Realtids, tofarvet stimuleret Raman-spredningsbilleddannelse af musehjerne til vævsdiagnose

Summary

Stimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi er en kraftfuld, ikke-destruktiv og etiketfri billeddannelsesteknik. En ny applikation er stimuleret Raman histologi, hvor tofarvet SRS-billeddannelse ved protein- og lipid Raman-overgangene bruges til at generere pseudo-hæmatoxylin- og eosinbilleder. Her demonstrerer vi en protokol til realtids, tofarvet SRS-billeddannelse til vævsdiagnose.

Abstract

Stimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi har vist sig som en kraftfuld optisk billeddannelsesteknik til vævsdiagnose. I de senere år har tofarvet SRS vist sig at være i stand til at levere hæmatoxylin og eosin (H & E) -ækvivalente billeder, der muliggør hurtig og pålidelig diagnose af hjernekræft. En sådan kapacitet har muliggjort spændende intraoperative kræftdiagnoseapplikationer. Tofarvet SRS-billeddannelse af væv kan udføres med enten en picosekund eller femtosekund laserkilde. Femtosekundlasere har den fordel, at de muliggør fleksible billedbehandlingstilstande, herunder hurtig hyperspektral billeddannelse og tofarvet SRS-billeddannelse i realtid. En spektralfokuserende tilgang med kvidrede laserimpulser bruges typisk med femtosekundlasere for at opnå høj spektralopløsning.

Tofarvet SRS-erhvervelse kan realiseres med ortogonal modulering og lock-in-detektion. Kompleksiteten af pulskvidren, modulering og karakterisering er en flaskehals for den udbredte vedtagelse af denne metode. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til at demonstrere implementeringen og optimeringen af spektralfokuserende SRS og tofarvet billeddannelse i realtid af musehjernevæv i epi-tilstand. Denne protokol kan bruges til en bred vifte af SRS-billedbehandlingsapplikationer, der udnytter SRS's højhastigheds- og spektroskopiske billeddannelseskapacitet.

Introduction

Traditionel vævsdiagnostik er afhængig af farvningsprotokoller efterfulgt af undersøgelse under et optisk mikroskop. En almindelig farvningsmetode, der anvendes af patologer, er H & E-farvning: hæmatoxylin pletter cellekerner en purpurblå, og eosin pletter den ekstracellulære matrix og cytoplasma pink. Denne enkle farvning forbliver guldstandarden i patologi for mange vævsdiagnoser opgaver, især kræftdiagnose. H&E-histopatologien, især den frosne sektioneringsteknik, der anvendes i intraoperative omgivelser, har dog stadig begrænsninger. Farvningsproceduren er en besværlig proces, der involverer vævsindlejring, sektionering, fiksering og farvning¹. Den typiske ekspeditionstid er 20 min eller længere. Udførelse af H&E under frossen sektionering kan nogle gange blive mere udfordrende, når flere sektioner behandles på én gang på grund af behovet for at evaluere cellulære funktioner eller vækstmønstre i 3D til marginvurdering. Desuden kræver intraoperative histologiske teknikker dygtige teknikere og klinikere. Begrænsning i antallet af bestyrelsescertificerede patologer på mange hospitaler er i mange tilfælde en begrænsning for intraoperativ konsultation. Sådanne begrænsninger kan afhjælpes med de hurtigt udviklende interesser i digital patologi og kunstig intelligensbaseret diagnose². H&E-farvningsresultaterne varierer imidlertid afhængigt af teknikerens erfaring, hvilket giver yderligere udfordringer for computerbaseret diagnose².

Disse udfordringer kan potentielt løses med etiketfri optiske billeddannelsesteknikker. En sådan teknik er SRS-mikroskopi. SRS bruger synkroniserede pulserende lasere - pumpe og Stokes - til at ophidse molekylære vibrationer med høj effektivitet³. Nylige rapporter har vist, at SRS-billeddannelse af proteiner og lipider kan generere H & E-ækvivalente billeder (også kendt som stimuleret Raman-histologi eller SRH) med intakt frisk væv, som omgår behovet for enhver vævsbehandling, forkorter den tid, der er nødvendig til diagnose, betydeligt og er blevet tilpasset intraoperativt⁴. Desuden kan SRS-billeddannelse give 3D-billeder, som giver yderligere oplysninger til diagnose, når 2D-billeder er utilstrækkelige⁵. SRH er upartisk og genererer digitale billeder, der er let tilgængelige til computerbaseret diagnose. Det viser sig hurtigt som en mulig løsning til intraoperativ kræftdiagnose og tumormargenanalyse, især i hjernekræft ^6,7,8. For nylig er SRS-billeddannelse af kemiske ændringer i væv også blevet foreslået for at give nyttige diagnostiske oplysninger, der yderligere kan hjælpe klinikere med at stratificere forskellige kræfttyper eller stadier⁹.

På trods af sit enorme potentiale inden for vævsdiagnoseapplikationer er SRS-billeddannelse for det meste begrænset til akademiske laboratorier specialiseret i optik på grund af kompleksiteten forbundet med billeddannelsesplatformen, som omfatter ultrahurtige lasere, laserscanningsmikroskopet og sofistikeret detektionselektronik. Denne protokol giver en detaljeret arbejdsgang for at demonstrere brugen af en fælles femtosekundlaserkilde til realtids, tofarvet SRS-billeddannelse og generering af pseudo-H & E-billeder fra musehjernevæv. Protokollen vil omfatte følgende procedurer:

Justering og kvidren optimering
De fleste SRS-billeddannelsesordninger bruger enten picosekund- eller femtosekundlasere som excitationskilde. Med femtosekundlasere er laserens båndbredde meget større end Raman-linjebredden. For at overvinde denne begrænsning bruges en spektralfokuseringsmetode til at kvidre femtosekundlaserne til en picosekundtidsskala for at opnå smal spektralopløsning¹⁰. Optimal spektralopløsning opnås kun, når den tidsmæssige kvidren (også kendt som gruppens forsinkelsesspredning eller bare spredning) er korrekt matchet for pumpen og Stokes-laserne. Justeringsproceduren og de trin, der er nødvendige for at optimere spredningen af laserstrålerne ved hjælp af stærkt dispergerende glasstænger, demonstreres her.

Kalibrering af frekvens
En fordel ved spektralfokuserende SRS er, at Raman-excitationen hurtigt kan indstilles ved at ændre tidsforsinkelsen mellem pumpen og Stokes-laserne. En sådan tuning giver hurtig billeddannelse og pålidelig spektral erhvervelse sammenlignet med tuning laser bølgelængder. Det lineære forhold mellem excitationsfrekvens og tidsforsinkelse kræver imidlertid ekstern kalibrering. Organiske opløsningsmidler med kendte Raman-toppe bruges til at kalibrere Raman-frekvensen til spektralfokusering af SRS.

