Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Sanntids, tofarget stimulert ramanspredningsavbildning av musehjerne for vevsdiagnose

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63484
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi er en kraftig, ikke-ødeleggende og etikettfri bildeteknikk. En fremvoksende applikasjon stimuleres Raman histologi, hvor tofarget SRS-avbildning ved protein- og lipid Raman-overgangene brukes til å generere pseudo-hematoksylin- og eosinbilder. Her demonstrerer vi en protokoll for sanntids, tofarget SRS-avbildning for vevsdiagnose.

Abstract

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi har dukket opp som en kraftig optisk bildeteknikk for vevsdiagnose. De siste årene har tofarget SRS vist seg å kunne gi hematoksylin- og eosin (H&E)-ekvivalente bilder som tillater rask og pålitelig diagnose av hjernekreft. Slik evne har muliggjort spennende intraoperative kreftdiagnoseapplikasjoner. Tofarget SRS-avbildning av vev kan gjøres med enten en picosecond eller femtosecond laserkilde. Femtosecond-lasere har fordelen av å muliggjøre fleksible bildemoduser, inkludert rask hyperspektral avbildning og tofarget SRS-bildebehandling i sanntid. En spektralfokuserende tilnærming med chirped laserpulser brukes vanligvis med femtosecond lasere for å oppnå høy spektral oppløsning.

Tofarget SRS-oppkjøp kan realiseres med ortogonal modulasjon og låsedeteksjon. Kompleksiteten av puls chirping, modulasjon og karakterisering er en flaskehals for den utbredte adopsjonen av denne metoden. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for å demonstrere implementering og optimalisering av spektralfokuserende SRS og sanntids, tofarget avbildning av musehjernevev i epimodus. Denne protokollen kan brukes til et bredt spekter av SRS-bildebehandlingsprogrammer som utnytter SRS' høyhastighets- og spektroskopiske bildebehandlingsevne.

Introduction

Tradisjonell vevsdiagnostikk er avhengig av fargingsprotokoller etterfulgt av undersøkelse under et optisk mikroskop. En vanlig fargingsmetode som brukes av patologer er H&E-farging: hematoksylin flekker cellekjerner en purplish blå, og eosin flekker den ekstracellulære matrisen og cytoplasma rosa. Denne enkle fargingen forblir gullstandarden i patologi for mange vevsdiagnoseoppgaver, spesielt kreftdiagnose. Imidlertid har H&E histopatologi, spesielt den frosne seksjoneringsteknikken som brukes i en intraoperativ setting, fortsatt begrensninger. Fargingsprosedyren er en arbeidskrevende prosess som involverer vevsinnbygging, seksjonering, fiksering og farging1. Den typiske behandlingstiden er 20 min eller lenger. Å utføre H&E under frossen seksjonering kan noen ganger bli mer utfordrende når flere seksjoner behandles samtidig på grunn av behovet for å evaluere mobilfunksjoner eller vekstmønstre i 3D for marginvurdering. Videre krever intraoperative histologiske teknikker dyktige teknikere og klinikere. Begrensning i antall styresertifiserte patologer på mange sykehus er en begrensning for intraoperativ konsultasjon i mange tilfeller. Slike begrensninger kan lindres med de raske utviklingsinteressene i digital patologi og kunstig intelligensbasert diagnose2. H&E-fargeresultatene er imidlertid variable, avhengig av teknikerens erfaring, noe som gir ytterligere utfordringer for datamaskinbasert diagnose2.

Disse utfordringene kan potensielt løses med etikettfrie optiske bildeteknikker. En slik teknikk er SRS mikroskopi. SRS bruker synkroniserte pulserende lasere – pumpe og Stokes – til å begeistre molekylære vibrasjoner med høy effektivitet3. Nyere rapporter har vist at SRS-avbildning av proteiner og lipider kan generere H&E-tilsvarende bilder (også kjent som stimulert Raman histologi eller SRH) med intakt friskt vev, som omgår behovet for vevsbehandling, forkorter betydelig tiden som trengs for diagnose, og har blitt tilpasset intraoperativt4. Videre kan SRS-avbildning gi 3D-bilder, som gir tilleggsinformasjon for diagnose når 2D-bilder ikke ertilstrekkelige 5. SRH er objektiv og genererer digitale bilder som er lett tilgjengelige for datamaskinbasert diagnose. Det fremstår raskt som en mulig løsning for intraoperativ kreftdiagnose og tumormarginanalyse, spesielt i hjernekreft 6,7,8. Mer nylig har SRS-avbildning av kjemiske endringer i vev også blitt foreslått å gi nyttig diagnostisk informasjon som ytterligere kan hjelpe klinikere med å stratifisere forskjellige krefttyper eller stadier9.

Til tross for sitt enorme potensial i vevsdiagnoseapplikasjoner, er SRS-avbildning for det meste begrenset til akademiske laboratorier spesialisert på optikk på grunn av kompleksiteten knyttet til bildeplattformen, som inkluderer ultraraske lasere, laserskanningsmikroskopet og sofistikert deteksjonselelektronikk. Denne protokollen gir en detaljert arbeidsflyt for å demonstrere bruken av en vanlig femtosecond laserkilde for sanntids, tofarget SRS-avbildning og generering av pseudo-H&E-bilder fra musens hjernevev. Protokollen dekker følgende prosedyrer:

Justering og chirp-optimalisering
De fleste SRS-bildebehandlingsordninger bruker enten picosecond- eller femtosecond-lasere som eksitasjonskilde. Med femtosecond lasere er båndbredden til laseren mye større enn Raman linewidth. For å overvinne denne begrensningen, brukes en spektral fokusering tilnærming til å kvitre femtosecond lasere til en picosecond tidsskala for å oppnå smal spektral oppløsning10. Optimal spektral oppløsning oppnås bare når den tidsmessige chirp (også kjent som gruppeforsinkelsesspredning eller bare spredning) er riktig tilpasset pumpen og Stokes-laserne. Justeringsprosedyren og trinnene som trengs for å optimalisere spredningen av laserstrålene ved hjelp av svært dispergerende glassstenger, demonstreres her.

Frekvenskalibrering
En fordel med spektralfokuserende SRS er at Raman-eksitasjonen raskt kan justeres ved å endre tidsforsinkelsen mellom pumpen og Stokes-laserne. Slik tuning gir rask bildebehandling og pålitelig spektral oppkjøp sammenlignet med tuning laser bølgelengder. Den lineære sammenhengen mellom eksitasjonsfrekvens og tidsforsinkelse krever imidlertid ekstern kalibrering. Organiske løsningsmidler med kjente Raman-topper brukes til å kalibrere Raman-frekvensen for spektralfokuserende SRS.

