11،12،13،14،15،16،17.
الخلايا العظمية هي خلايا إفرازية تنتج وتفرز مصفوفة العظام الغنية خارج الخلية من النوع 1 من الكولاجين. للحفاظ على معدلات عالية من تخليق البروتين أثناء تكوين العظام ، تتطلب الخلايا العظمية إمدادات ثابتة من الأحماض الأمينية. لتلبية هذا الطلب ، يجب أن تكتسب الخلايا العظمية بنشاط الأحماض الأمينية. تمشيا مع هذا ، تكشف الدراسات الحديثة عن أهمية امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي في نشاط الخلايا العظمية العظمية وتكوين العظام15،16،17،18،19،20.
تكتسب الخلايا العظمية الأحماض الأمينية الخلوية من ثلاثة مصادر رئيسية: الوسط خارج الخلية ، وتدهور البروتين داخل الخلايا ، والتخليق الحيوي للأحماض الأمينية الجديدة. سيركز هذا البروتوكول على تقييم امتصاص الأحماض الأمينية من البيئة خارج الخلية. تعتمد الطرق الأكثر شيوعا لقياس امتصاص الأحماض الأمينية إما على الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية (على سبيل المثال ، 3H أو 14C) أو النظائر الثقيلة المصنفة (على سبيل المثال ، 13C). يمكن لمقايسات النظائر الثقيلة تحليل امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي بشكل أكثر شمولا وأمانا ولكنها تستغرق وقتا أطول في إكمالها لعدة أيام حيث يستغرق الأمر يوما لإعداد العينات واشتقاقها وعدة أيام للتحليل على مقياس الطيف الكتلي اعتمادا على عدد العينات21,22. وعلى سبيل المقارنة، فإن مقايسات امتصاص الأحماض الأمينية المصنفة إشعاعيا ليست مفيدة حول عملية التمثيل الغذائي في المراحل النهائية ولكنها رخيصة وسريعة نسبيا، حيث يمكن إكمالها في غضون 2-3 ساعات من بداية التجربة23,24. هنا ، نصف بروتوكولا أساسيا قابلا للتعديل بسهولة مصمم لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية المشعة في الخلايا الأولية المستزرعة أو خطوط الخلايا في المختبر أو أعمدة العظام الفردية خارج الجسم الحي. يمكن توسيع نطاق تطبيق هذين البروتوكولين ليشمل الأحماض الأمينية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية وغيرها من أنواع الخلايا والأنسجة المرتبطة بالعظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع إجراءات الفئران الموضحة هنا من قبل لجان الدراسات الحيوانية في المركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس في دالاس. تمت الموافقة على بروتوكول الإشعاع من قبل اللجنة الاستشارية للسلامة الإشعاعية في المركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس في دالاس.
1. امتصاص الأحماض الأمينية في الخلايا (البروتوكول الأول)
- لوحة 5 × 104 خلايا ST2 في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 12 بئرا. خلايا صفيحية في α-MEM تحتوي على 10٪ FBS و 100 U / mL البنسلين و 0.1 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (القلم / العقدية). قم بلوحة آبار إضافية من الخلايا لتحديد عدد الخلايا لكل شرط للتطبيع في الخطوة 1.12. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- زراعة الخلايا لمدة 2-3 أيام حتى التقاء.
- في يوم التجربة ، قم بإعداد الحلول التالية: 1x محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS) ، و pH 7.4 و Krebs Ringers HEPES (KRH) ، ودرجة الحموضة 8.0: (120 mM NaCl ، 5 mM KCl ، و 2 mM CaCl 2 ، و 1 mM MgCl2 ، و NaHCO3 ، و 5 mM HEPES ، و 1 mM D-Glucose). السخونة إلى 37 درجة مئوية.
- شفط الوسط وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من 1x PBS ، درجة الحموضة 7.4.
ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب أيضا للانقسام السريع للخلايا غير الملتقية. في هذه الحالة ، من المهم تطبيع النشاط الإشعاعي إما إلى رقم الخلية المطلق أو محتوى الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، ضع في اعتبارك زيادة حجم لوحة أو قارورة الثقافة لزيادة إجمالي عدد الخلايا وقيم cpm. هذا مهم لتحديد تجريبيا على أساس فردي. - استنشاق 1x PBS وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1 مل KRH.
- اصنع 4 ميكروسيت / مل L-[3,4-3 H]-الجلوتامين وسائط العمل عن طريق تخفيف 4 ميكرولتر من [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-مخزون الجلوتامين لكل 1 مل من KRH.
