Summary
Denne protokollen presenterer en radiomerket aminosyreopptaksanalyse, som er nyttig for å evaluere aminosyreforbruk enten i primære celler eller i isolerte bein.
Abstract
Benutvikling og homeostase er avhengig av differensiering og aktivitet av bendannende osteoblaster. Osteoblastdifferensiering karakteriseres sekvensielt ved proliferasjon etterfulgt av proteinsyntese og til slutt benmatrikssekresjon. Spredning og proteinsyntese krever konstant tilførsel av aminosyrer. Til tross for dette er svært lite kjent om aminosyreforbruk i osteoblaster. Her beskriver vi en svært følsom protokoll som er designet for å måle aminosyreforbruk ved hjelp av radiomerkede aminosyrer. Denne metoden er optimalisert for å kvantifisere endringer i aminosyreopptak som er forbundet med osteoblastproliferasjon eller differensiering, medikament- eller vekstfaktorbehandlinger eller ulike genetiske manipulasjoner. Det er viktig at denne metoden kan brukes om hverandre for å kvantifisere aminosyreforbruket i dyrkede cellelinjer eller primære celler in vitro eller i isolerte beinaksler ex vivo. Endelig kan metoden vår enkelt tilpasses for å måle transporten av noen av aminosyrene, samt glukose og andre radiomerkede næringsstoffer.
Introduction
Aminosyrer er organiske forbindelser som inneholder en amino (-NH2) og karboksyl (-COOH) funksjonelle grupper med en variabel sidekjede som er spesifikk for hver aminosyre. Generelt er aminosyrer kjent som den grunnleggende bestanddelen av protein. Mer nylig har nye bruksområder og funksjoner av aminosyrer blitt belyst. For eksempel kan individuelle aminosyrer metaboliseres for å generere mellomliggende metabolitter som bidrar til bioenergetikk, fungerer som enzymatiske kofaktorer, regulerer reaktive oksygenarter eller brukes til å syntetisere andre aminosyrer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Mange studier viser at aminosyremetabolisme er kritisk for cellepluripotens, proliferasjon og differensiering i ulike sammenhenger 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblaster er sekretoriske celler som produserer og utskiller kollagen type 1 rik ekstracellulær beinmatrise. For å opprettholde høye nivåer av proteinsyntese under beindannelse, krever osteoblaster en konstant tilførsel av aminosyrer. For å møte denne etterspørselen må osteoblaster aktivt skaffe aminosyrer. I samsvar med dette viser nyere studier viktigheten av aminosyreopptak og metabolisme i osteoblastaktivitet og beindannelse 15,16,17,18,19,20.
Osteoblaster får cellulære aminosyrer fra tre hovedkilder: ekstracellulært miljø, intracellulær proteinnedbrytning og de novo aminosyrebiosyntese. Denne protokollen vil fokusere på evaluering av aminosyreopptak fra ekstracellulært miljø. De vanligste metodene for å måle aminosyreopptak er avhengige av enten radiomerkede (f.eks. 3H eller 14C) eller tunge isotopmerkede (f.eks. 13C) aminosyrer. Tunge isotopomeranalyser kan analysere aminosyreopptak og metabolisme grundigere og sikrere, men tar mer tidkrevende flere dager å fullføre, da det tar en dag å forberede og derivere prøver og flere dager å analysere på massespektrometeret avhengig av antall prøver21,22. Til sammenligning er radiomerkede aminosyreopptaksanalyser ikke informative om nedstrøms metabolisme, men er billige og relativt raske, og kan fullføres innen 2-3 timer fra starten av forsøket23,24. Her beskriver vi en lett modifiserbar grunnprotokoll designet for å evaluere radiomerket aminosyreopptak i dyrkede primære celler eller cellelinjer in vitro eller individuelle benaksler ex vivo. Anvendelsen av disse to protokollene kan utvides til andre radiomerkede aminosyrer og andre beinassosierte celletyper og vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museprosedyrer beskrevet her ble godkjent av dyreforsøkskomiteene ved University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas. Strålingsprotokollen ble godkjent av Radiation Safety Advisory Committee ved University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas.