Tofarget bildebehandling i sanntid
Det er viktig å øke bildehastigheten i vevsdiagnoseapplikasjoner for å forkorte tiden som trengs for å analysere store vevsprøver. Samtidig tofarget SRS-avbildning av lipider og proteiner hindrer behovet for å justere laseren eller tidsforsinkelsen, noe som øker bildehastigheten med mer enn to ganger. Dette oppnås ved å bruke en ny ortogonal modulasjonsteknikk og tokanals demodulering med en innlåsingsforsterker11. Dette dokumentet beskriver protokollen for ortogonal modulasjon og tokanals bildeanskaffelse.

SRS-bildebehandling i epimodus
Mesteparten av SRS-avbildningen som vises til dags dato, utføres i overføringsmodus. Epi-modus bildebehandling oppdager backscattered fotoner fra vev12. For patologiapplikasjoner kan kirurgiske prøver være ganske store. For avbildning av overføringsmodus er vevsseksjon ofte nødvendig, noe som uønsket krever ekstra tid. I motsetning til dette kan epimodusavbildning fungere med intakte kirurgiske prøver. Fordi det samme målet brukes til å samle tilbakescattered lys, er det heller ikke behov for å justere en høy numerisk blenderåpning kondensator som kreves for overføringsavbildning. Epi-modus er også det eneste alternativet når vevsseksjon er vanskelig, for eksempel med bein. Tidligere har vi vist at for hjernevev tilbyr epimodusavbildning overlegen bildekvalitet for vevstykkelse > 2 mm13. Denne protokollen bruker en polariserende strålesplitter (PBS) for å samle spredte fotoner depolarisert av vev. Det er mulig å samle flere fotoner med en ringformet detektor på bekostning av kompleksiteten til tilpasset detektormontering12. PBS-tilnærmingen er enklere å implementere (ligner fluorescens), med standard fotodiode som allerede brukes til deteksjon av overføringsmodus.

Pseudo-H&E-bildegenerering
Når tofargede SRS-bilder er samlet inn, kan de fargelegges på nytt for å simulere H&E-flekker. Dette dokumentet demonstrerer prosedyren for å konvertere lipid- og protein SRS-bilder til pseudo-H&E SRS-bilder for patologiapplikasjoner. Den eksperimentelle protokollen beskriver kritiske trinn som trengs for å generere SRS-bilder av høy kvalitet. Prosedyren som vises her gjelder ikke bare for vevsdiagnose, men kan også tilpasses for mange andre hyperspektrale SRS-avbildningsapplikasjoner som medikamentavbildning og metabolsk avbildning 14,15.

Generelle systemkrav
Lasersystemet for denne protokollen må kunne sende ut 2 synkroniserte femtosecond laserstråler. Systemer har ideelt sett en optisk parametrisk oscillator (OPO) for bred bølgelengdejustering av en av laserstrålene. Oppsettet i denne protokollen bruker et kommersielt lasersystem Insight DS+ som sender ut to lasere (en fast stråle på 1040 nm og en OPO-basert justerbar stråle, fra 680 til 1300 nm) med en repetisjonshastighet på 80 MHz. Laserskanningsmikroskoper, enten fra store mikroskopprodusenter eller hjemmebygde, kan brukes til SRS-avbildning. Det brukte mikroskopet er et oppreist laserskanningsmikroskop bygget på toppen av en kommersiell oppreist mikroskopramme. Et par 5 mm galvospeil brukes til å skanne laserstrålen. For brukere som velger å ta i bruk et hjemmebygd laserskanningsmikroskop, kan du se en tidligere publisert protokoll for bygging av et laserskanningsmikroskop16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle dyreprosedyrer ble utført med 200 μm, faste, seksjonerte musehjerner, i samsvar med protokollen (# 4395-01) godkjent av Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Washington. Wild-type mus (C57BL/6J-stamme) avlives med CO2. Deretter utføres en kraniotomi for å trekke ut hjernen for fiksering i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann. Hjernene er innebygd i en 3% agarose og 0,3% gelatinblanding og seksjonert i 200 μm tykke skiver av en vibratom.

1. Innledende justering

MERK: Påse at bjelkestørrelsen og divergensen på begge armene stemmer overens med best mulig følsomhet og oppløsning. Kollater pumpen og Stokes-strålene og juster størrelsene før de kommer inn i laserskanningsmikroskopet. For å gjøre dette, bruk et par akromatiske linser for hver stråle før du kombinerer dem på det dikroiske speilet. Bruk alltid riktige laserbriller for strålejustering.

  1. Bjelke sammenlikning
    1. Installer et par akromatiske linser til pumpestrålen. Som utgangspunkt bruker du et 100 mm objektiv og et objektiv på 200 mm til å forstørre laserstrålestørrelsen med 2 ganger. Pass på at avstanden til de to linsene er omtrent 300 mm. Juster pumpestrålen gjennom midten av begge linsene.
    2. Plasser et speil etter det andre objektivet for å sende strålen mot en vegg (>1 m unna). Vær forsiktig når du sender strålen over lange avstander. Spor strålen fra speilet til veggen med et IR-kort og sjekk om bjelken endres i størrelse. Kollater strålen hvis strålen endres i størrelse som en funksjon av avstand.
      1. Hvis strålen konvergerer (synkende størrelse med forplantning), flytt de to linsene nærmere.
      2. Hvis strålen divergerer (øker størrelsen med forplantning), flytt de to linsene lenger fra hverandre. Juster avstanden til strålen er kollatert.
    3. Gjenta trinn 1.1.1 og 1.1.2 for Stokes-strålen for å samle bjelken.
  2. Justering av bjelkestørrelse
    1. Hvis en bjelkeprofilering er tilgjengelig, måler du den kollilaterte bjelkestørrelsen for hver bjelke. Alternativt kan du estimere bjelkestørrelsen ved hjelp av IR-kortet og en linjal for å oppnå en bjelkediameter på 4-5 mm.
    2. Hvis bjelkestørrelsen er for liten eller for stor, endrer du linseparet som ble brukt i trinn 1.1. Juster linseparet til begge bjelkene har en diameter på 4-5 mm.
      MERK: Forstørrelsen av strålen er forholdet mellom brennvidden på det andre objektivet og det første objektivet (f2/f1).
  3. Romlig overlapping
    MERK: SRS-avbildning krever at begge laserstrålene kombineres i rom og tid for å begeistre molekylære vibrasjoner. Et skjema av spektralfokuserende SRS-avbildning vises i figur 1.
    1. Kombiner de to laserstrålene ved å installere et dikroisk speil med flere styrespeil for justering. Optimaliser romlig overlapping av pumpen og Stokes ved å overvåke bjelker etter det dikroiske speilet i to forskjellige posisjoner langt fra hverandre (~1 m). Juster styrespeilet før det dikroiske og dikroiske speilet for å justere Stokes-strålen etter pumpestrålen.
      MERK: Hvis de to bjelkene overlapper i begge posisjoner, er de tilstrekkelig overlappende.
    2. Forsikre deg om at de kombinerte bjelkene sendes til midten av skannespeilene på laserskanningsmikroskopet ved å justere et par styrespeil når skannespeilene er i parkert posisjon. Sørg for at begge bjelkene beveger seg gjennom midten av mikroskopmålet og kondensatoren.
    3. Etter kondensatoren, bruk et annet par linser med brennvidder på henholdsvis 100 mm og 30 mm for å videresende den overførte strålen til fotodioden. Forsikre deg om at begge bjelkene er inneholdt i fotodioden og installer to lavpassfiltre for å blokkere den modulerte Stokes-strålen.