Tofarvet billeddannelse i realtid
Det er vigtigt at øge billeddannelseshastigheden i vævsdiagnoseapplikationer for at forkorte den tid, der er nødvendig til analyse af store vævsprøver. Samtidig tofarvet SRS-billeddannelse af lipider og proteiner undgår behovet for at indstille laseren eller tidsforsinkelsen, hvilket øger billeddannelseshastigheden med mere end to gange. Dette opnås ved hjælp af en ny ortogonal moduleringsteknik og dobbeltkanals demodulation med en fastlåsningsforstærker¹¹. Dette papir beskriver protokollen for ortogonal modulering og dual-channel billedoptagelse.

Epi-mode SRS-billeddannelse
Størstedelen af SRS-billeddannelse, der er vist til dato, udføres i transmissionstilstand. Epi-mode imaging registrerer backscattered fotoner fra væv¹². Til patologiske anvendelser kan kirurgiske prøver være ret store. Til transmissionstilstandsbilleddannelse er vævssektionering ofte nødvendig, hvilket uønsket kræver ekstra tid. I modsætning hertil kan epi-mode billeddannelse arbejde med intakte kirurgiske prøver. Fordi det samme mål bruges til at indsamle backscattered lys, er der heller ikke behov for at justere en høj numerisk blændekondensator, der kræves til transmissionsbilleddannelse. Epi-mode er også den eneste mulighed, når vævssektionering er vanskelig, såsom med knogle. Tidligere har vi vist, at for hjernevæv tilbyder epi-mode imaging overlegen billeddannelseskvalitet for vævstykkelse > 2 mm¹³. Denne protokol bruger en polariserende strålesplitter (PBS) til at indsamle spredte fotoner depolariseret af væv. Det er muligt at indsamle flere fotoner med en ringformet detektor på bekostning af kompleksiteten af tilpasset detektorsamling¹². PBS-tilgangen er enklere at implementere (svarende til fluorescens), idet standardfotodioden allerede bruges til transmissionstilstandsdetektion.

Pseudo-H&E-billedgenerering
Når SRS-billeder i to farver er indsamlet, kan de farves igen for at simulere H&E-farvning. Dette papir demonstrerer proceduren for konvertering af lipid- og protein SRS-billeder til pseudo-H & E SRS-billeder til patologiske applikationer. Den eksperimentelle protokol beskriver kritiske trin, der er nødvendige for at generere SRS-billeder i høj kvalitet. Proceduren vist her gælder ikke kun for vævsdiagnose, men kan også tilpasses til mange andre hyperspektrale SRS-billeddannelsesapplikationer såsom lægemiddelbilleddannelse og metabolisk billeddannelse^14,15.

Generelle systemkrav
Lasersystemet til denne protokol skal kunne udsende 2 synkroniserede femtosekundlaserstråler. Systemer har ideelt set en optisk parametrisk oscillator (OPO) til bred bølgelængdeindstilling af en af laserstrålerne. Opsætningen i denne protokol bruger et kommercielt lasersystem Insight DS+, der udsender to lasere (en fast stråle ved 1.040 nm og en OPO-baseret tunbar stråle, der spænder fra 680 til 1.300 nm) med en gentagelseshastighed på 80 MHz. Laserscanningsmikroskoper, enten fra større mikroskopproducenter eller hjemmebyggede, kan bruges til SRS-billeddannelse. Det anvendte mikroskop er et opretstående laserscanningsmikroskop bygget oven på en kommerciel opretstående mikroskopramme. Et par 5 mm galvo spejle bruges til at scanne laserstrålen. For brugere, der vælger at vedtage et hjemmebygget laserscanningsmikroskop, henvises til en tidligere offentliggjort protokol til konstruktion af et laserscanningsmikroskop¹⁶.

Protocol

Alle forsøgsdyreforsøg blev udført med 200 μm, faste, sektionerede musehjerner i overensstemmelse med protokollen (# 4395-01) godkendt af Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Washington. Vildtypemus (C57BL/6J-stamme) aflives med CO₂. Derefter udføres en kraniotomi for at ekstrahere deres hjerner til fiksering i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvand. Hjernerne er indlejret i en 3% agarose og 0,3% gelatineblanding og opdelt i 200 μm tykke skiver af et vibratom.

1. Indledende justering

BEMÆRK: Sørg for, at strålestørrelsen og divergensen på begge arme er matchet for at få den bedste følsomhed og opløsning. Kollimate pumpen og Stokes-strålerne, og juster deres størrelser, før de kommer ind i laserscanningsmikroskopet. For at gøre dette skal du bruge et par achromatiske linser til hver stråle, før du kombinerer dem på det dikroiske spejl. Brug altid korrekte laserbriller til strålejustering.

1. Stråle kollimation
   1. Installer et par achromatiske linser til pumpestrålen. Som udgangspunkt skal du bruge et 100 mm objektiv og et 200 mm objektiv til at forstørre laserstrålestørrelsen med 2 gange. Sørg for, at afstanden mellem de to objektiver er ca. 300 mm. Juster pumpestrålen gennem midten af begge linser.
   2. Placer et spejl efter det andet objektiv for at sende strålen mod en væg (>1 m væk). Pas på, når du sender strålen over lange afstande. Spor strålen fra spejlet til væggen med et IR-kort, og kontroller, om strålen ændres i størrelse. Kollimate strålen, hvis strålen ændres i størrelse som en funktion af afstanden.
      1. Hvis strålen konvergerer (faldende størrelse med udbredelse), skal du flytte de to linser tættere.
      2. Hvis strålen er divergerende (øger størrelsen med udbredelsen), skal du flytte de to linser længere fra hinanden. Juster afstanden, indtil strålen er kollimeret.
   3. Gentag trin 1.1.1 og 1.1.2 for Stokes-strålen for at samle strålen.
2. Justering af strålestørrelse
   1. Hvis der findes en stråleprofil, måles den kollimerede strålestørrelse for hver bjælke. Alternativt kan du estimere strålestørrelsen ved hjælp af IR-kortet og en lineal for at opnå en strålediameter på 4-5 mm.
   2. Hvis strålestørrelsen er for lille eller for stor, skal du ændre det objektivpar, der blev brugt i trin 1.1. Juster objektivparret, indtil begge bjælker har en diameter på 4-5 mm.
      BEMÆRK: Strålens forstørrelse er forholdet mellem brændvidden for det andet objektiv og det første objektiv (f₂/f₁).
3. Rumlig overlapning
   BEMÆRK: SRS-billeddannelse kræver, at både laserstråler kombineres i rum og tid for at ophidse molekylære vibrationer. Et skema over den spektralfokuserede SRS-billeddannelse er vist i figur 1.
   1. Kombiner de to laserstråler ved at installere et dikroisk spejl med flere ratspejle til justering. Optimer rumlig overlapning af pumpen og Stokes ved at overvåge bjælker efter det dikroiske spejl på to forskellige positioner langt fra hinanden (~ 1 m). Justerativt styrespejlet før det dikroiske og det dikroiske spejl for at justere Stokes-strålen med pumpestrålen.
      BEMÆRK: Hvis de to bjælker rumligt overlapper hinanden i begge positioner, overlappes de tilstrækkeligt.
   2. Sørg for, at de kombinerede stråler sendes til midten af laserscanningsmikroskopets scanningsspejle ved at justere et par ratspejle, når scanningsspejlene er i parkeret position. Sørg for, at begge bjælker bevæger sig gennem midten af mikroskopmålet og kondensatoren.
   3. Efter kondensatoren skal du bruge et andet par linser med brændvidder på henholdsvis 100 mm og 30 mm til at videresende den transmitterede stråle til fotodioden. Sørg for, at begge bjælker er indeholdt i fotodioden, og installer to lavpasfiltre for at blokere den modulerede Stokes-stråle.