1. Aminosyreopptak i celler (protokoll I)
- Plate 5 x 104 ST2-celler i hver brønn i en 12-brønns vevskulturplate. Plateceller i α-MEM som inneholder 10 % FBS, 100 U/ml penicillin og 0,1 μg/ml streptomycin (Pen/Strep). Plate ekstra brønner av celler for å kvantifisere celletallet per betingelse for normaliseringene i trinn 1.12. Inkuber celler i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Kultur cellene i 2-3 dager til de er sammenflytende.
- På dagen for forsøket, lag følgende løsninger: 1x fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4 og Krebs Ringers HEPES (KRH) buffer, pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-glukose). Forvarm til 37 °C.
- Aspirer mediet og vask cellene to ganger med 1 ml 1x PBS, pH 7,4.
MERK: Denne protokollen er også egnet for rask deling av ikke-konfluente celler. I dette tilfellet er det viktig å normalisere radioaktiviteten til enten absolutt cellenummer eller DNA-innhold. I tillegg bør du vurdere å øke størrelsen på kulturplaten eller kolben for å øke det totale celletallet og cpm-verdiene. Dette er viktig for å bestemme empirisk på individuell basis. - Aspirer 1x PBS og vask cellene en gang med 1 ml KRH.
- Lag 4 μCi / ml L-[3,4-3 H] -Glutamin arbeidsmedier ved å fortynne 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H] -Glutaminlager per 1 ml KRH.
MERK: Før du bruker radioaktive materialer, vennligst kontakt Office of Radiation Safety ved din hjemmeinstitusjon for å få godkjenninger. Alle prosedyrer knyttet til stråling må utføres bak plexiglassskjoldet. - Inkuber celler med 0,5 ml KRH inneholdende 4 μCi / ml L-[3,4-3 H] -Glutamin arbeidsmedier i 5 minutter.
- Samle det radioaktive mediet og dispenser i væskeavfallsbeholderen. Vask cellene tre ganger kort med iskald KRH for å avslutte reaksjonen. Samle og kast alle vaskene i beholderen for radioaktivt flytende avfall.
- Tilsett 1 ml 1% SDS til hver brønn og triturere 10x for å lyse og homogenisere cellene. Overfør cellelysatene til 1,5 ml rør. Kast cellekulturplater, serologiske pipetter og pipettespisser i beholderen for fast radioaktivt avfall.
- Sentrifuge på >10.000 x g i 10 min. Overfør supernatantene til scintillasjonshetteglass som inneholder 8 ml scintillasjonsoppløsning. Bland ved å riste scintillasjonshetteglassene kraftig. Kast slanger og pipettespisser i beholder for fast radioaktivt avfall.
- Les radioaktivitet i tellinger per minutt (cpm) ved hjelp av en Scintillation-teller. Kast hetteglass med scintillasjon i beholderen for scintillasjonshetteglass.
- Trypsinisere, resuspendere og telle cellene fra de gjenværende ikke-radioaktive celleplatene (se trinn 1.1) for å estimere antall celler i de lysede, radioaktive kulturene. Ved hjelp av et hemocytometer teller antall celler per ikke-radioaktiv brønn for hver eksperimentell tilstand. Normaliser cpm fra trinn 1.11 til estimert cellenummer fra de ikke-radioaktive platene.
- Etter at forsøket er fullført, dekontaminerer du cellekulturhetten, benken og alle instrumenter med en radioaktivitetsdekontaminantspray. Til slutt, utfør tørketester for å sikre at arbeidsområdet er strålingsfritt.
2. Aminosyreopptak i nyisolert beinvev (protokoll II)
- Forvarm KRH til 37 °C.
- Avliv en 3 dager gammel mus og fjern huden på armene. Disarticulate humeri fra skulderen ved hjelp av saks og dissekere ut begge humeri. Fjern alt ekstremt vev ved hjelp av en skalpell og tang. Fjern epifysene fra beinet.