2. SRS-signaldeteksjon

  1. Elektrooptisk modulasjon (EOM)
    MERK: EOM på 20 MHz brukes til å modulere Stokes amplitude. Som diskutert senere, er EOM avledet fra 80 MHz laserpulstog, som kreves for ortogonal modulasjon. Andre modulasjonsfrekvenser kan brukes hvis bare enfarget eller hyperspektral SRS utføres. I så fall er synkronisering av modulasjonsfrekvens til laserfrekvens unødvendig. En frekvensgenerator med RF-effektforsterker kan brukes til å drive EOM. Som et resultat kan trinn 2.1.1-2.1.4 hoppes over.
    1. Plasser en bjelkeprøve i Stokes strålesti for å plukke opp 10% av strålen og send den til en rask fotodiode for å oppdage 80 MHz pulstog.
      MERK: Fotodiodesignalet sendes til en frekvensdeler for å generere en 20 MHz TTL-utgang. Denne utgangen sendes videre inn i en viftebuffer for å replikere utdataene til fire identiske 20 MHz-utganger. En av utgangene brukes til å utløse oscilloskopet.
    2. Ta en av utgangene til viftebufferen og filtrer den med et bandpassfilter for å få en 20 MHz sinusformet bølge. Bruk en RF-demper for å justere utgangstoppen til toppspenningen til ~ 500 mV.
    3. Send den resulterende utgangen til en faseskifter, som tillater finjustering av RF-fasen med en spenningskilde. Send denne utgangen til en RF-effektforsterker og koble forsterkerens utgang til EOM.
    4. Fjern blokkeringen av Stokes-strålen og optimaliser modulasjonsdybden til EOM1 ved å plassere en fotodiode i strålebanen. Juster EOM-spenningen og kvartbølgeplaten til modulasjonsdybden (dal-til-topp-forholdet) ser tilfredsstillende ut.
      MERK: Ved 20 MHz-modulering (1/4 av laserrepetisjonshastigheten) forventes to pulser hver 50 ns.
  2. Tidsoverlapping
    MERK: Temporal overlapping av pumpen og Stokes oppnås ved å forsinke et av de to laserpulstogene med en retrorefleks montert på et forsinkelsesstadium (figur 1 viser at Stokes blir forsinket). Grov overlapping overvåkes med oscilloskopet, og fin overlapping overvåkes av SRS-signalet. Fin tidsoverlapping kan også oppnås med en autokorrelator hvis tilgjengelig.
    1. Plasser en fotodiode etter det dikroiske speilet for å oppdage laserstrålen. Blokker Stokes-strålen først. Zoom inn på en av pumpepulstoppene på oscilloskopet. Plasser en vertikal markør for å markere den tidsmessige posisjonen til denne toppen med oscilloskopet.
    2. Blokker pumpebjelken og fjern blokkeringen av Stokes-strålen. Oversett forsinkelsesfasen slik at den samsvarer med toppposisjonen på oscilloskopet til den markerte posisjonen i forrige trinn. Se figur 2 for visning av den tidsmessige overlappingen av to bjelker.
      1. (VALGFRITT) Hvis oversettelsen av forsinkelsesstadiet ikke er tilstrekkelig til å samsvare med de to bjelkene, må du flytte forsinkelsesstadiet til midten av bevegelsesområdet.
      2. Beregn forsinkelsesavstanden som kreves for å matche de to bjelkene ved å ta den tidsmessige forskjellen mellom de to bjelkene og multiplisere forskjellen med lysets hastighet for å finne avstanden som trengs for å matche de to bjelkene timelig.
      3. Forlenge strålebanen til den raskere strålen eller forkort strålebanen til den langsommere strålen for å omtrent matche den tidsmessige forsinkelsen tilsvarende.
    3. Klargjør en lysbildefremvisning av et mikroskop med DMSO og dobbeltsidig tape som avstandsstykke for å holde prøven mellom lysbildet og en deksleslip.
    4. Plasser prøven på mikroskopet med dekslene vendt mot mikroskopmålet. Bytt mikroskopet til brightfield-belysning og følg prøven fra okularet. Finn fokuset på prøven ved først å finne fokuset på både det øverste og nederste laget av luftbobler ved glassbåndgrensesnittet, og flytt deretter fokuset for å være mellom de to lagene med tape.
      MERK: Sørg for at laserstrålene er blokkert før du ser inn i okularet.
    5. Sett den justerbare stråleutgangen til 798 nm. Basert på kondensatorens optiske gjennomstrømning justerer du den optiske effekten til ~40 mW hver for pumpen og Stokes-bjelkene med objektivt fokus.
    6. Åpne ScanImage i MATLAB (eller annen skanneprogramvare som styrer mikroskopet) og klikk på knappen merket FOCUS for å starte skanningen.
      MERK: Laserstrålene vil bli rastrert gjennom prøven for å generere et bilde. Den lavfrekvente signalutgangen fra fotodioden (<100 kHz) sendes direkte til kanal 1 på datainnsamlingskortet (referert til som DC-kanalen). Høyfrekvent utgang (>100 kHz) fra fotodioden sendes inn i låseforsterkeren, og X-utgangen til innlåsingsforsterkersignalet sendes inn i kanal 2 av datainnsamlingskortet (referert til som vekselstrømskanalen).
    7. Juster styrespeilet før galvoskanneren for å midtstille DC-signalet på kanal 1-displayet. Flytt det motoriserte forsinkelsesstadiet og følg låseutgangen som vises på kanal 2-displayet (dvs. vekselstrømkanalen).
      MERK: Når pumpen og Stokes sammenfaller i tide, vises et signal på vekselstrømskanalen. Det er nyttig å justere fargeskalaen på vekselstrømskanalen for å vise den lille intensitetsendringen.
    8. Maksimer ac signalintensiteten ved å finjustere tidsforsinkelsen. Juster det dikroiske speilet for å midtstille SRS-signalet på vekselstrømskanalen (samtidig som DC-kanalen holdes sentrert). Juster fasen på låseforsterkeren for å maksimere signalet. Se figur 3 for et tilfredsstillende signal.