2. SRS-signaldetektion

1. Elektrooptisk modulering (EOM)
   BEMÆRK: EOM på 20 MHz bruges til at modulere Stokes-amplituden. Som diskuteret senere er EOM afledt af 80 MHz laserpulstoget, som er nødvendigt for ortogonal modulering. Andre moduleringsfrekvenser kan bruges, hvis der kun udføres enkeltfarvet eller hyperspektral SRS. I så fald er synkronisering af moduleringsfrekvens til laserfrekvens unødvendig. En frekvensgenerator med en RF-effektforstærker kan bruges til at drive EOM' . Som et resultat kan trin 2.1.1-2.1.4 springes over.
   1. Placer en stråleprøveudtager i Stokes-strålebanen for at opfange 10% af strålen og sende den til en hurtig fotodiode for at detektere 80 MHz-pulstoget.
      BEMÆRK: Fotodiodesignalet sendes til en frekvensdeler for at generere en 20 MHz TTL-udgang. Denne udgang sendes yderligere til en fanoutbuffer for at replikere output til fire identiske 20 MHz-udgange. En af udgangene bruges til at udløse oscilloskopet.
   2. Tag en af udgangene fra fanoutbufferen, og filtrer den med et båndpasfilter for at få en 20 MHz sinusformet bølge. Brug en RF-dæmper til at justere udgangsspids-til-spidsspændingen til ~ 500 mV.
   3. Send det resulterende output til en faseskifter, som muliggør finjustering af RF-fasen med en spændingskilde. Send denne udgang til en RF-effektforstærker, og tilslut forstærkerens udgang til EOM'en.
   4. Fjern blokeringen af Stokes-strålen, og optimer EOM1's moduleringsdybde ved at placere en fotodiode i strålebanen. Juster EOM-spændingen og kvartbølgepladen, indtil moduleringsdybden (forholdet mellem dal og top) ser ud til at være tilfredsstillende.
      BEMÆRK: Ved 20 MHz modulering (1/4 af lasergentagelseshastigheden) forventes to impulser hver 50 ns.
2. Tidsmæssig overlapning
   BEMÆRK: Tidsmæssig overlapning af pumpen og Stokes opnås ved at forsinke et af de to laserpulstog med en refleksor monteret på et forsinkelsestrin (figur 1 viser, at Stokes bliver forsinket). Grov overlapning overvåges med oscilloskopet, og fin overlapning overvåges af SRS-signalet. Fin tidsmæssig overlapning kan også opnås med en autokorrelator, hvis den er tilgængelig.
   1. Placer en fotodiode efter det dikroiske spejl for at detektere laserstrålen. Bloker Stokes-bjælken først. Zoom ind på en af pumpens pulstoppe på oscilloskopet. Placer en lodret markør for at markere den tidsmæssige position af denne top med oscilloskopet.
   2. Bloker pumpestrålen, og fjern blokeringen af Stokes-strålen. Oversæt forsinkelsestrinnet, så det midlertidigt matcher toppositionen på oscilloskopet med den markerede position i det foregående trin. Se figur 2 for en visning af den tidsmæssige overlapning af to bjælker.
      1. (VALGFRIT) Hvis oversættelsen af forsinkelsestrinnet ikke er tilstrækkeligt til midlertidigt at matche de to bjælker, skal du flytte forsinkelsestrinnet til midten af dets bevægelsesområde.
      2. Beregn den forsinkelsesafstand, der kræves for at matche de to stråler, ved at tage den tidsmæssige forskel mellem de to stråler og gange forskellen med lysets hastighed for at finde den mængde afstand, der er nødvendig for at matche de to stråler tidsmæssigt.
      3. Forlæng strålebanen for den hurtigere stråle, eller forkort den langsommere stråles strålebane for nogenlunde at matche den tidsmæssige forsinkelse i overensstemmelse hermed.
   3. Forbered en mikroskopdiasprøve med DMSO og dobbeltsidet tape som afstandsopdelte for at holde prøven mellem diaset og et dækslip.
   4. Placer prøven på mikroskopet med dækslipsiden vendt mod mikroskopets mål. Skift mikroskopet til lysfeltbelysning og observer prøven fra okularet. Find prøvens fokus ved først at finde fokus på både det øverste og nederste lag af luftbobler ved glasbåndgrænsefladen, og flyt derefter fokus til at være mellem de to lag tape.
      BEMÆRK: Sørg for, at laserstrålerne er blokeret, før du kigger ind i okularet.
   5. Indstil den indstillelige stråleudgang til 798 nm. Baseret på kondensatorens optiske gennemstrømning skal du justere den optiske effekt til at være ~ 40 mW hver for pumpen og Stokes-strålerne ved det objektive fokus.
   6. Åbn ScanImage i MATLAB (eller anden scanningssoftware, der styrer mikroskopet), og klik på knappen mærket FOCUS for at starte scanningen.
      BEMÆRK: Laserstrålerne vil blive rasterscannet gennem prøven for at generere et billede. Den lavfrekvente signaludgang fra fotodioden (<100 kHz) sendes direkte ind i kanal 1 på dataindsamlingskortet (kaldet DC-kanalen). Den højfrekvente udgang (>100 kHz) fra fotodioden sendes ind i lock-in-forstærkeren, og X-udgangen fra lock-in-forstærkersignalet sendes ind i kanal 2 på dataindsamlingskortet (kaldet AC-kanalen).
   7. Juster styrespejlet før galvo-scanneren for at centrere DC-signalet på kanal 1-displayet. Flyt det motoriserede forsinkelsestrin, og overhold nøje den fastlåsningsudgang, der vises på kanal 2-displayet (dvs. VEKselstrømskanalen).
      BEMÆRK: Når pumpen og Stokes falder sammen i tide, vises et signal på vekselstrømskanalen. Det er nyttigt at justere vekselstrømskanalens farveskala for at få vist den lille intensitetsændring.
   8. Maksimer AC-signalintensiteten ved at finjustere tidsforsinkelsen. Juster det dikroiske spejl for at centrere SRS-signalet på vekselstrømskanalen (mens DC-kanalen holdes centreret). Juster fasen af indlåsningsforstærkeren for at maksimere signalet. Se figur 3 for et tilfredsstillende signal.