MERK: I tillegg til humerii, kan denne protokollen tilpasses neonatal femora, tibiae og calvariae samt humerii, femora og tibiae isolert fra 2- og 4 måneder gamle mus (upubliserte data). - Skyll ut margen fra beinet og vei beinsjaktene for å normalisere i trinn 2.14.
- Kok en humerus i 1x PBS ved 100 ° C i 10 minutter for å decellularisere beinet. Det decellulariserte kokte beinet brukes som en negativ kontroll.
MERK: Som en kvalitetskontroll legger parafin inn kokte og ikke-kokte bein for histologiske flekker for visuelt å bekrefte at koking var effektiv i å decellularisere beinet. - Likevekt begge humeri i 1 ml KRH i 30 minutter i cellekulturinkubatoren ved 37 °C.
- Lag en arbeidsløsning på 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-Arginin i KRH ved å fortynne 4 μL 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Argininlager per 1 ml KRH.
MERK: Denne protokollen er egnet til å evaluere opptaket av det radiomerkede næringsstoffet som er valgt. L-[2,3,4-3 H]-glutamin, L-[14CU]-alanin og L-[2,3-3 H]-prolin er testet med lignende resultater. Arginindata er vist å markere nytten av denne protokollen.
FORSIKTIG: Alle prosedyrer som bruker stråling må utføres bak pleksiglassskjoldet mens du bruker passende personlig verneutstyr (PPE). - Inkuber både det eksperimentelle og kokte kontrollbenet separat i KRH som inneholder 4 μCi / ml L-[2,3,4-3 H] -Arginin i opptil 90 minutter ved 37 ° C.
MERK: Det er viktig å empirisk bestemme inkubasjonstidene for forskjellige forhold, inkludert musenes alder, forskjellige skjelettelementer og typer radiomerkede aminosyrer ved å utføre et tidsforløp. Metning oppstår for det meste etter ca. 3-4 timer. Opptak bør evalueres på et tidspunkt i det lineære raseriet for opptak. - Fjern det radioaktive mediet og kast det i beholderen for flytende radioaktivt avfall. Vask humeri tre ganger med iskald 1 ml KRH for å avslutte reaksjonen. Kast alle vaskene i beholderen for flytende radioaktivt avfall.
- Overfør hvert bein til et 1,5 ml rør. Tilsett 500 μL RIPA-buffer [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (w/v); 0,1% SDS (w/v)]. Kast kulturplater, serologiske pipetter og pipettespisser i en beholder for radioaktivt fast avfall.
- Homogeniser humeri ved å hakke 100 ganger med saks i en RIPA-buffer.
- Sonicat (Amplitude: 35%, Puls 1 s) det resulterende homogeniserte beinet i 10 s.
MERK: Sonikering er også kjent for å produsere aerosoler. Sonikeringstrinn kan utføres i et biologisk sikkerhetsskap. For å redusere aerosoldannelsen er det viktig å ikke overfylle rørene. Sonikering av små prøvevolumer kan resultere i ufullstendig sonikering eller prøvetap på grunn av skumdannelse. Hvis skumdannelse oppstår, sentrifuger prøven i 5 minutter for å bosette seg. - Avklar lysatet ved sentrifugering i 10 minutter ved >10 000 x g ved romtemperatur. Overfør 200 mikroliter supernatant til hetteglass med scintillasjonsvæske inneholdende 8 ml scintillasjonsoppløsning. Bland ved å riste scintillasjonshetteglassene kraftig. Kast alt fast radioaktivt avfall (f.eks. brukte rør, pipettespisser, plater osv.) i beholderen for fast radioaktivt avfall.
- Les radioaktivitet (cpm) ved hjelp av Scintillation-telleren. Kast brukte hetteglass med scintillasjon i beholderen for radioaktivt avfall beregnet for hetteglass med scintillasjon.
- Trekk cpm av kokt bein (basal verdi) fra cpm av eksperimentelt bein. Normaliser radioaktiviteten med benvekt fra trinn 2.3.