3. Spektral oppløsningsoptimalisering

MERK: Pumpen og Stokes-bjelkene som når prøven, bør ha samme mengde gruppeforsinkelsesspredning (GDD) for å maksimere spektraloppløsningen. Spredningen avhenger sterkt av det eksperimentelle oppsettet. Det eksperimentelle oppsettet som er beskrevet her, bruker femtosecond-pulser på henholdsvis 1040 nm og 800 nm som Stokes og pumpe. Tette flintglassstenger (H-ZF52A) brukes som pulsstrekkende medium.

  1. Sett inn 48 cm av en svært dispergerende glassstang (H-ZF52A eller tilsvarende tett flintglass) i 800 nm bjelkestien. Beregn GDD ved hjelp av Eq (1):
    Equation 1 (1)
    MERK: GVD av ulike glassmaterialer ved forskjellige bølgelengder finner du fra refraktiv indeksdatabaseressurs. For eksempel har H-ZF52A en GVD på 220,40 fs2/mm ved 800 nm. Den totale GDD er 105792 fs2.
  2. Beregn hvor mange cm av den dispergerende glassstangen som kreves for å legge til 1040 nm bjelkebane for å matche pumpens GDD. Sett inn riktig lengde på dispergeringsglassstenger til 1040 nm bjelkebanen for å omtrent matche GDD på 800 nm-bjelken. Vær oppmerksom på at tilsetning av glassstenger vil endre den tidsmessige overlappingen av de to bjelkene, og justering av forsinkelse kan være nødvendig.
  3. Kalibrering av spektral oppløsning
    1. Lag en mikroskop lysbildeprøve med DMSO. Plasser gliden på mikroskopet og kontroller kraften til bjelkene som kommer ut av mikroskopkondensatoren. Juster kraften tilsvarende for å ha ~ 40 mW hver ved prøvefokus.
    2. Åpne ScanImage fra MATLAB. Finn det maksimale SRS-signalet ved å skanne gjennom forsinkelsesfasen, som tilsvarer den 2913 cm-1 Raman-toppen av DMSO. Beregn sceneposisjonen basert på forrige trinnposisjon med den økte optiske banelengden på grunn av innsetting av stenger. Omjuster bjelkens romlige overlapping på grunn av den lille avviket fra bjelken når glassstenger tilsettes.
    3. Lagre en hyperspektral SRS-skanning ved å ta en rekke SRS-bilder sekvensielt mens du flytter det motoriserte stadiet.
      MERK: Forsinkelsesskanningsområdet dekker to Raman-topper, tilsvarende henholdsvis 2913 cm-1 og 2994 cm-1 Raman-toppene i DMSO. Disse to overgangene observeres ved bruk av en 800 nm pumpe og 1040 nm Stokes laser.
    4. Plott ut SRS-spektraet til DMSO-løsningen ved hjelp av enten ImageJ eller MATLAB. Monter den store DMSO 2913 cm-1-toppen til en Gaussian- eller Lorentzian-funksjon i MATLAB for å beregne full bredde ved halv maksimum (FWHM) av toppen.
      MERK: Representative resultater vises i figur 4. Hvis bare en bred topp er til stede, betyr det at enten spektraloppløsningen er for dårlig til å skille de to toppene og flere glassstenger kreves, eller det skannede området var for lite til å oppdage den andre toppen. Vanligvis er en akseptabel spektraloppløsning DMSO ~ 20-25 cm-1 når glassstenger lengde på >60 cm brukes. En lavere oppløsning brukes ofte til vevsavbildning for å handle for høyere signaler med kortere pulser17.
  4. (VALGFRITT) Bruk en autokorrelator eller en FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) for å bestemme pulsvarigheten til hver arm for å beregne nøyaktig mengden GDD og lengden på stengene som trengs for å matche GDD mellom pumpen og Stokes.
  5. Gjenta trinn 3.3.2-3.3.4 for forskjellige stenger lengder på Stokes-bjelken for å finne den optimale spektraloppløsningen, noe som betyr at den beste GDD-kampen har blitt funnet eksperimentelt. Bruk flere sett med glassstenger som varierer i lengde for å oppnå optimal spektraloppløsning.

4. Signal til støy (SNR) karakterisering

  1. Kontroller at trinn 4.2 utføres etter fullstendig romlig og tidsmessig justering.
  2. Skaff deg et SRS-bilde som tilsvarer den 2913 cm-1 Raman-toppen av DMSO. Åpne bildet i ImageJ, og velg et lite område midt i rammen. Bruk målefunksjonen til å beregne gjennomsnitts- og standardavviket for verdier i det valgte området.
  3. Del gjennomsnittsverdien for det valgte området med standardavviket for å finne SNR-verdien, som i Eq (2).
    Equation 2 (2)
    MERK: En god SNR for systemet (med en låsetidskonstant på 4 μs) ved bruk av DMSO ved 40 mw/40 mw i fokus for begge armene er >800. Lavere konsentrasjoner av DMSO eller lavere effekt kan brukes til en mer nøyaktig estimering av SNR hvis datainnsamlingskortet har en begrenset bitdybde.
  4. Hvis SNR er for lav, må du justere laserpulsene på en omorganisering for å optimalisere romlig overlapping, tidsoverlapping, strålestørrelse/kollokasjonsmatching og/eller dispersjonsmatching. For et mål med en avvikskorreksjonskrage, optimaliser signalet ved å justere korreksjonskragen.

5. Kalibrering av frekvensakse

MERK: Dette trinnet utføres for å relatere forsinkelsesstadiets posisjon til den skannede Raman-overgangen. Nøye valg av løsningsmidler er nødvendig for å generere en passende "Raman Ruler." DMSO er et effektivt løsningsmiddel for CH-bindinger, da det har to skarpe Raman-topper på 2,913 cm-1 og 2,994 cm-1.