3. Optimering af spektralopløsning

BEMÆRK: Pumpen og Stokes-strålerne, der når prøven, skal have samme mængde gruppeforsinkelsesspredning (GDD) for at maksimere spektralopløsningen. Spredningen afhænger i høj grad af forsøgsopstillingen. Den eksperimentelle opsætning, der er beskrevet her, anvender femtosekundimpulser ved 1.040 nm og 800 nm som henholdsvis Stokes og pumpe. Tætte flintglasstænger (H-ZF52A) anvendes som pulsstrækningsmedium.

1. Indsæt 48 cm af en stærkt dispergerende glasstang (H-ZF52A eller tilsvarende tæt flintglas) i bjælkebanen på 800 nm. Anslå GDD ved hjælp af Eq (1):
   (1)
   BEMÆRK: GVD af forskellige glasmaterialer ved forskellige bølgelængder kan findes fra brydningsindeksdatabaseressourcen. For eksempel har H-ZF52A en GVD på 220,40 fs²/mm ved 800 nm. Det samlede GDD er 105792 fs².
2. Beregn, hvor mange cm af den dispergerende glasstang der kræves for at tilføje til 1.040 nm strålebanen for at matche pumpens GDD. Indsæt den passende længde af dispergerende glasstænger i 1.040 nm strålebanen for omtrent at matche GDD for 800 nm strålen. Bemærk, at tilsætningen af glasstænger vil ændre den tidsmæssige overlapning af de to bjælker, og justering af forsinkelse kan være nødvendig.
3. Kalibrering af spektralopløsning
   1. Lav en mikroskop diasprøve med DMSO. Placer diaset på mikroskopet, og kontroller effekten af strålerne, der kommer ud af mikroskopkondensatoren. Juster effekten i overensstemmelse hermed for at have ~ 40 mW hver ved prøvefokus.
   2. Åbn ScanImage fra MATLAB. Find det maksimale SRS-signal ved at scanne gennem forsinkelsestrinnet, hvilket svarer til DMSO's ^{2.913 cm-1 Raman-top} . Anslå trinpositionen baseret på den foregående trinposition med den øgede optiske stilængde på grund af indsættelse af stænger. Justering af strålens rumlige overlapning på grund af strålens lille afvigelse, når der tilføjes glasstænger.
   3. Gem en hyperspektral SRS-scanning ved sekventielt at tage en række SRS-billeder, mens du flytter det motoriserede trin.
      BEMÆRK: Forsinkelsesscanningsområdet dækker to Raman-toppe, svarende til henholdsvis ^{2.913 cm-1} og 2.994 ^cm-1 Raman-toppe i DMSO. Disse to overgange observeres, når man bruger en 800 nm pumpe og 1.040 nm Stokes laser.
   4. Plot SRS-spektrene i DMSO-løsningen ved hjælp af enten ImageJ eller MATLAB. Tilpas den store DMSO 2.913 ^cm-1 top til en gaussisk eller lorentzisk funktion i MATLAB for at beregne toppens fulde bredde ved halv maksimum (FWHM).
      BEMÆRK: Repræsentative resultater er vist i figur 4. Hvis der kun er en bred top til stede, betyder det, at spektralopløsningen enten er for dårlig til at skelne mellem de to toppe, og der kræves flere glasstænger, eller at det scannede område var for lille til at detektere den anden top. Typisk er en acceptabel spektralopløsning DMSO ~ 20-25 ^cm-1 , når der anvendes glasstænger længde på >60 cm. En lavere opløsning bruges ofte til vævsbilleddannelse til handel med højere signaler med kortere impulser¹⁷.
4. (VALGFRIT) Brug en autokorrelator eller en FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) til at bestemme pulsvarigheden for hver arm for at beregne nøjagtigt mængden af GDD og længden af stænger, der er nødvendige for at matche GDD mellem pumpen og Stokes.
5. Gentag trin 3.3.2-3.3.4 for forskellige stængers længder på Stokes-strålen for at finde den optimale spektralopløsning, hvilket betyder, at det bedste GDD-match er fundet eksperimentelt. Brug flere sæt glasstænger, der varierer i længden for at opnå optimal spektralopløsning.

4. Signal til støj (SNR) karakterisering

1. Sørg for, at trin 4.2 udføres efter fuldstændig rumlig og tidsmæssig justering.
2. Få et SRS-billede svarende til 2.913 ^{cm-1 Raman-toppen} af DMSO. Åbn billedet i ImageJ, og vælg et lille område i midten af rammen. Brug målefunktionen til at beregne gennemsnits- og standardafvigelsen for værdier i det valgte område.
3. Divider middelværdien af det valgte område med standardafvigelsen for at finde SNR-værdien, som i Eq (2).
   (2)
   BEMÆRK: En god SNR til systemet (med en fastlåsningstid på 4 μs) ved hjælp af DMSO ved 40 mw/40 mw i fokus for begge arme er >800. Lavere koncentrationer af DMSO eller lavere effekt kan bruges til en mere nøjagtig estimering af SNR, hvis dataindsamlingskortet har en begrænset bitdybde.
4. Hvis SNR'en er for lav, skal du justere laserpulserne for at optimere rumlig overlapning, tidsmæssig overlapning, strålestørrelse/kollimationsmatchning og/eller dispersionsmatchning. For et mål med en aberrationskorrektionskrave skal du optimere signalet ved at justere korrektionskraven.

5. Kalibrering af frekvensakse

BEMÆRK: Dette trin udføres for at relatere forsinkelsestrinspositionen til den scannede Raman-overgang. Omhyggeligt valg af opløsningsmidler er påkrævet for at generere en passende "Raman Lineal". DMSO er et effektivt opløsningsmiddel til CH-bindinger, da det har to skarpe Raman-toppe på 2.913 ^cm-1 og 2.994 ^cm-1.

1. Gem en hyperspektral scanning med forsinkelsestrinsområdet, der dækker ^{DMSO's 2.913 cm-1} og 2.994 ^{cm-1 Raman-toppe} . Gem de fasepositioner, der svarer til det hyperspektrale datasæt.
   BEMÆRK: Den globale maksimale top af spektret svarer til DMSO 2.913 ^{cm-1 Raman-skiftet} , og den anden maksimale top svarer til DMSO 2.994 ^{cm-1 Raman-skiftet} .
2. Udfør lineær regression for scenepositionerne, og Raman skifter ved 2.913 ^cm-1 og 2.994 ^cm-1. Ved hjælp af den lineære regressionsligning, der relaterer scenepositionen til Raman-skiftet, skal du konvertere forsinkelsespositionerne til de tilsvarende Raman-frekvenser.

