Summary
Denne protokol præsenterer et radioaktivt mærket aminosyreoptagelsesassay, som er nyttigt til evaluering af aminosyreforbrug enten i primære celler eller i isolerede knogler.
Abstract
Knogleudvikling og homeostase er afhængig af differentieringen og aktiviteten af knogledannende osteoblaster. Osteoblastdifferentiering er sekventielt karakteriseret ved proliferation efterfulgt af proteinsyntese og i sidste ende knoglematrixsekretion. Proliferation og proteinsyntese kræver en konstant tilførsel af aminosyrer. På trods af dette er der meget lidt kendt om aminosyreforbrug i osteoblaster. Her beskriver vi en meget følsom protokol, der er designet til at måle aminosyreforbrug ved hjælp af radioaktivt mærkede aminosyrer. Denne metode er optimeret til at kvantificere ændringer i aminosyreoptagelse, der er forbundet med osteoblastproliferation eller differentiering, lægemiddel- eller vækstfaktorbehandlinger eller forskellige genetiske manipulationer. Det er vigtigt, at denne metode kan bruges i flæng til at kvantificere aminosyreforbruget i dyrkede cellelinjer eller primære celler in vitro eller i isolerede knogleaksler ex vivo. Endelig kan vores metode let tilpasses til at måle transporten af nogen af aminosyrerne samt glukose og andre radioaktivt mærkede næringsstoffer.
Introduction
Aminosyrer er organiske forbindelser, der indeholder en amino (-NH2) og carboxyl (-COOH) funktionelle grupper med en variabel sidekæde, der er specifik for hver aminosyre. Generelt er aminosyrer velkendte som den grundlæggende bestanddel af protein. For nylig er nye anvendelser og funktioner af aminosyrer blevet belyst. For eksempel kan individuelle aminosyrer metaboliseres for at generere mellemliggende metabolitter, der bidrager til bioenergetik, fungerer som enzymatiske cofaktorer, regulerer reaktive iltarter eller bruges til at syntetisere andre aminosyrer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Mange undersøgelser viser, at aminosyremetabolisme er kritisk for cellepluripotens, proliferation og differentiering i forskellige sammenhænge 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblaster er sekretoriske celler, der producerer og udskiller kollagen type 1 rig ekstracellulær knoglematrix. For at opretholde høje proteinsyntesehastigheder under knogledannelse kræver osteoblaster en konstant forsyning af aminosyrer. For at imødekomme denne efterspørgsel skal osteoblaster aktivt erhverve aminosyrer. I overensstemmelse hermed afslører nylige undersøgelser betydningen af aminosyreoptagelse og metabolisme i osteoblastaktivitet og knogledannelse 15,16,17,18,19,20.
Osteoblaster erhverver cellulære aminosyrer fra tre hovedkilder: ekstracellulært miljø, intracellulær proteinnedbrydning og de novo aminosyrebiosyntese. Denne protokol vil fokusere på evaluering af aminosyreoptagelse fra ekstracellulært miljø. De mest almindelige metoder til måling af aminosyreoptagelse er afhængige af enten radioaktivt mærkede (f.eks. 3H eller 14C) eller tunge isotopmærkede (f.eks. 13C) aminosyrer. Tunge isotopomeranalyser kan analysere aminosyreoptagelse og metabolisme mere grundigt og sikkert, men er mere tidskrævende at tage flere dage at gennemføre, da det tager en dag at forberede og aflede prøver og flere dage at analysere på massespektrometeret afhængigt af antallet af prøver21,22. Til sammenligning er radioaktivt mærkede aminosyreoptagelsesanalyser ikke informative om downstream-metabolisme, men er billige og relativt hurtige og kan afsluttes inden for 2-3 timer fra eksperimentets start23,24. Her beskriver vi en let modificerbar basisprotokol designet til at evaluere radioaktivt mærket aminosyreoptagelse i dyrkede primære celler eller cellelinjer in vitro eller individuelle knogleaksler ex vivo. Anvendelsen af disse to protokoller kan udvides til andre radioaktivt mærkede aminosyrer og andre knogleassocierede celletyper og væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museprocedurer, der er beskrevet heri, blev godkendt af dyreforsøgsudvalgene ved University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas. Strålingsprotokollen blev godkendt af Radiation Safety Advisory Committee ved University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas.