  1. Lagre en hyperspektral skanning med forsinkelsesstadiet som dekker de 2913 cm-1 og 2994 cm-1 Raman-toppene i DMSO. Lagre stadiumposisjonene som tilsvarer hyperspektraldatasettet.
    MERK: Den globale maksimale toppen av spekteret tilsvarer DMSO 2913 cm-1 Raman-skiftet , og den andre maksimale toppen tilsvarer DMSO 2994 cm-1 Raman-skiftet .
  2. Utfør lineær regresjon for sceneposisjonene og Raman skifter på 2,913 cm-1 og 2,994 cm-1. Bruk den lineære regresjonsligningen relatert til sceneposisjonen til Raman-skiftet, og konverter forsinkelsesposisjonene til de tilsvarende Raman-frekvensene.

6. Ortogonal modulasjon og tofarget avbildning

MERK: Det ortogonale modulasjonstrinnet er bare nødvendig når det er behov for tofargers bildebehandling i sanntid. Et skjema som er angitt i dette skjemaet, vises i figur 5. Den ortogonale modulasjonen bruker et par EOMer drevet med en fjerdedel av laserfrekvensen (20 MHz for 80 MHz laser) med et 90° faseskift mellom de to. Dette ortogonale modulasjonstrinnet kan hoppes over for SRS-avbildning med én farge eller hyperspektral SRS-avbildning.

  1. EOM1-modulering
    1. Installer en PBS (PBS2), en kvartbølgeplate (QWP2) og en annen EOM (EOM2) i Stokes strålebane etter den første EOM. Koble signalinngangen til EOM2. Koble signalinngangen til EOM1 og slå den på.
    2. Moduler Stokes-strålen (festet til 1040 nm) ved 20 MHz (f0/4) ved å sende strålen gjennom den første EOM. Juster hellingen og posisjonen til EOM1 for å sikre at strålen treffer rett og sentrert gjennom EOM-krystallen.
    3. Overvåk modulasjonsdybden ved å observere begge polariseringene som kommer ut av PBS1 med to fotodioder og vise moduleringen på et oscilloskop.
    4. Juster QWP1, EOM1-spenningen og fasen av 20 MHz-inngangen (ved hjelp av en faseskifter) for å optimalisere modulasjonsdybden til den overførte strålen for å være nær 100%. Se figur 2B for en illustrasjon av god modulasjonsdybde.
  2. EOM2-modulering
    1. Koble fra EOM1 og koble til EOM2.
    2. Send inn høyspenningsutgangen til den andre forsterkeren ved 20 MHz til EOM2. Juster hellingen og posisjonen til EOM2 for å sikre at strålen treffer rett og sentrert gjennom EOM-krystallen.
    3. Igjen, overvåk modulasjonsdybden ved å se på begge polariseringene som kommer ut av PBS2 med et oscilloskop. Juster QWP2,EOM2-spenningen og faseskifteren etter behov for å oppnå nærmere 100 % modulering for begge polariseringene.
    4. Påse at pulstogmoduleringen har et 90° faseskift fra første modulasjon.
      MERK: Hvis de to pumpepulstogene ikke er 90° ortog, vil krysstale mellom de to kanalene være et problem.
    5. Test ortogonaliteten til moduleringen ved å slå på og koble til både EOM1 og EOM2. Overvåk begge polariseringene som deles av PBS2 med et oscilloskop. Reoptimize EOM1 og EOM2 individuelt hvis pulstoget etter den andre PBS ikke ligner figur 2C.
    6. Installer en 20 mm birefringent kvartskrystall (BRC) og HWP nedstrøms EOM2. Koble til begge EOMene samtidig og overvåk pulstoget slik at det ligner figur 2D.
      MERK: For chirp som brukes i dette eksperimentet, induserer 20 mm BRC en tidsforsinkelse som tilsvarer et 80 cm-1 Raman skift. En annen BRC-lengde kan være nødvendig hvis en annen chirp brukes.
  3. Kalibrering
    1. Kalibrer systemet ved hjelp av DMSO ved å oppdage signaler fra innlåsingsforsterkeren X- og Y-kanalutgangen (sendt til kanal 2 og 3 på datainnsamlingskortet).
    2. Kontroller om signalene som genereres av toppen på 2913 cm-1 , kommer fra den raskere polariseringen, og at fra den langsommere polariseringen er nær 90° ute av fase på låseforsterkeren. Hvis dette ikke er tilfelle, justerer du EOM-justeringen til de to signalene er nær 90° ut-av-fase.
    3. Når kalibreringen er fullført, finn forsinkelsesposisjonen som undersøker proteinovergangen på 2930 cm-1 for en av ortogonale bjelkene. Pass på at den andre polariseringssondene lipidovergangen på 2850 cm-1.

7. Epi-modus SRS-avbildning

MERK: I bildeskjemaet for overføringsmodus fokuserer målet laseren inn i prøven, og deretter styrer et kondensatorobjektiv den overførte strålen til en fotodiode for innlåsingsdeteksjon. I epimodusavbildningsskjemaet blir lys som er tilbakescattered og depolarisert av prøven, gjenkjent av fokuseringsmålet og isolert ved hjelp av en polariserende strålesplitter. De isolerte og backscattered fotonene sendes til en fotodiode gjennom et par relélinser for innlåsingsdeteksjon. Figur 6 viser bildebehandlingsskjemaet for epimodus.

  1. Installer en HWP før strålen kommer inn i mikroskopet for å endre polariseringen av strålen som går inn i mikroskopet. Plasser en PBS over målet for å la den depolariserte bakreflekterte strålen nå detektoren.
  2. Bruk et par linser som består av en 75 mm akromatlinse og en 30 mm asfærisk linse for å videresende de bakscattered fotonene fra bakåpningen av målet til fotodetektoren. Monter detektoren for å samle det ryggspekkede lyset som ledes av PBS. Monter et filter for å blokkere den modulerte strålen fra å komme inn i detektoren.
  3. Plasser vevsprøven under målet. Siden kondensatoren er unødvendig for epimodusavbildning, fjerner du den hvis det er behov for mer plass.
  4. Imaging
    1. Blokker av strålen med en lukker; skinne en hvit lyskilde på prøven fra siden; og bruk brightfield for å finne objektiv fokus.
    2. Fjern blokkeringen av begge bjelkene og bruk de forhåndskalibrerte forsinkelsesposisjonene til å skaffe lipid- og protein-SRS-bilder fra vev fra de to utgangene til låseforsterkeren.
    3. Juster låseforsterkningen og pikselbeholderfaktoren for å skaffe bilder av god kvalitet.