- Spray cellekulturhetten, instrumentene og benken med radioaktivitetsdekontaminant. Utfør tørketester for å bekrefte at arbeidsområdet er strålingsfritt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aminosyretransport reguleres av mange membranbundne aminosyretransportører som har blitt kategorisert i forskjellige transportsystemer basert på mange egenskaper, inkludert substratspesifisitet, kinetikk, samt ion- og pH-avhengighet25. For eksempel kan glutaminopptak medieres av de Na+-avhengige transportsystemene A, ASC, γ+L og N eller det Na+-uavhengige system L. De Na+-avhengige systemene utmerker seg ved evnen til å erstatte Li+ for Na+ (System N) eller følsomhet overfor aminosyreanalogen 2-(metylamino)isosmørsyre (MeAIB) (System A). Formålet med dette eksperimentet var å definere mengden glutaminforbruk som kan tilskrives hvert transportsystem. L-[3,4-3 H] glutaminopptak ble målt i konfluente ST2-celler i normal KRH inneholdende 120 mM NaCl, Na+ fri KRH inneholdende 120 mM kolinklorid, normal KRH inneholdende 5 mM MeAIB eller Na+ fri KRH inneholdende 120 mM LiCl. Total radioaktivitet (antall per minutt) ble normalisert til cellenummer. Fjerning av Na+ førte til 90 % reduksjon i glutaminopptaket. Dette indikerte at system L står for 10 % av glutaminopptaket, mens 90 % av glutaminopptaket er Na+-avhengig i ST2-celler (figur 2). Tilstedeværelsen av Li+ økte bare glutaminopptaket med 2 % sammenlignet med Na+-fri tilstand, mens 5 mM MEAIB ikke påvirket glutaminopptaket. Disse dataene indikerer at størstedelen av glutaminopptaket er mediert av systemene ASC og γ + L, mens system N og system A er ansvarlige for henholdsvis omtrent 2 % og 0 % av Na+-avhengig glutaminopptak.
Vi modifiserte protokoll I for å karakterisere aminosyreopptak i beinskaft ex vivo. I dette eksperimentet fulgte vi protokoll II for å karakterisere argininopptakskinetikk i isolerte lange bein fra 3 dager gamle (p3) mus. For å gjøre dette dissekerte vi først begge humeri fra p3-mus. Epifysene ble fjernet, og margen ble spunnet ut og hver humerus ble veid for normalisering. Den kontralaterale humerus ble betegnet som en negativ kontroll og ble kokt for å drepe cellulær aktivitet. Den eksperimentelle og kokte humeri ble deretter inkubert med radiomerket 4μCi / ml L-[2,3,4-3 H] -Arginine i opptil 2 timer. Argininopptaket økte lineært i løpet av dette eksperimentet (figur 3A). Til sammenligning viste den kokte humeri ikke en dynamisk økning av argininopptak i dette eksperimentet, men hadde snarere en basal radioaktivitet som tilskrives adsorpsjon av sonden i beinmatrisen. Det normaliserte og korrigerte argininopptaket er vist i figur 3B.