1. Optagelse af aminosyrer i celler (protokol I)
- Plade 5 x 104 ST2-celler i hver brønd i en 12-brønds vævskulturplade. Pladeceller i α-MEM indeholdende 10% FBS, 100 U/ml penicillin og 0,1 μg/ml streptomycin (Pen/Strep). Plade ekstra brønde af celler for at kvantificere cellenummeret pr. betingelse for normaliseringerne i trin 1.12. Inkubere celler i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Kultur cellerne i 2-3 dage, indtil de er sammenflydende.
- På forsøgsdagen fremstilles følgende opløsninger: 1x fosfatbufferet saltvand (PBS), pH 7,4 og Krebs Ringers HEPES (KRH) buffer, pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-glucose). Forvarm til 37 °C.
- Aspirer mediet og vask cellerne to gange med 1 ml 1x PBS, pH 7,4.
BEMÆRK: Denne protokol er også egnet til hurtigt at dividere ikke-sammenflydende celler. I dette tilfælde er det vigtigt at normalisere radioaktiviteten til enten absolut cellenummer eller DNA-indhold. Derudover skal du overveje at øge størrelsen på kulturpladen eller kolben for at øge det samlede celleantal og cpm-værdier. Dette er vigtigt at bestemme empirisk på individuel basis. - Aspirer 1x PBS og vask cellerne en gang med 1 ml KRH.
- Der fremstilles 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-glutaminarbejdsmedier ved at fortynde 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-glutaminbestand pr. 1 ml KRH.
BEMÆRK: Før du bruger radioaktive materialer, bedes du kontakte Office of Radiation Safety på din hjemmeinstitution for at få godkendelser. Alle procedurer relateret til stråling skal udføres bag plexiglasskærmen. - Inkubere celler med 0,5 ml KRH indeholdende 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-glutaminarbejdsmedier i 5 min.
- Saml det radioaktive medium og dispenser i beholderen til flydende affald. Vask cellerne tre gange kort med iskold KRH for at afslutte reaktionen. Saml og kassér alle vaske i beholderen til radioaktivt flydende affald.
- Tilsæt 1 ml 1% SDS til hver brønd og triturere 10x for at lyse og homogenisere cellerne. Overfør cellelysaterne til 1,5 ml rør. Kassér cellekulturplader, serologiske pipetter og pipettespidser i beholderen til fast radioaktivt affald.
- Centrifuge ved >10.000 x g i 10 min. Supernatanterne overføres til scintillationshætteglas indeholdende 8 ml scintillationsopløsning. Bland ved at ryste scintillationshætteglassene kraftigt. Kassér rør og pipettespidser i beholder til fast radioaktivt affald.
- Læs radioaktivitet i tællinger pr. minut (cpm) ved hjælp af en Scintillation tæller. Kassér hætteglas med scintillation i beholderen til scintillation hætteglasaffald.
- Trypsiniser, resuspender og tæl cellerne fra de resterende ikke-radioaktive plader af celler (se trin 1.1) for at estimere antallet af celler i de lyserede, radioaktive kulturer. Ved hjælp af et hæmocytometer tælles antallet af celler pr. ikke-radioaktiv brønd for hver eksperimentel tilstand. Normaliser cpm fra trin 1.11 til det estimerede celleantal fra de ikke-radioaktive plader.
- Efter afslutningen af eksperimentet dekontamineres cellekulturhætten, bænken og alle instrumenter med en radioaktivitetsdekontaminant spray. Endelig skal du udføre aftørringstest for at sikre, at arbejdsområdet er strålingsfrit.
2. Optagelse af aminosyrer i frisk isoleret knoglevæv (protokol II)
- Forvarm KRH til 37 °C.
- Afliv en 3 dage gammel mus og fjern huden på armene. Disartikuler humeri fra skulderen ved hjælp af en saks og disseker begge humeri. Fjern alle ekstemporaneøse væv ved hjælp af en skalpel og tang. Fjern epifyserne fra knoglen.