8. Fargeflekker med falsk farge

  1. Åpne bildestakken med ImageJ.
  2. Trekk ut de to bildene som tilsvarer lipiden (2850 cm-1) og proteinartene (2930 cm-1) ved å høyreklikke på bildet og klikke på Dupliser.
  3. Gi lipidbildet til lipider og proteinbildet til proteiner.
  4. Gå til Prosess | Bilde Kalkulator og utføre proteiner trekke lipider.
  5. Kombiner bildene ved å gå til Bilde | Farge | Slå sammen kanaler, sett lipider til grønt og proteiner til blått. Åpne bildekanalverktøyet (bilde | Farge | kanalverktøyet) og juster lysstyrken og kontrasten (| Juster | Lysstyrke/kontrast).
  6. Juster lysstyrken og kontrasten for hver kanal ved hjelp av kanalverktøyet . For lipidkanalen justerer du kontrasten til mobilfunksjonene ser mørke ut. For proteinkanalen justerer du kontrasten til de cellulære funksjonene ser blå ut. Konverter det sammenslåtte grønne/blå bildet for kanalen til et RGB-bilde ved å gå til Bilde | Skriv inn | RGB-farge. Eksporter denne avbildningen etter | Lagre som | Tiff.
    MERK: For falsk H&E-farging viser fargeskjemaet rosa cytoplasma, mens kjernene er mørkeblå-lilla.
  7. Last ned HE.m MATLAB-skriptet fra den falske H&E-fargeskriptressursen i materialtabellen.
  8. Kjør HE.m-manuset i MATLAB. Velg det eksporterte RGB-bildet fra forrige trinn for å generere et kunstig H&E-farget bilde.
  9. (VALGFRITT) Normaliser bildeintensiteten for store synsfeltbilder fordi bildet ser mørkere ut i periferien enn i midten.
    1. Hvis du vil utføre feltnormalisering av bildene, må du beregne gjennomsnittet for så mange bilder som mulig. Fjern deretter intensitetsfunksjonene med ImageJ (Behandle | Filtre | Gaussian Blur | Radius=50).
    2. Mål maksimal intensitet for det uskarpe bildet (Ctrl+M). Del det uskarpe bildet med maksimal intensitet (prosess- | Matte | Del). Del raw SRS-bildet med det uskarpe bildet (Behandle | Bilde | Kalkulator).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optimalisere spektraloppløsning:
Dispersjon gjennom et materiale påvirkes av dispergeringsmediet (lengde og materiale) og bølgelengde. Endring av dispersjonsstanglengden påvirker spektraloppløsningen og signalstørrelsen. Det er et gi-og-ta-forhold som kan veies annerledes avhengig av applikasjonen. Stengene strekker ut strålepulsen fra å være bred i frekvens og smal i tide til å være smal i frekvens og bred i tide. Figur 7 viser effekten av varierende stanglengder på spektraloppløsningen. Figur 7A viser svært dårlig spektraloppløsning; dette oppsettet har ingen glass chirping stenger, og de to Raman topper fra DMSO er ikke løst i det hele tatt. I figur 7B,C begynner en økning i antall glass chirping stenger å løse de to toppene. Til slutt viser Figur 7D hvordan samsvarende chirping løser begge toppene og kan brukes til å kalibrere sceneposisjoner til frekvens.

Kalibrering med DMSO:
DMSO har to skarpe Raman-topper på 2,913 og 2,994 cm-1 som er praktiske for kalibrering i C-H-regionen. Når et DMSO-spektrum er hentet fra en hyperspektral SRS-skanning, konverterer en enkel lineær regresjon sceneposisjonen til Raman-skiftet. Hvis spektraloppløsningen er dårlig (som vist i figur 7A) og de to toppene ikke er separerbare, er kalibrering med lineær regresjon umulig. I dette tilfellet er bedre dispersjonsmatching nødvendig ved å enten legge til eller fjerne glassstenger. De vanligste vanskelighetene med å finne et DMSO-signal for kalibrering skyldes feil i enten tidsoverlapping eller romlig overlapping av de to bjelkene. Før du prøver DMSO-kalibrering, gjentar du trinnene for romlig og tidsmessig justering for å optimalisere SRS-signalet.

Tofarget DMSO:
I tofarget SRS genereres to pumpepulstog med ortogonal polarisering med en fast tidsforsinkelse (på grunn av en birefringent krystall). Evaluering av modulasjonsdybde og 90° faseskift gjøres med en fotodiode etterfulgt av et DMSO SRS-signal. Figur 8 viser akseptabel modulasjonsdybde og tidsseparasjon. Selv om den spektrale oppløsningen av DMSO i figur 8 ikke er ideell, blir den ofte ofret i vevsavbildningseksperimenter for å oppnå et høyere signal med kortere pulser. Figur 9 viser dårlige faseskift som gir opphav til inverterte eller negative topper.