ملاحظة: قبل استخدام المواد المشعة، يرجى الاتصال بمكتب السلامة الإشعاعية في مؤسستك المنزلية للحصول على الموافقات. يجب تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالإشعاع خلف الدرع الزجاجي الشبكي. - احتضان الخلايا مع 0.5 مل من KRH تحتوي على 4 μCi / mL L-[3,4-3 H]-وسائط عمل الجلوتامين لمدة 5 دقائق.
- جمع الوسط المشع وتوزيعه في حاوية النفايات السائلة. اغسل الخلايا ثلاث مرات لفترة وجيزة باستخدام KRH البارد لإنهاء التفاعل. جمع والتخلص من جميع الغسلات في حاوية النفايات السائلة المشعة.
- أضف 1 مل من 1٪ SDS إلى كل بئر و triturate 10x لتحليل الخلايا وتجانسها. انقل التحلل الخلوي إلى أنابيب 1.5 مل. تخلص من ألواح زراعة الخلايا والماصات المصلية وأطراف الماصة في حاوية النفايات المشعة الصلبة.
- جهاز طرد مركزي بسرعة >10,000 × جم لمدة 10 دقائق. انقل المواد الفائقة إلى قوارير تلألؤ تحتوي على 8 مل من محلول اللمعان. اخلطي عن طريق هز قوارير التلألؤ بقوة. تخلص من الأنابيب وأطراف الماصة في حاوية النفايات المشعة الصلبة.
- اقرأ النشاط الإشعاعي بالأعداد في الدقيقة (cpm) باستخدام عداد اللمعان. تخلص من قوارير التلألؤ في حاوية نفايات قارورة اللمعان.
- التريبسين وإنعاش وإحصاء الخلايا من الصفائح غير المشعة المتبقية من الخلايا (انظر الخطوة 1.1) لتقدير عدد الخلايا في الثقافات المشعة المحللة. باستخدام مقياس الدم، احسب عدد الخلايا لكل بئر غير مشع لكل حالة تجريبية. تطبيع ال cpm من الخطوة 1.11 إلى رقم الخلية المقدر من الصفائح غير المشعة.
- بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة التلوث من غطاء محرك السيارة ، والمقعد ، وجميع الأدوات باستخدام رذاذ مزيل للملوثات بالنشاط الإشعاعي. وأخيرا، قم بإجراء اختبارات المسح للتأكد من أن منطقة العمل خالية من الإشعاع.
2. امتصاص الأحماض الأمينية في أنسجة العظام المعزولة حديثا (البروتوكول الثاني)
- قبل تسخين KRH إلى 37 درجة مئوية.
- القتل الرحيم لماوس عمره 3 أيام وإزالة الجلد على الذراعين. قم بتفكيك الهوميري من الكتف باستخدام المقص وتشريح كل من humeri. قم بإزالة جميع الأنسجة المؤقتة باستخدام مشرط وملقط. إزالة المشاش من العظام.
ملاحظة: بالإضافة إلى humerii ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع عظم الفخذ الوليدي والظنبوب والكالفاريا وكذلك humerii و femora و tibiae المعزولة من الفئران البالغة من العمر 2 و 4 أشهر (بيانات غير منشورة). - اطرد النخاع من العظم وقم بوزن أعمدة العظام لتطبيعها في الخطوة 2.14.
- غلي عظم العضد في 1x PBS عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا من العظام. يتم استخدام العظم المسلوق decellularized كعنصر تحكم سلبي.
ملاحظة: كمراقبة للجودة، قام البارافين بتضمين العظام المسلوقة وغير المسلوقة للبقع النسيجية للتأكد بصريا من أن الغليان كان فعالا في إزالة الخلايا من العظام. - قم بموازنة كل من هوميري في 1 مل من KRH لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.
- قم بعمل حل عملي من 4 μCi / mL L-[2,3,4-3 H]-Arginine في KRH عن طريق تخفيف 4 ميكرولتر من 1μCi / μL L-[2,3,4-3 H]- مخزون أرجينين لكل 1 مل KRH.
ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب لتقييم امتصاص أي من المغذيات ذات العلامات المشعة يتم اختيارها. تم اختبار L-[2,3,4-3 H]-glutamine, L-[14CU]-alanine, و L-[2,3-3 H]-proline بنتائج مماثلة. تظهر بيانات أرجينين لتسليط الضوء على فائدة هذا البروتوكول.