BEMÆRK: Ud over humerii kan denne protokol tilpasses neonatal femora, tibiae og calvariae samt humerii, femora og tibiae isoleret fra 2- og 4 måneder gamle mus (upublicerede data). - Skyl marv ud af knoglen og vej knogleakslerne for at normalisere i trin 2.14.
- Kog en humerus i 1x PBS ved 100 °C i 10 minutter for at decellularisere knoglen. Den decellulariserede kogte knogle bruges som en negativ kontrol.
BEMÆRK: Som en kvalitetskontrol indlejrede paraffin de kogte og ikke-kogte knogler til histologiske pletter for visuelt at bekræfte, at kogning var effektiv til decellularisering af knoglen. - Der ligevægtes begge humeri i 1 ml KRH i 30 minutter i cellekulturinkubatoren ved 37 °C.
- Der fremstilles en arbejdsløsning med 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-arginin i KRH ved at fortynde 4 μL 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Argininbestand pr. 1 ml KRH.
BEMÆRK: Denne protokol er egnet til at evaluere optagelsen af det radioaktivt mærkede næringsstof, der vælges. L-[2,3,4-3 H]-glutamin, L-[14CU]-alanin og L-[2,3-3 H]-prolin er blevet testet med lignende resultater. Arginindata er vist for at fremhæve nytten af denne protokol.
FORSIGTIG: Alle procedurer ved hjælp af stråling skal udføres bag plexiglasskærmen under brug af passende personlige værnemidler (PPE). - Både den eksperimentelle og den kogte kontrolknogle inkuberes separat i KRH indeholdende 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-arginin i op til 90 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Det er vigtigt empirisk at bestemme inkubationstiderne for forskellige forhold, herunder musens alder, forskellige skeletelementer og typerne af radioaktivt mærkede aminosyrer ved at udføre et tidsforløb. Mætning forekommer for det meste efter ca. 3-4 timer. Optagelsen bør evalueres på et tidspunkt i det lineære raseri af optagelse. - Fjern det radioaktive medium, og kassér det i beholderen til flydende radioaktivt affald. Vask humeri tre gange med iskold 1 ml KRH for at afslutte reaktionen. Kassér alle vaske i beholderen til flydende radioaktivt affald.
- Overfør hver knogle til et 1,5 ml rør. Der tilsættes 500 μL RAPA-buffer [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5 % NP40 (v/v); 0,5 % DOX (w/v); 0,1 % SDS (w/v)]. Kassér kulturpladerne, serologiske pipetter og pipettespidser i en beholder til radioaktivt fast affald.
- Homogeniser humeri ved at hugge 100 gange med en saks i en RIPA buffer.
- Sonicat (amplitude: 35%, puls 1 s) den resulterende homogeniserede knogle i 10 s.
BEMÆRK: Sonikering er også kendt for at producere aerosoler. Sonikeringstrin kan udføres i et biologisk sikkerhedsskab. For at reducere aerosoldannelse er det vigtigt ikke at overfylde rørene. Sonikering af små prøvevolumener kan resultere i ufuldstændig sonikering eller prøvetab på grund af skumdannelse. Hvis der opstår skumdannelse, centrifugeres prøven i 5 minutter for at sætte sig. - Lysatet klargøres ved centrifugering i 10 minutter ved >10.000 x g ved stuetemperatur. 200 μL af supernatanten overføres til scintillationshætteglas indeholdende 8 ml scintillationsopløsning. Bland ved at ryste scintillationshætteglassene kraftigt. Kassér alt fast radioaktivt affald (f.eks. brugte rør, pipettespidser, plader osv.) i beholderen til fast radioaktivt affald.
- Læs radioaktivitet (cpm) ved hjælp af Scintillation counter. Kassér brugte hætteglas med scintillation i beholderen til radioaktivt affald, der er beregnet til hætteglas med scintillation.
- Træk cpm af kogt knogle (basal værdi) fra cpm af eksperimentel knogle. Normaliser radioaktiviteten med knoglevægt fra trin 2.3.