Tofarget SRS av musens hjernevev i epi-modus:
Epi-modus (detektering av backscattered fotoner) SRS brukes til å avbilde tykt vev (>1 mm). Figur 10A,B demonstrerer sanntids, tofarget SRS-avbildning ved 2850 cm-1 og 2930 cm-1 eks vivomus hjernevev. Råbildene fra lipid- og proteinkanalene (figur 10A, B) var fargekodet for å produsere et enkelt bilde som viser lipid- og proteinbidrag (figur 10C). Falsk H&E-farging ble utført (figur 10D) på figur 10C for å etterligne H&E-farging. Dårlig bildekvalitet kan være et resultat av stor bildedybde eller dårlig kalibrering (frekvensakse eller modulasjonsdybde). Den typiske bildedybden i hjernevev er 100-200 μm13.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for oppsett av SRS-bildebehandling med én farge. Bygging av et spektralfokuserende SRS-mikroskop i overføringsmodus. X og Y representerer ortogonale utganger. Forkortelser: SRS = stimulert Raman spredning; DL = retroreflector-basert forsinkelseslinje; Div = skillevegg; FB = fanout buffer; AT = attenuator; PS = faseskifter; PA = effektforsterker; DCM = dikroisk speil; GM = galvo speil; EOM = elektrooptisk modulator; POM = pick-off speil; PBS = polariserende strålesplitter, BRC = birefringent krystall; QWP = kvartbølgeplate; HWP: halvbølgeplate; PD = fotodiode; GR = glassstang; BB = Bjelke blokk; SPF = shortpass filter; CL = kollaterende linse; BS = bjelkestørrelse skiftende linse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativ tidsoverlapping. (A) Pumpen og Stokes-bjelkene blir sett på som tidsmessig overlappet på oscilloskopet. Oscilloskopmarkører brukes til å markere pumpens temporale posisjoner og Stokes-bjelker. Denne overlappingen er tilfredsstillende som utgangspunkt for ytterligere justering av tidsoverlapping med et forsinkelsesstadium. (B) Tilfredsstillende representativ modulasjonsdybde på en EOM ved 20 MHz. (C) Tilfredsstillende pulsmodulering mens to EOMer er i bruk. (D) Tilfredsstillende pulstogmodulering etter birefringent kvartskrystall og halvbølgeplateinstallasjon på den dobbeltmodulerte Stokes-armen. Forkortelse: EOM = elektrooptisk modulator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative SRS- og pumpesignaler. (A) Feiljustert pumpesignal oppdaget i DC-kanal. (B) Feiljustert SRS-signal oppdaget av fotodiode. (C) Tilfredsstillende, sentrert pumpesignal i DC-kanalen. (D) Tilfredsstillende SRS-signal sentrert på vekselstrømskanalen. Forkortelse: SRS = stimulert Raman spredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering av spektraloppløsning. En gaussisk funksjon passet til den 2913 cm-1 Raman DMSO-toppen. FWHM beregnet ga en oppløsning på 15 cm-1 for systemet. Forkortelser: DMSO = dimetylsulfoksid; FWHM = Full bredde ved halv maksimum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Skjematisk for oppsett av tofargers SRS-bildebehandling. Konstruksjon av et tofarget SRS-mikroskop i overføringsmodus. X og Y representerer ortogonale utganger. Forkortelser: DL = retroreflector basert forsinkelse linje; Div = skillevegg; FB = fanout buffer; AT = attenuator; PS = faseskifter; PA = effektforsterker; DCM = dikroisk speil; GM = galvo speil; EOM = elektrooptisk modulator; PBS = polariserende strålesplitter; BRC = birefringent krystall; QWP = kvartbølgeplate; HWP = halvbølgeplate; PD = fotodiode; GR = glassstang; BB = Bjelkeblokk, SPF = kortpassfilter; CL = kollaterende linse; POM = pick-off speil; BS = bjelkestørrelse skiftende linse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Skjematisk for tofargers SRS-bildebehandling Epi-modusoppsett. Bygging av et tofarget SRS-mikroskop i epimodus. X og Y representerer ortogonale utganger. Forkortelser: DL = retroreflector basert forsinkelse linje; Div = skillevegg; FB = fanout buffer; AT = attenuator; PS = faseskifter; PA = effektforsterker; DCM = dikroisk speil; GM = galvo speil; EOM = elektrooptisk modulator; PBS = polariserende strålesplitter; BRC = birefringent krystall; QWP = kvartbølgeplate; HWP = halvbølgeplate; PD = fotodiode; GR = glassstang; BB = Bjelkeblokk, BPF = bandpassfilter; CL = kollaterende linse; POM = pick-off speil; BS = bjelkestørrelse skiftende linse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Optimalisering av spektraloppløsning med 25 % DMSO. (A) Null glasskringstenger ble brukt til å oppnå DMSO-spekteret. De to toppene er ikke løst. (B) Glass chirping stenger ble brukt, 20 cm på pumpearmen og 24 cm på Stokes arm. To topper begynner å bli løst til et tilfredsstillende punkt. (C) Chirping stenger ble brukt, 40 cm lang pumpe og 24 cm lange Stokes, for å oppnå et bedre løst DMSO-spektrum. (D) Chirping stenger ble brukt, 64 cm lang pumpe og 60 cm lange Stokes, for å oppnå høyere spektral oppløsning. Forkortelse: DMSO = dimetylsulfoksid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Tofarget SRS, varierende polarisering og tidsforsinkelse. To tidsforsinkede pulstog av ortog med ortogonal polarisering (s&p) brukes til å avbilde DMSO-spektra for å vise tidsforsinkelsen (og Raman-frekvensforskjellen) mellom SRS-eksitasjonene. Forkortelser: DMSO = dimetylsulfoksid; SRS = stimulert Raman spredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: SRS-spektrum som følge av et dårlig tofarget SRS-faseskift. En negativ topp på 2994 cm-1 nær stadiumposisjon 48 indikerer dårlig faseforskjell. Forkortelse: SRS = stimulert Raman spredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Generering av falske tofargers H&E-farging av SRS-bilder. (A) Råprotein SRS-bilde fra et musehjernevev ved overgangen på 2930 cm-1 . (B) Rå lipid SRS bilde fra musen hjernevev på 2850 cm-1 overgangen. (C) Sammenslåtte og fargekodede kanaler fra A og B med lipidbidrag i grønt og proteinbidrag i blått. (D) Falsk H&E-recoloring ble utført på C for å etterligne H&E-farging for patologiske anvendelser. Skalastang = 50 μm. Forkortelser: SRS = stimulert Raman spredning; H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det tofargede SRS-bildebehandlingsskjemaet som presenteres i denne protokollen, avhenger av riktig implementering av enfarget SRS-avbildning. I enfarget SRS-avbildning er de kritiske trinnene romlig justering, tidsjustering, modulasjonsdybde og faseskift. Romlig kombinere de to bjelkene oppnås av et dikroisk speil. Flere styrespeil brukes til finjustering når du sender bjelkene til det dikroiske speilet. Når bjelkene er kombinert med det dikroiske speilet, kan romlig justering bekreftes ved å plukke av den kombinerte strålebanen med et speil for å sende mot en vegg >1 m unna mens du sjekker den kombinerte strålen for å se om den overlapper med et IR-kort. Etter romlig justering gjennom mikroskopet utføres den tidsmessige overlappingen ved å justere banelengden med et retroreflektorbasert forsinkelsesstadium, som har fordelen av å bevare romlig justering. Armen på 1040 nm er den forsinkede strålen i denne protokollen. Tidsoverlapping er umulig hvis forsinkelsesstadiet ikke har rekkevidden til å få de to bjelkene til å overlappe timelig. I så fall kan det være nødvendig å flytte hele forsinkelsesfasen til et annet sted for å sikre at tidsoverlappingen er nær midten av forsinkelsesskanningsområdet. For eksempel, hvis den tidsmessige forskjellen mellom de to bjelkene måles som 6 ns, er det nødvendig med 1,8 m justering. Justeringen som kreves angir lengden på forlengelsen av bjelkebanen for den raskere strålen eller forkortelsen av bjelkebanen for den langsommere strålen.