تنبيه: يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تستخدم الإشعاع خلف الدرع الزجاجي الشبكي أثناء استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE). - احتضان كل من عظم التحكم التجريبي والمغلي بشكل منفصل في KRH الذي يحتوي على 4 μCi / mL L-[2,3,4-3 H]-Arginine لمدة تصل إلى 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: من المهم تحديد أوقات الحضانة تجريبيا لظروف مختلفة بما في ذلك عمر الفئران وعناصر الهيكل العظمي المختلفة وأنواع الأحماض الأمينية المشعة عن طريق إجراء دورة زمنية. يحدث التشبع في الغالب بعد حوالي 3-4 ساعات. يجب تقييم الامتصاص في نقطة زمنية في الغضب الخطي للامتصاص. - قم بإزالة الوسط المشع والتخلص منه في حاوية النفايات المشعة السائلة. اغسل هوميري ثلاث مرات باستخدام الثلج البارد 1 مل من KRH لإنهاء التفاعل. تخلص من جميع الغسلات في حاوية النفايات المشعة السائلة.
- انقل كل عظمة إلى أنبوب 1.5 مل. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8.0); 0.5٪ NP40 (v/v); 0.5٪ DOX (w/v); 0.1٪ SDS (w/v)]. تخلص من ألواح الاستزراع والماصات المصلية وأطراف الماصة في حاوية نفايات صلبة مشعة.
- قم بتجانس هوميري عن طريق تقطيع 100 مرة بالمقص في مخزن مؤقت RIPA.
- سونيكات (السعة: 35 ٪ ، نبض 1 ثانية) العظم المتجانس الناتج لمدة 10 ثوان.
ملاحظة: من المعروف أيضا أن الصوتنة تنتج الهباء الجوي. يمكن تنفيذ خطوات الصوتنة في خزانة السلامة البيولوجية. للحد من تكوين الهباء الجوي ، من المهم عدم ملء الأنابيب. يمكن أن يؤدي صوتنة أحجام العينات الصغيرة إلى صوتنة غير مكتملة أو فقدان العينة بسبب الرغوة. في حالة حدوث رغوة ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق حتى تستقر. - قم بتوضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند >10000 × g في درجة حرارة الغرفة. نقل 200 ميكرولتر من supernatant إلى قوارير تلألؤ تحتوي على 8 مل من محلول اللمعان. اخلطي عن طريق هز قوارير التلألؤ بقوة. تخلص من جميع النفايات المشعة الصلبة (مثل الأنابيب المستعملة، وأطراف الماصة، والألواح، وما إلى ذلك) في حاوية النفايات المشعة الصلبة.
- اقرأ النشاط الإشعاعي (cpm) باستخدام عداد التلألؤ. تخلص من قوارير التلألؤ المستخدمة في حاوية النفايات المشعة المخصصة لقوارير التلألؤ.
- اطرح المقطع المكعب للعظم المغلي (القيمة القاعدية) من المقطع في الدقيقة للعظم التجريبي. تطبيع النشاط الإشعاعي مع وزن العظام من الخطوة 2.3.
- رش غطاء محرك السيارة والأدوات والمقعد المزيل للنشاط الإشعاعي بمحلول إزالة الملوثات من النشاط الإشعاعي. قم بإجراء اختبارات المسح للتأكد من أن منطقة العمل خالية من الإشعاع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تنظيم نقل الأحماض الأمينية من قبل العديد من ناقلات الأحماض الأمينية المرتبطة بالأغشية والتي تم تصنيفها في أنظمة نقل متميزة بناء على العديد من الخصائص ، بما في ذلك خصوصية الركيزة ، والحركيات ، وكذلك الاعتماد على الأيونات والأس الهيدروجيني25. على سبيل المثال ، يمكن التوسط في امتصاص الجلوتامين بواسطة أنظمة النقل المعتمدة على Na + و ASC و γ + L و N أو النظام L المستقل عن Na +. تتميز الأنظمة المعتمدة على Na + بالقدرة على استبدال Li + ب Na + (النظام N) أو الحساسية للحمض الأميني التناظري 2-(methylamino) isobutyric acid (MeAIB) (System A). كان الغرض من هذه التجربة هو تحديد كمية استهلاك الجلوتامين التي تعزى إلى كل نظام نقل. تم قياس امتصاص الجلوتامين L-[3,4-3H] في خلايا ST2 المتقاربة في KRH العادية التي تحتوي على 120 mM NaCl ، و Na + KRH الحرة التي تحتوي على 120 mM كلوريد الكولين ، و KRH العادية التي تحتوي على 5 mM MeAIB أو Na + KRH الحرة التي تحتوي على 120 mM LiCl. تم تطبيع إجمالي النشاط الإشعاعي (العد في الدقيقة) إلى رقم الخلية. أدت إزالة Na+ إلى انخفاض بنسبة 90٪ في امتصاص الجلوتامين. وهذا يشير إلى أن النظام L يمثل 10٪ من امتصاص الجلوتامين في حين أن 90٪ من امتصاص الجلوتامين يعتمد على Na+ في خلايا ST2 (الشكل 2). أدى وجود Li + فقط إلى زيادة امتصاص الجلوتامين بنسبة 2٪ مقارنة بالحالة الخالية من Na + في حين أن 5 mM MEAIB لم يؤثر على امتصاص الجلوتامين. تشير هذه البيانات إلى أن غالبية امتصاص الجلوتامين يتم بوساطة Systems ASC و γ + L بينما يكون النظام N والنظام A مسؤولين عن حوالي 2٪ و 0٪ من امتصاص الجلوتامين المعتمد على Na + ، على التوالي.