Figur 1: Arbeidsflyt av radiomerkede aminosyreopptaksanalyser. Skjematisk oversikt over aminosyreopptaksprøver in vitro (protokoll I) og i bein ex vivo (protokoll II). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kinetiske egenskaper til L-[3,4-3 H]-glutaminopptak i ST2 in vitro. (A) L-[3,4-3 H]-Glutaminopptaksanalyser utført i nærvær (+) eller fravær (-) av natrium (Na +), MeAIB eller litium (Li +) i ST2-celler. (B) Prosentandel av estimerte bidrag fra system A, N, L eller ASC og γ + L til glutaminopptak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Ex vivo L-[2,3,4-3 H]-Arginine opptak i neonatal humeri. (A) L-[2,3,4-3 H]-Arginine opptak utført over et tidsforløp på 2 timer i levende og kokt humeri isolert fra 3 dager gamle C57BL/6 mus. (B) Normalisert L-[2,3,4-3 H]-Arginine opptak med kokt humeri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her gir en rask og sensitiv tilnærming til å evaluere aminosyreopptak som respons på ulike eksperimentelle permutasjoner enten in vitro eller ex vivo. Sammenlignet med kommersielt tilgjengelige sett (f.eks. Glutamin og glutamatbestemmelsessett), er denne metoden mye mer følsom, raskere og mindre arbeidsintensiv16,17,25. I vår protokoll evaluerer vi opptak i Krebs Ringers HEPES-buffer. Vi bruker dette mediet, da det er en basal formel som muliggjør raske og enkle modifikasjoner for å teste et mangfoldig utvalg av forhold for å karakterisere aminosyreopptak. For eksempel, for å teste om transportsystemet er Na+-avhengig, kan vi ganske enkelt erstatte NaCl med kolinklorid for å gjøre Na+ fri KRH. Denne fleksibiliteten er fordelaktig for å forhøre de ulike transportsystemene som formidler opptak av individuelle aminosyrer. Basale vekstmedier som alfa-MEM er også egnet for denne analysen. I dette tilfellet kjøper vi vanligvis alfa-MEM som mangler den aktuelle aminosyren, som erstattes med den radiomerkede aminosyren for forsøket. For eksempel, for å evaluere glutaminopptak bruker vi glutaminfritt alfa-MEM i primære benmargstromalceller15. KRH har noen begrensninger på grunn av sin enkle sammensetning. KRH er ikke et ideelt alternativ hvis målet er å studere sekundære aktive transportsystemer som symportere og antiportere. For eksempel forekommer leucinopptak gjennom Slc7a5 / Slc3a2 i bytte mot glutamin. I dette tilfellet kan leucinopptak undervurderes på grunn av mangel på glutamin i KRH; snarere vil bruk av leucinfritt alfa-MEM-medium være å foretrekke i dette tilfellet. Det er også viktig å merke seg at bruk av en geigerteller ikke er obligatorisk når du arbeider med isotop 3H. Det anbefales imidlertid å holde geigertelleren på som en høflighet for å varsle folk om at du jobber med stråling.
En kritisk og obligatorisk kontroll for den andre protokollen er koking av det kontralaterale beinet. Dette er nødvendig da benmatrisen kan absorbere radioaktive aminosyrer uavhengig av lettere transport av beinceller. Ved å decellularisere beinet, kan vi estimere mengden stråling fanget av beinmatrise og bruke den som baseline radioaktivitet for å normalisere opptaket. En annen viktig kontroll er å veie beinene etter fjerning av epifyser og marg. Vekten av beinet brukes til å normalisere opptaket i forhold til størrelsen på beinakselen. Dette er viktig da størrelsen på beinene kan variere på grunn av mange faktorer som spenner fra variabilitet under fjerning av epifysene til genetiske mutasjoner som påvirker veksten. En alternativ metode er å kvantifisere DNA-innholdet i beinakselen for normalisering. Etter vår erfaring er normalisering av DNA-innhold sammenlignbart med beinvekt, men legger til flere trinn som omhandler radioaktive materialer. Dermed foretrekker vi å normalisere til beinvekt.
Disse protokollene kan tilpasses cellelinjer, inkludert ATDC5, MC3T3, 293 eller andre primære celler som kalvariale osteoblaster, kondrocytter, benmargstromalceller, benmargmakrofager og osteoklaster. I tillegg er protokollene lett tilpasningsdyktige for å evaluere andre radioaktive isotoper (f.eks. 14C og 35S) samt forskjellige næringsstoffer, inkludert aminosyrer, glukose og fettsyrer. Videre kan protokoll II også tilpasses voksne bein og pelletskulturer, med hensyn til justering av inkubasjonstiden. Selv om denne protokollen er svært tilpasningsdyktig, er det viktig å karakterisere kinetikken til de nye isotopmerkede molekylene eller i nye cellelinjer før du utfører eksperimenter. Transportkinetikken kan variere drastisk mellom forskjellige molekyler, forskjellige isotoper eller forskjellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Karner-laboratoriet støttes av National Institute of Health R01-tilskudd (AR076325 og AR071967) til CMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