6. Ortogonal modulering og tofarvet billeddannelse

BEMÆRK: Det ortogonale moduleringstrin er kun nødvendigt, når der er behov for tofarvet billeddannelse i realtid. En skematisk oversigt over denne ordning er vist i figur 5. Den ortogonale modulering bruger et par EOM'er, der drives med en fjerdedel af laserfrekvensen (20 MHz for 80 MHz laser) med et 90 ° faseskift mellem de to. Dette ortogonale moduleringstrin kan springes over til enkeltfarvet SRS-billeddannelse eller hyperspektral SRS-billeddannelse.

1. EOM1-modulering
   1. Installer en PBS (PBS2), en kvartbølgeplade (QWP2) og en anden EOM (EOM2) i Stokes-strålebanen efter den første EOM. Tag stikket til EOM2 ud af stikket. Tilslut signalindgangen til EOM1, og tænd den.
   2. Moduler Stokes-strålen (fastgjort til 1.040 nm) ved 20 MHz (f₀/4) ved at sende strålen gennem den første EOM. Juster hældningen og positionen af EOM1 for at sikre, at strålen rammer lige og centreret gennem EOM-krystallen.
   3. Overvåg moduleringsdybden ved at observere begge polarisationer, der kommer ud af PBS1 med to fotodioder og vise moduleringen på et oscilloskop.
   4. Juster QWP1-, EOM1-spændingen og fasen på 20 MHz-indgangen (ved hjælp af en faseskifter) for at optimere moduleringsdybden for den transmitterede stråle til at være tæt på 100%. Se figur 2B for en illustration af god moduleringsdybde.
2. EOM2-modulering
   1. Tag stikket ud af stikket på EOM1, og tilslut EOM2.
   2. Send højspændingsudgangen fra den anden forstærker ved 20 MHz til EOM2. Juster hældningen og positionen af EOM2 for at sikre, at strålen rammer lige og centreret gennem EOM-krystallen.
   3. Endnu en gang skal du overvåge moduleringsdybden ved at se på begge polarisationer, der kommer ud af PBS2 med et oscilloskop. Juster QWP2, EOM2-spændingen og faseskifteren efter behov for at opnå tæt på 100% modulering for begge polarisationer.
   4. Sørg for, at pulstogsmodulationen har et faseskift på 90° fra den første modulering.
      BEMÆRK: Hvis de to pumpepulstog ikke er 90° ortogonale, vil krydstale mellem de to kanaler være et problem.
   5. Test moduleringens ortogonalitet ved at tænde og tilslutte både EOM1 og EOM2. Overvåg begge polarisationer, der opdeles af PBS2 med et oscilloskop. Reoptimer EOM1 og EOM2 individuelt, hvis pulstoget efter den anden PBS ikke ligner figur 2C.
   6. Installer en 20 mm birefringent kvartskrystal (BRC) og HWP nedstrøms for EOM2. Tilslut begge EOMER på én gang, og overvåg pulstoget, så det ligner figur 2D.
      BEMÆRK: For den chirp, der anvendes i dette eksperiment, inducerer 20 mm BRC en tidsforsinkelse, der svarer til et 80 ^{cm-1 Raman-skift} . En anden BRC-længde kan være nødvendig, hvis der anvendes en anden chirp.
3. Kalibrering
   1. Kalibrer systemet ved hjælp af DMSO ved at registrere signaler fra fastlåsningsforstærkeren X- og Y-kanaludgang (sendt til kanal 2 og 3 på dataindsamlingskortet).
   2. Kontroller, om de signaler, der genereres af 2.913 ^cm-1-toppen fra den hurtigere polarisering, og som fra den langsommere polarisering er tæt på 90 ° ude af fase på lock-in-forstærkeren. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du justere EOM-justeringen, indtil de to signaler er tæt på 90° ude af fase.
   3. Når kalibreringen er afsluttet, skal du finde den forsinkelsesposition, der sonder proteinovergangen ved 2.930 ^cm-1 for en af de ortogonale stråler. Sørg for, at de andre polarisationssonder lipidovergangen på 2.850 ^cm-1.

7. Epi-mode SRS-billeddannelse

BEMÆRK: I transmissionstilstandsbilleddannelsesskemaet fokuserer målet laseren ind i prøven, og derefter leder en kondensatorlinse den transmitterede stråle til en fotodiode til detektion af låsning. I epi-mode-billeddannelsesskemaet huskes lys, der er backscattered og depolariseret af prøven, af fokuseringsmålet og isoleres ved hjælp af en polariserende strålesplitter. De isolerede og backscattered fotoner sendes til en fotodiode gennem et par relælinser til lock-in detektion. Figur 6 viser epi-mode imaging skemaet.

1. Installer en HWP, før strålen kommer ind i mikroskopet for at ændre polariseringen af strålen, der går ind i mikroskopet. Placer en PBS over målet for at tillade den depolariserede tilbagereflekterede stråle at nå detektoren.
2. Brug et par linser bestående af et 75 mm achromatobjektiv og et 30 mm asfærisk objektiv til at videresende de backscattered fotoner fra målets bageste blænde til fotodetektoren. Monter detektoren for at opsamle det tilbagespredte lys, der styres af PBS. Installer et filter for at blokere den modulerede stråle fra at komme ind i detektoren.
3. Anbring vævsprøven under målet. Da kondensatoren er unødvendig til epi-mode billeddannelse, skal du fjerne den, hvis der kræves mere plads.
4. Imaging
   1. Bloker strålen med en lukker; skinne en hvid lyskilde på prøven fra siden; og brug brightfield til at finde objektivt fokus.
   2. Fjern blokeringen af begge stråler, og brug de prækalibrerede forsinkelsespositioner til at erhverve lipid- og proteins-SRS-billeder fra væv fra de to udgange fra lock-in-forstærkeren.
   3. Juster lock-in-forstærkningen og pixel bin-faktoren for at få billeder af god kvalitet.