قمنا بتعديل البروتوكول الأول لتوصيف امتصاص الأحماض الأمينية في أعمدة العظام خارج الجسم الحي. في هذه التجربة اتبعنا البروتوكول الثاني لتوصيف حركية امتصاص الأرجينين في عظام طويلة معزولة من الفئران البالغة من العمر 3 أيام (p3). للقيام بذلك ، قمنا أولا بتشريح كل من humeri من الفئران p3. تمت إزالة المشاش ، وتم نسج النخاع وتم وزن كل عظم العضد للتطبيع. تم تعيين عظم العضد المقابل كعنصر تحكم سلبي وتم غليه لقتل النشاط الخلوي. ثم تم احتضان هوميري التجريبي والمغلي مع الأشعة 4μCi / mL L-[2,3,4-3 H]-أرجينين لمدة تصل إلى 2 ساعة. زاد امتصاص أرجينين بطريقة خطية على مدار هذه التجربة (الشكل 3A). وللمقارنة، لم يظهر الهوميري المسلوق زيادة ديناميكية في امتصاص الأرجينين في هذه التجربة، بل كان له نشاط إشعاعي قاعدي يعزى إلى امتزاز المسبار في مصفوفة العظام. يظهر امتصاص الأرجينين الطبيعي والمصحح في الشكل 3B.
الشكل 1: سير عمل مقايسات امتصاص الأحماض الأمينية الموسومة إشعاعيا. نظرة عامة تخطيطية لفحوصات امتصاص الأحماض الأمينية في المختبر (البروتوكول الأول) وفي العظام خارج الجسم الحي (البروتوكول الثاني). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخصائص الحركية لامتصاص الجلوتامين L-[3,4-3H] في ST2 في المختبر. (A) L-[3,4-3 H]-مقايسات امتصاص الجلوتامين التي أجريت في وجود (+) أو غياب (-) الصوديوم (Na+) أو MeAIB أو الليثيوم (Li+) في خلايا ST2. (ب) النسبة المئوية للمساهمات المقدرة للمنظومة ألف أو ن أو لام أو ASC γ + L في امتصاص الجلوتامين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خارج الجسم الحي L-[2,3,4-3 H]-امتصاص أرجينين في هوميري حديثي الولادة. (A) L-[2,3,4-3 H]-امتصاص أرجينين على مدى فترة زمنية من 2 ساعة في هوميري الحية والمسلوقة المعزولة من الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 3أيام. (ب) L-[2,3,4-3 H]-امتصاص أرجينين مع هوميري المسلوق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا سريعا وحساسا لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية استجابة لمختلف التباديل التجريبية إما في المختبر أو خارج الجسم الحي. بالمقارنة مع المجموعات المتاحة تجاريا (على سبيل المثال ، مجموعة تحديد الجلوتامين والغلوتامات) ، فإن هذه الطريقة أكثر حساسية وأسرع وأقل كثافة في العمالة16،17،25. في بروتوكولنا ، نقوم بتقييم الامتصاص في المخزن المؤقت Krebs Ringers HEPES. نحن نستخدم هذه الوسائط لأنها تركيبة قاعدية تسمح بإجراء تعديلات سريعة وسهلة لاختبار مجموعة متنوعة من الظروف لتوصيف امتصاص الأحماض الأمينية. على سبيل المثال, لاختبار ما إذا كان نظام النقل يعتمد على Na +, يمكننا ببساطة استبدال كلوريد الصوديوم مع كلوريد الكولين لجعل Na + KRH الحرة. هذه المرونة مفيدة لاستجواب أنظمة النقل المختلفة التي تتوسط امتصاص الأحماض الأمينية الفردية. وسائط النمو القاعدية مثل alpha-MEM مناسبة أيضا لهذا الفحص. في هذه الحالة ، نشتري عادة ألفا ميم التي تفتقر إلى الحمض الأميني الفردي المعني ، والذي يتم استبداله بالحمض الأميني المشع للتجربة. على سبيل المثال ، لتقييم امتصاص الجلوتامين ، نستخدم ألفا ميم الخالية من الجلوتامين في الخلايا اللحمية الأولية لنخاع العظم15. KRH لديها بعض القيود بسبب تكوينها البسيط. KRH ليست خيارا مثاليا إذا كان الهدف هو دراسة أنظمة النقل النشطة الثانوية مثل المتماثلين ومضادات النقل. على سبيل المثال ، يحدث امتصاص الليوسين من خلال Slc7a5 / Slc3a2 في مقابل الجلوتامين. في هذه الحالة ، قد يتم التقليل من شأن امتصاص الليوسين بسبب نقص الجلوتامين في KRH ؛ بدلا من ذلك ، سيكون من الأفضل استخدام وسيط alpha-MEM الخالي من الليوسين في هذه الحالة. من المهم أيضا ملاحظة أن استخدام عداد Geiger ليس إلزاميا عند العمل مع النظير 3H. ومع ذلك ، ينصح بإبقاء عداد Geiger قيد التشغيل كمجاملة لتنبيه الناس إلى أنك تعمل مع الإشعاع.
التحكم الحاسم والإلزامي للبروتوكول الثاني هو غليان العظم المقابل. هذا ضروري لأن مصفوفة العظام يمكن أن تمتص الأحماض الأمينية المشعة بشكل مستقل عن النقل الميسر بواسطة خلايا العظام. من خلال إزالة الخلايا من العظم ، يمكننا تقدير كمية الإشعاع المحبوسة بواسطة مصفوفة العظام واستخدامها كنشاط إشعاعي أساسي لتطبيع الامتصاص. عنصر تحكم مهم آخر هو وزن العظام بعد إزالة المشاش والنخاع. يستخدم وزن العظم لتطبيع الامتصاص بالنسبة لحجم عمود العظام. هذا مهم لأن حجم العظام قد يختلف بسبب العديد من العوامل التي تتراوح من التباين أثناء إزالة المشاش إلى الطفرات الجينية التي تؤثر على النمو. طريقة بديلة هي تحديد محتوى الحمض النووي لعمود العظام للتطبيع. في تجربتنا ، فإن تطبيع محتوى الحمض النووي يمكن مقارنته بوزن العظام ولكنه يضيف المزيد من الخطوات التي تتعامل مع المواد المشعة. وبالتالي ، فإننا نفضل تطبيع وزن العظام.
يمكن تكييف هذه البروتوكولات مع خطوط الخلايا ، بما في ذلك ATDC5 و MC3T3 و 293 أو الخلايا الأولية الأخرى مثل الخلايا العظمية الكلفاري والخلايا الغضروفية والخلايا اللحمية لنخاع العظم والبلاعم في نخاع العظم والخلايا العظمية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتوكولات قابلة للتكيف بسهولة لتقييم النظائر المشعة الأخرى (على سبيل المثال ، 14درجة مئوية و 35ثانية) بالإضافة إلى العناصر الغذائية المختلفة ، بما في ذلك الأحماض الأمينية والجلوكوز والأحماض الدهنية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تكييف البروتوكول الثاني مع عظام البالغين ومزارع الكريات ، مع مراعاة التكيف مع وقت الحضانة. على الرغم من أن هذا البروتوكول قابل للتكيف بشكل كبير ، إلا أنه من المهم توصيف حركية الجزيئات الجديدة المسماة بالنظير أو في خطوط خلايا جديدة قبل إجراء التجارب. قد تختلف حركية النقل بشكل كبير بين جزيئات مختلفة أو نظائر مختلفة أو أنواع خلايا مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات.
Acknowledgments
يتم دعم مختبر كارنر من خلال منح المعهد الوطني للصحة R01 (AR076325 و AR071967) إلى C.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