- Sprøjt cellekulturhætten, instrumenterne og bænken med radioaktivitetsdekontaminant. Udfør aftørringstest for at bekræfte, at arbejdsområdet er strålingsfrit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aminosyretransport reguleres af mange membranbundne aminosyretransportører, der er blevet kategoriseret i forskellige transportsystemer baseret på adskillige egenskaber, herunder substratspecificitet, kinetik samt ion- og pH-afhængighed25. For eksempel kan glutaminoptagelse formidles af de Na +-afhængige transportsystemer A, ASC, γ+L og N eller det Na+-uafhængige system L. De Na+-afhængige systemer udmærker sig ved evnen til at erstatte Na+ (System N) med Li+ eller følsomheden over for aminosyreanalogen 2-(methylamino)isosmørsyre (MeAIB) (System A). Formålet med dette forsøg var at definere mængden af glutaminforbrug, der kan henføres til hvert transportsystem. L-[3,4-3 H] glutaminoptagelse blev målt i sammenflydende ST2-celler i normal KRH indeholdende 120 mM NaCl, Na+ fri KRH indeholdende 120 mM cholinchlorid, normal KRH indeholdende 5 mM MeAIB eller Na+ fri KRH indeholdende 120 mM LiCl. Total radioaktivitet (tællinger pr. Minut) blev normaliseret til cellenummer. Fjernelse af Na+ førte til 90 % reduktion i glutaminoptagelsen. Dette viste, at system L tegner sig for 10% af glutaminoptagelsen, mens 90% af glutaminoptagelsen er Na+ afhængig af ST2-celler (figur 2). Tilstedeværelsen af Li+ øgede kun glutaminoptagelsen med 2 % sammenlignet med den Na+-frie tilstand, mens 5 mM MEAIB ikke påvirkede optagelsen af glutamin. Disse data indikerer, at størstedelen af glutaminoptagelsen medieres af system ASC og γ + L, mens system N og system A er ansvarlige for henholdsvis ca. 2% og 0% af Na +-afhængig glutaminoptagelse.
Vi modificerede protokol I for at karakterisere aminosyreoptagelsen i knogleaksler ex vivo. I dette forsøg fulgte vi protokol II for at karakterisere argininoptagelseskinetik i isolerede lange knogler fra 3 dage gamle (p3) mus. For at gøre dette dissekerede vi først begge humeri fra p3-mus. Epifyserne blev fjernet, og marven blev spundet ud, og hver humerus blev vejet til normalisering. Den kontralaterale humerus blev betegnet som en negativ kontrol og blev kogt for at dræbe cellulær aktivitet. Den eksperimentelle og kogte humeri blev derefter inkuberet med radioaktivt mærket 4μCi / ml L-[2,3,4-3 H]-arginin i op til 2 timer. Argininoptagelsen steg lineært i løbet af dette eksperiment (figur 3A). Til sammenligning udviste den kogte humeri ikke en dynamisk stigning i argininoptagelsen i dette eksperiment, men havde snarere en basal radioaktivitet, der tilskrives adsorption af sonden i knoglematrixen. Den normaliserede og korrigerede argininoptagelse er vist i figur 3B.