8. Farvning af falsk farve

1. Åbn billedstakken med ImageJ.
2. Træk de to billeder ud, der svarer til lipid (2.850 ^cm-1) og protein (2.930 ^cm-1) arterne ved at højreklikke på billedet og klikke på Duplicate.
3. Omdøb lipidbilledet til lipider og proteinbilledet til proteiner.
4. Gå til Proces | Billedberegner og udfør proteiner trækker lipider fra.
5. Kombiner billederne ved at gå til Billede | Farve | Flet kanaler, indstilling af lipider til grøn og proteiner til blå. Åbn billedkanalerværktøjet (| Farve | Kanalværktøj) og juster lysstyrken og kontrasten (| Juster | Lysstyrke/kontrast).
6. Juster lysstyrken og kontrasten for hver kanal ved hjælp af kanalværktøjet . For lipidkanalen skal du justere kontrasten, indtil de cellulære funktioner ser mørke ud. For proteinkanalen skal du justere kontrasten, indtil de cellulære funktioner vises blå. Konverter det flettede kanalgrønne/blå billede til et RGB-billede ved at gå til Billede | Skriv | RGB-farve. Eksporter dette billede efter File | Gem som | Tiff.
   BEMÆRK: Ved falsk H & E-farvning viser farveskemaet lyserød cytoplasma, mens kernerne er mørkeblå-lilla.
7. Download HE.m MATLAB-scriptet fra den falske H&E-farvningsscriptressource i Table of Materials.
8. Kør HE.m-scriptet i MATLAB. Vælg det eksporterede RGB-billede fra det forrige trin for at generere et kunstigt H&E-farvet billede.
9. (VALGFRIT) Normaliser billedintensiteten for store synsfeltbilleder, fordi billedet ser mørkere ud i periferien end i midten.
   1. For at udføre feltnormalisering af billederne skal du gennemsnitligt have så mange billeder som muligt. Fjern derefter intensitetsfunktionerne med ImageJ (Process | Filtre | Gaussisk sløring | Radius=50).
   2. Mål den maksimale intensitet af det slørede billede (Ctrl + M). Del det slørede billede med den maksimale intensitet (Proces | Matematik | Opdel). Opdel det rå SRS-billede med det slørede billede (Process | Billede | Lommeregner).

Representative Results

Optimering af spektralopløsning:
Dispersion gennem et materiale påvirkes af det dispergerende medium (længde og materiale) og bølgelængde. Ændring af dispersionsstangens længde påvirker spektralopløsningen og signalstørrelsen. Det er et give-and-take-forhold, der kan vejes forskelligt afhængigt af applikationen. Stængerne strækker strålepulsen ud fra at være bred i frekvens og smal i tid til at være smal i frekvens og bred i tid. Figur 7 viser effekten af varierende stanglængder på spektralopløsningen. Figur 7A viser meget dårlig spektralopløsning; denne opsætning har ingen glaskviddestænger, og de to Raman toppe fra DMSO er slet ikke løst. I figur 7B,C begynder en stigning i antallet af glaskviddestænger at løse de to toppe. Endelig viser figur 7D, hvordan matchet kvidren løser begge toppe og kan bruges til at kalibrere scenepositioner til frekvens.

Kalibrering med DMSO:
DMSO har to skarpe Raman-toppe på 2.913 og 2.994 ^cm-1 , der er praktiske til kalibrering i C-H-regionen. Når et DMSO-spektrum er opnået fra en hyperspektral SRS-scanning, konverterer en simpel lineær regression scenepositionen til Raman-skiftet. Hvis spektralopløsningen er dårlig (som vist i figur 7A), og de to toppe ikke kan adskilles, er kalibrering med lineær regression umulig. I dette tilfælde er bedre dispersionsmatchning nødvendig ved enten at tilføje eller fjerne glasstænger. De mest almindelige vanskeligheder med at finde et DMSO-signal til kalibrering skyldes fejl i enten tidsmæssig overlapning eller rumlig overlapning af de to stråler. Før du forsøger DMSO-kalibrering, skal du gentage de rumlige og tidsmæssige justeringstrin for at optimere SRS-signalet.

Tofarvet DMSO:
I tofarvet SRS genereres to pumpepulstog med ortogonal polarisering med en fast tidsforsinkelse (på grund af en birefringent krystal). Evaluering af moduleringsdybde og 90° faseskift sker med en fotodiode efterfulgt af et DMSO SRS-signal. Figur 8 viser acceptabel moduleringsdybde og tidsmæssig adskillelse. Selvom spektralopløsningen af DMSO i figur 8 ikke er ideel, ofres den ofte i vævsbilleddannelseseksperimenter for at opnå et højere signal med kortere impulser. Figur 9 viser dårlige faseskift, der giver anledning til inverterede eller negative toppe.

Tofarvet SRS af musehjernevæv i epi-tilstand:
Epi-mode (detektering af backscattered fotoner) SRS bruges til billeddannelse af tykt væv (>1 mm). Figur 10A,B viser tofarvet SRS-billeddannelse i realtid ved 2.850 ^cm-1 og 2.930 ^cm-1 af ex vivo-musehjernevæv. De rå billeder fra lipid- og proteinkanalerne (figur 10A, B) blev farvekodet for at producere et enkelt billede, der viser lipid- og proteinbidrag (figur 10C). Falsk H & E-farvning blev udført (figur 10D) på figur 10C for at efterligne H & E-farvning. Dårlig billedkvalitet kan være et resultat af stor billeddybde eller dårlig kalibrering (frekvensakse eller moduleringsdybde). Den typiske billeddybde i hjernevæv er 100-200 μm¹³.