Figur 1: Arbejdsgang for radioaktivt mærkede aminosyreoptagelsesanalyser. Skematisk oversigt over assays til optagelse af aminosyrer in vitro (protokol I) og knogler ex vivo (protokol II). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kinetiske egenskaber af L-[3,4-3 H]-glutaminoptagelse i ST2 in vitro. (A) L-[3,4-3 H]-glutaminoptagelsesassays udført i tilstedeværelse (+) eller fravær (-) af natrium (Na+), MeAIB eller lithium (Li+) i ST2-celler. (B) Procentdel af de anslåede bidrag fra system A, N, L eller ASC og γ + L til glutaminoptagelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ex vivo L-[2,3,4-3 H]-Argininoptagelse i neonatal humeri. (A) L-[2,3,4-3 H]-Argininoptagelse udført over et tidsforløb på 2 timer i levende og kogt humeri isoleret fra 3 dage gamle C57BL/6 mus. (B) Normaliseret L-[2,3,4-3 H]-argininoptagelse med kogt humeri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet heri, giver en hurtig og følsom tilgang til evaluering af aminosyreoptagelse som reaktion på forskellige eksperimentelle permutationer enten in vitro eller ex vivo. Sammenlignet med kommercielt tilgængelige sæt (f.eks. Glutamin og Glutamat Determination Kit), er denne metode meget mere følsom, hurtigere og mindre arbejdskrævende16,17,25. I vores protokol evaluerer vi optagelsen i Krebs Ringers HEPES-buffer. Vi bruger dette medie, da det er en basal formel, der giver mulighed for hurtige og nemme ændringer for at teste en bred vifte af betingelser for at karakterisere aminosyreoptagelse. For eksempel for at teste, om transportsystemet er Na + afhængigt, kan vi simpelthen erstatte NaCl med cholinchlorid for at gøre Na + fri KRH. Denne fleksibilitet er fordelagtig til at undersøge de forskellige transportsystemer, der formidler optagelsen af individuelle aminosyrer. Basalvækstmedier som alfa-MEM er også passende til dette assay. I dette tilfælde køber vi typisk alfa-MEM, der mangler den pågældende individuelle aminosyre, som erstattes med den radioaktivt mærkede aminosyre til eksperimentet. For eksempel bruger vi glutaminfri alfa-MEM i primære knoglemarvsstromale celler 15 til evaluering af glutaminoptagelse15. KRH har nogle begrænsninger på grund af sin enkle sammensætning. KRH er ikke en ideel mulighed, hvis målet er at studere sekundære aktive transportsystemer som symportere og antiportere. For eksempel forekommer leucinoptagelse gennem Slc7a5 / Slc3a2 i bytte for glutamin. I dette tilfælde kan leucinoptagelsen undervurderes på grund af manglen på glutamin i KRH; Snarere ville brugen af leucinfrit alfa-MEM-medium være at foretrække i dette tilfælde. Det er også vigtigt at bemærke, at brugen af en geigertæller ikke er obligatorisk, når man arbejder med isotop 3H. Det tilrådes dog at holde Geiger-tælleren tændt som en høflighed for at advare folk om, at du arbejder med stråling.
En kritisk og obligatorisk kontrol for den anden protokol er kogning af den kontralaterale knogle. Dette er nødvendigt, da knoglematrixen kan absorbere radioaktive aminosyrer uafhængigt af lettere transport af knogleceller. Ved at decellularisere knoglen kan vi estimere mængden af stråling fanget af knoglematrix og bruge den som basisradioaktivitet for at normalisere optagelsen. En anden vigtig kontrol er at veje knoglerne efter fjernelse af epifyser og marv. Vægten af knoglen bruges til at normalisere optagelsen i forhold til knogleakslens størrelse. Dette er vigtigt, da størrelsen af knoglerne kan variere på grund af mange faktorer lige fra variabilitet under fjernelse af epifyserne til genetiske mutationer, der påvirker væksten. En alternativ metode er at kvantificere DNA-indholdet i knogleskaftet til normalisering. Efter vores erfaring kan normalisering af DNA-indhold sammenlignes med knoglevægt, men tilføjer flere trin, der beskæftiger sig med radioaktive materialer. Således foretrækker vi at normalisere til knoglevægt.
Disse protokoller kan tilpasses cellelinjer, herunder ATDC5, MC3T3, 293 eller andre primære celler såsom calvarial osteoblaster, chondrocytter, knoglemarv stromale celler, knoglemarv makrofager og osteoklaster. Derudover kan protokollerne let tilpasses til at evaluere andre radioaktive isotoper (f.eks. 14C og 35S) samt forskellige næringsstoffer, herunder aminosyrer, glucose og fedtsyrer. Desuden kan protokol II også tilpasses voksne knogler og pillekulturer under hensyntagen til justering af inkubationstiden. Selvom denne protokol er meget tilpasningsdygtig, er det vigtigt at karakterisere kinetikken af de nye isotopmærkede molekyler eller i nye cellelinjer, før der udføres eksperimenter. Transportkinetikken kan variere drastisk mellem forskellige molekyler, forskellige isotoper eller forskellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen afsløringer.
Acknowledgments
Karner-laboratoriet er støttet af National Institute of Health R01-tilskud (AR076325 og AR071967) til C.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