Figur 1: Skematisk opsætning af enfarvet SRS-billeddannelse. Konstruktion af et spektralfokuserende SRS-mikroskop i transmissionstilstand. X og Y repræsenterer de ortogonale udgange. Forkortelser: SRS = stimuleret Raman spredning; DL = retroreflektorbaseret forsinkelseslinje; Div = skillevæg; FB = fanout buffer; AT = dæmper; PS = faseskifter; PA = effektforstærker; DCM = dikroisk spejl; GM = galvo spejle; EOM = elektrooptisk modulator; POM = pick-off spejl; PBS = polariserende strålesplitter, BRC = birefringent krystal; QWP = kvartbølgeplade; HWP: halvbølgeplade; PD = fotodiode; GR = glasstang; BB = Stråleblok; SPF = kortpasfilter; CL = kollimerende linse; BS = strålestørrelse skiftende linse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Repræsentativ tidsmæssig overlapning. (A) Pumpen og Stokes-bjælkerne ses at være tidsmæssigt overlappende på oscilloskopet. Oscilloskopmarkører bruges til at markere pumpens og Stokes-bjælkernes tidsmæssige positioner. Denne overlapning er tilfredsstillende som udgangspunkt for yderligere at tilpasse den tidsmæssige overlapning med en forsinkelsesfase. B) Tilfredsstillende repræsentativ moduleringsdybde for en EOM ved 20 MHz. (C) Tilfredsstillende pulsmodulering, mens to EOM'er er i brug. (D) Tilfredsstillende pulstogsmodulering efter birefringent kvartskrystal og halvbølgepladeinstallation på den dobbeltmodulerede Stokes-arm. Forkortelse: EOM = elektrooptisk modulator. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Repræsentative SRS- og pumpesignaler. (A) Forkert justeret pumpesignal detekteret i DC-kanal. (B) Forkert justeret SRS-signal detekteret af fotodiode. (C) Tilfredsstillende, centreret pumpesignal i DC-kanalen. (D) Tilfredsstillende SRS-signal centreret på vekselstrømskanalen. Forkortelse: SRS = stimuleret Raman spredning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Karakterisering af spektralopløsning. En gaussisk funktion passede til 2.913 ^cm-1 Raman DMSO-toppen. FWHM beregnet gav en opløsning på 15 ^cm-1 for systemet. Forkortelser: DMSO = dimethylsulfoxid; FWHM = Fuld bredde ved halv maksimum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Skematisk opsætning af tofarvet SRS-billeddannelse. Konstruktion af et tofarvet SRS-mikroskop i transmissionstilstand. X og Y repræsenterer de ortogonale udgange. Forkortelser: DL = retroreflektorbaseret forsinkelseslinje; Div = skillevæg; FB = fanout buffer; AT = dæmper; PS = faseskifter; PA = effektforstærker; DCM = dikroisk spejl; GM = galvo spejle; EOM = elektrooptisk modulator; PBS = polariserende strålesplitter; BRC = birefringent krystal; QWP = kvartbølgeplade; HWP = halvbølgeplade; PD = fotodiode; GR = glasstang; BB = Beam Block, SPF = shortpass filter; CL = kollimerende linse; POM = pick-off spejl; BS = strålestørrelse skiftende linse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Skematisk opsætning af tofarvet SRS-billeddannelse i Epi-tilstand. Konstruktion af et tofarvet SRS-mikroskop i epi-tilstand. X og Y repræsenterer de ortogonale udgange. Forkortelser: DL = retroreflektorbaseret forsinkelseslinje; Div = skillevæg; FB = fanout buffer; AT = dæmper; PS = faseskifter; PA = effektforstærker; DCM = dikroisk spejl; GM = galvo spejle; EOM = elektrooptisk modulator; PBS = polariserende strålesplitter; BRC = birefringent krystal; QWP = kvartbølgeplade; HWP = halvbølgeplade; PD = fotodiode; GR = glasstang; BB = Beam Block, BPF = bandpass filter; CL = kollimerende linse; POM = pick-off spejl; BS = strålestørrelse skiftende linse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Optimering af spektralopløsning med 25% DMSO. (A) Nul glaskvidrende stænger blev brugt til at opnå DMSO-spektret. De to toppe er ikke løst. (B) Der blev brugt glaskviddestænger, 20 cm på pumpearmen og 24 cm på Stokes-armen. To toppe begynder at blive løst til et tilfredsstillende punkt. (C) Kvidringsstænger blev brugt, 40 cm lange pumper og 24 cm lange Stokes, for at opnå et bedre opløst DMSO-spektrum. (D) Kvidringsstænger blev brugt, 64 cm lange pumper og 60 cm lange Stokes, for at opnå højere spektralopløsning. Forkortelse: DMSO = dimethylsulfoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Tofarvet SRS, varierende polarisering og tidsforsinkelse. To tidsforsinkede pulstog med ortogonal polarisering (s & p) bruges til at afbilde DMSO-spektre for at vise tidsforsinkelsen (og Raman-frekvensforskellen) mellem SRS-excitationerne. Forkortelser: DMSO = dimethylsulfoxid; SRS = stimuleret Raman spredning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: SRS-spektrum som følge af et dårligt tofarvet SRS-faseskift. En negativ top på 2.994 ^cm-1 nær sceneposition 48 er tegn på dårlig faseforskel. Forkortelse: SRS = stimuleret Raman spredning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 10: Generering af falsk tofarvet H&E-farvning af SRS-billeder. (A) Råprotein SRS-billede fra et musehjernevæv ved overgangen på 2.930 ^cm-1 . (B) Rå lipid SRS-billede fra musehjernevæv ved overgangen på 2.850 ^cm-1 . C) Fusionerede og farvekodede kanaler fra A og B med lipidbidrag i grønt og proteinbidrag i blåt. (D) Falsk H & E-omfarvning blev udført på C for at efterligne H & E-farvning til patologiske anvendelser. Skalastang = 50 μm. Forkortelser: SRS = stimuleret Raman spredning; H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Det tofarvede SRS-billeddannelsesskema, der præsenteres i denne protokol, afhænger af korrekt implementering af enfarvet SRS-billeddannelse. I enfarvet SRS-billeddannelse er de kritiske trin rumlig justering, tidsmæssig justering, moduleringsdybde og faseskift. Rumlig kombination af de to bjælker opnås af et dikroisk spejl. Flere styrespejle bruges til finjustering, når bjælkerne sendes til det dikroiske spejl. Når bjælkerne er kombineret med det dikroiske spejl, kan rumlig justering bekræftes ved at plukke den kombinerede strålebane med et spejl, der skal sendes mod en væg >1 m væk, mens den kombinerede stråle kontrolleres for at se, om den overlapper med et IR-kort. Efter rumlig justering gennem mikroskopet udføres den tidsmæssige overlapning ved at justere stilængden med et retroreflektorbaseret forsinkelsestrin, som har den fordel, at rumlig justering bevares. Armen på 1.040 nm er den forsinkede stråle i denne protokol. Tidsmæssig overlapning er umulig, hvis forsinkelsestrinnet ikke har det interval, der får de to bjælker til at overlappe tidsmæssigt. I så fald kan det være nødvendigt at flytte hele forsinkelsesfasen til et andet sted for at sikre, at tidsmæssig overlapning er tæt på midten af forsinkelsesscanningsområdet. For eksempel, hvis den tidsmæssige forskel mellem de to bjælker måles som 6 ns, kræves der 1,8 m justering. Den krævede justering angiver længden af forlængelsen af strålebanen for den hurtigere stråle eller forkortelsen af strålebanen for den langsommere stråle.

Udover justering er strålestørrelsesmatchning og modulering af Stokes-strålen også vigtig for at maksimere SRS-signalet. Ideelt set bør begge bjælker kollimeres på målplanet og matche størrelsen på den objektive bagblænde. Det er nyttigt at kontrollere kollimation og strålestørrelse, hvis målplanet udsættes for brugeren. Hvis strålen konvergerer eller divergerer, er det nødvendigt at justere kollimationsobjektivparrets anden linse for at opnå kollimation (protokoltrin 1.1). Tilsvarende, hvis strålestørrelsen er for lille ved den objektive bagblænde, skal der anvendes et objektivpar med høj forstørrelse (protokoltrin 1.2). SRS skalerer lineært med modulationsdybden af Stokes-strålen. Det er vigtigt at sikre, at pulshøjden i dalen er <10% af pulshøjden på toppen på oscilloskopet. Dårlig modulering af Stokes-strålen oversættes direkte til dårlig SNR.

Når du bruger femtosekundlasere til SRS-billeddannelse, er spektralfokusering nødvendig for at konvertere tidsforsinkelsen mellem pumpe og Stokes til Raman-frekvensskift. Omregningsfaktoren afhænger af mængden af anvendt chirp. Det er afgørende at matche pumpens GDD og Stokes for at opnå optimal spektralopløsning. GDD kan estimeres ud fra længden af det anvendte dispersionsmateriale og dets GVD. For eksempel har SF11 tæt flintglasstang en GVD på 123.270 fs² /mm ved 1.040 nm og 187.486 fs² / mm ved 800 nm. For 240 mm SF11 i bjælkebanen 800 nm er GDD 240 mm × 187.486 fs²/mm = 45.000 fs². For 240 mm SF11 i bjælkebanen 1.040 nm er GDD 240 mm × 123.270 fs²/mm = 30.000 fs². Denne eksempelberegning betyder, at der skal tilføjes yderligere glasstænger til 1.040 nm armen, eller glasstænger skal fjernes fra 800 nm armen for at matche GDD. For at opnå højere spektralopløsning kræves en større GDD, hvilket betyder længere stænger. Ved beregningen af GDD er bidragene fra EOM og målsætningen imidlertid blevet forsømt. Den faktiske matchning af GDD bestemmes eksperimentelt ved at finde den bedste spektralopløsning for de givne stanglængder på pumpen eller Stokes. Beregningerne tjener som et godt begyndelsestrin. Eksperimentel optimering gennem iterativ tilsætning og fjernelse af glasstænger er stadig nødvendig for at optimere spektralopløsningen.

Det er vigtigt at indse, at en stor chirp giver højere spektral opløsning, men på bekostning af signalintensitet. Mindre chirps og kortere impulser er gavnlige for vævsbilleddannelse i C-H-regionen, fordi protein- og lipid Raman-toppe er brede. Lavere spektralopløsning kan handles til et højere SRS-signal (eller hurtigere billedhastighed) uden at ofre tofarvet vævskontrast¹⁷. I andre applikationer, hvor der er behov for høj spektralopløsning, især i fingeraftryksområdet, er det nødvendigt at anvende en større chirp ved hjælp af lange glasstænger. Alternativt kan det være lettere at bruge gitterbårer til at opnå længere impulser (for pulsvarighed længere end 3 ps). En hovedbegrænsning af den anvendte kommercielle laser er imidlertid dens spektrale båndbredde. Den spektrale dækning af spektralfokuserende SRS afhænger af båndbredden af excitationslaserne. Det anvendte lasersystem har en spektraldækning typisk omkring 200-250 ^cm-1. Dette er næppe tilstrækkeligt til at dække C-H-regionen. En større spektral dækning er typisk nødvendig for at løse kemiske arter til billeddannelse i fingeraftryksområdet. Dette problem kan løses med en fiberlaser-tilføjelse, der udvider båndbredden på Stokes-laseren fra 6 nm til 60 nm¹⁸. En anden vigtig begrænsning for den tofarvede SRS-billeddannelsesteknik er, at kun to overgange overvåges. Denne tilgang ville være uegnet til komplekse prøver med mange overlappende Raman toppe eller flere arter.

Den tofarvede SRS-billeddannelsesmetode i realtid giver højhastighedsvævsbilleddannelse ved at fjerne behovet for laser eller forsinkelsesindstilling. Det er dog vanskeligt at konfigurere på grund af udfordringerne med at opnå næsten perfekt moduleringsdybde for begge EOMER'er. Det er bedst at optimere EOM1 og EOM2 uafhængigt. Hvis EOM1 er slået til, skal EOM2 være frakoblet og omvendt. Når begge moduleringer er optimeret til næsten perfektion (>95% moduleringsdybde), er begge EOMER'er forbundet for at muliggøre ortogonal modulering. Længden af tidsforsinkelsen mellem de to ortogonale pulstog afhænger af BRC's længde og kvidren. Denne moduleringsmetode er ikke umiddelbart mulig til kliniske anvendelser, da kompleks elektronik er nødvendig for at give to RF-pulstog et justerbart faseskift til at drive de to EOMER'er. Justeringen af EOM skal også være næsten perfekt for at sikre høj transmission, god modulering og ortogonalitet mellem de to kanaler. Denne teknik er generelt anvendelig til andre applikationer, der kræver hurtig, samtidig billeddannelse af to Raman-toppe på grund af bevægelses- eller prøveændringer. Eksempler omfatter vandtemperaturmålinger eller sporing af bevægelige genstande såsom lipiddråber eller organeller ^11,19.

Der kræves en robust fiberlaser til fremtidige kliniske anvendelser⁴. Den tilgang, der er beskrevet i protokollen, kan også udvides for at forbedre anskaffelseshastigheden op til videohastigheden, hvilket er vigtigt for at scanne store vævsprøver inden for en rimelig tid. Hvis billeddannelsestid eller bevægelsesartefakter ikke er et problem, kan protein- og lipid SRS-billeder erhverves sekventielt ved at flytte det motoriserede forsinkelsestrin ramme for ramme. En anden tofarvet SRS-billeddannelsesmetode i realtid er et tofaset skema, der genbruger Stokes-strålen for at give de samme to ortogonale kanaler²⁰. Implementeringen af tofaseordningen kræver dog ekstra justering, der involverer tre bjælker. Det kræver også matchning af strålestørrelsen og divergensen af tre laserstråler. En potentiel vej til at forbedre begge teknikker til at overvinde den samtidige tofarvede grænse er inkorporeringen af en hurtigt justerbar fiberlaser til sonde specifikke spektrale regioner²¹. Behandlingen af billeder er den samme som beskrevet i protokollen til generering af simulerede H&E-billeder.

Endelig demonstrerer denne protokol epi-mode SRS-billeddannelse. Det genererer typisk billeder af lavere kvalitet sammenlignet med transmissionstilstandsbilleddannelse for tynde vævssektioner på grund af den lavere pumpeeffekt, der når detektoren¹³. Til billeddannelse af tykt væv (>1-2 mm) eller prøver, der er stærkt spredte (f.eks. Knoglevæv), kan epi-mode billeddannelse fungere bedre end transmissionstilstandsbilleddannelse. Ved billeddannelse af frisk væv såsom hjernevæv er SRS-billeddannelsesdybden typisk begrænset til 200-300 μm. For fast væv er spredningen stærkere, og billeddannelsesdybden er 100-200 μm. Dybere billeddannelse kan opnås med højere effekt, aberrationskorrektion eller optisk clearing^22,23. Ikke desto mindre er epi-mode billeddannelse en foretrukken tilgang til vævsdiagnose, fordi det ikke kræver nogen vævssektionering, og justeringen er enklere uden den høje NA-kondensator. Fremtidige vævsdiagnoseapplikationer vil drage fordel af hurtig, stor arealbilleddannelse på intakte kirurgiske prøver efterfulgt af maskinindlæring / dyb læringsbaseret diagnose. Protokollen, der præsenteres her, er også velegnet til in vivo-applikationer, såsom hjernebilleddannelse eller hudbilleddannelse, hvor epi-mode-billeddannelse er den eneste mulighed, og højhastighedsbilleddannelse er vigtig for at undgå bevægelsesartefakter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.