I tillegg til justering er strålestørrelsesmatching og modulering av Stokes-strålen også viktig for å maksimere SRS-signalet. Ideelt sett bør begge bjelkene kollateres på objektivplanet og matche størrelsen på den objektive ryggåpningen. Det er nyttig å kontrollere sortering og strålestørrelse hvis objektivplanet er eksponert for brukeren. Hvis strålen konvergerer eller divergerer, er det nødvendig å justere det andre objektivet på kollokasjonslinseparet for å oppnå kollokasjon (protokolltrinn 1.1). På samme måte, hvis strålestørrelsen er for liten ved den objektive ryggåpningen, må et linsepar med høy forstørrelse brukes (protokolltrinn 1.2). SRS skalerer lineært med stokesstrålens modulasjonsdybde. Det er viktig å sikre at pulshøyden i dalen er <10% av pulshøyden på toppen på oscilloskopet. Dårlig modulering av Stokes-strålen oversettes direkte til dårlig SNR.

Ved bruk av femtosecond lasere for SRS-avbildning, er spektralfokusering nødvendig for å konvertere tidsforsinkelsen mellom pumpe og Stokes til Raman frekvensskift. Omregningsfaktoren avhenger av mengden chirp som brukes. Det er viktig å matche pumpens GDD og Stokes for å oppnå optimal spektraloppløsning. GDD kan estimeres basert på lengden på dispersjonsmaterialet som brukes og GVD. For eksempel har SF11 tett flintglassstang en GVD på 123.270 fs2/mm ved 1.040 nm og 187.486 fs2/mm ved 800 nm. For 240 mm SF11 i strålebanen på 800 nm er GDD 240 mm × 187,486 fs2/mm = 45 000 fs2. For 240 mm SF11 i strålebanen på 1040 nm er GDD 240 mm × 123,270 fs2/mm = 30 000 fs2. Denne eksempelberegningen betyr at ytterligere glassstenger skal legges til 1040 nm-armen, eller glassstenger skal fjernes fra 800 nm-armen for å matche GDD. For å oppnå høyere spektral oppløsning er det nødvendig med en større GDD, noe som betyr lengre stenger. Ved beregning av GDD har imidlertid bidragene fra EOM og målet blitt neglisjert. Den faktiske matchingen av GDD bestemmes eksperimentelt ved å finne den beste spektraloppløsningen for de gitte stanglengdene på pumpen eller Stokes. Beregningene fungerer som et godt starttrinn. Eksperimentell optimalisering gjennom iterativ tilsetning og fjerning av glassstenger er fortsatt nødvendig for å optimalisere spektraloppløsningen.

Det er viktig å innse at en stor chirp gir høyere spektraloppløsning, men på bekostning av signalintensitet. Mindre chirps og kortere pulser er gunstige for vevsavbildning i C-H-regionen fordi protein og lipid Raman topper er brede. Lavere spektral oppløsning kan handles for et høyere SRS-signal (eller raskere bildehastighet) uten å ofre tofarget vevskontrast17. I andre applikasjoner der høy spektral oppløsning er nødvendig, spesielt i fingeravtrykksregionen, er det nødvendig å bruke en større chirp ved hjelp av lange glassstenger. Alternativt kan det være lettere å bruke gitter bårer for å oppnå lengre pulser (for pulsvarighet lengre enn 3 ps). En hovedbegrensning av den brukte kommersielle laseren er imidlertid dens spektral båndbredde. Spektraldekningen av spektralfokuserende SRS avhenger av båndbredden til eksitasjonslaserne. Det brukte lasersystemet har en spektraldekning som vanligvis er rundt 200-250 cm-1. Dette er knapt tilstrekkelig til å dekke C-H-regionen. En større spektraldekning er vanligvis nødvendig for å løse kjemiske arter for avbildning i fingeravtrykksregionen. Dette problemet kan løses med et fiberlasertillegg som utvider båndbredden til Stokes-laseren fra 6 nm til 60 nm18. En annen viktig begrensning i tofargers SRS-bildebehandlingsteknikken er at bare to overganger overvåkes. Denne tilnærmingen ville være uegnet for komplekse prøver med mange overlappende Raman-topper eller flere arter.

Den tofargede SRS-bildemetoden i sanntid gir høyhastighets vevsavbildning ved å fjerne behovet for laser- eller forsinkelsesjustering. Det er imidlertid vanskelig å sette opp på grunn av utfordringene med å oppnå nesten perfekt modulasjonsdybde for begge EOMene. Det er best å optimalisere EOM1 og EOM2 uavhengig. Hvis EOM1 er på, må EOM2 kobles fra og omvendt. Når begge modulasjonene er optimalisert til nesten-perfeksjon (>95% modulasjonsdybde), er begge EOMene koblet for å muliggjøre ortogonal modulasjon. Lengden på tidsforsinkelsen mellom de to ortogene er avhengig av lengden på BRC og chirp. Denne modulasjonsmetoden er ikke umiddelbart mulig for kliniske applikasjoner, da kompleks elektronikk er nødvendig for å gi to RF-pulstog med et justerbart faseskift for å drive de to EOMene. Justeringen av EOM må også være nesten perfekt for å sikre høy overføring, god modulasjon og ortogonalitet mellom de to kanalene. Denne teknikken gjelder vanligvis for andre programmer som krever rask, samtidig bildebehandling av to Raman-topper på grunn av bevegelses- eller prøveendringer. Eksempler er vanntemperaturmålinger eller sporing av bevegelige gjenstander som lipiddråper eller organeller11,19.

En robust fiberlaser er nødvendig for fremtidige kliniske applikasjoner4. Tilnærmingen beskrevet av protokollen kan også utvides for å forbedre oppkjøpshastigheten opp til videohastighet, noe som er viktig å skanne store vevsprøver innen rimelig tid. Hvis bildetid eller bevegelsesartefakter ikke er et problem, kan protein- og lipid SRS-bilder anskaffes sekvensielt ved å flytte det motoriserte forsinkelsesstadiet ramme for ramme. En annen sanntids, tofarget SRS-bildemetode er en tofaset ordning som resirkulerer Stokes-strålen for å gi de samme to ortogonale kanalene20. Implementering av dobbeltfaseordningen krever imidlertid ekstra justering som involverer tre bjelker. Det krever også matching av strålestørrelsen og divergensen til tre laserstråler. En potensiell mulighet til å forbedre begge teknikkene for å overvinne den samtidige tofargersgrensen er inkorporering av en raskt justerbar fiberlaser for å sondere spesifikke spektralregioner21. Behandlingen av bilder er den samme som beskrevet i protokollen for å generere simulerte H&E-bilder.

Til slutt demonstrerer denne protokollen epi-modus SRS-avbildning. Det genererer vanligvis bilder av lavere kvalitet sammenlignet med transmisjonsmodusavbildning for tynne vevsseksjoner på grunn av at den nedre pumpeeffekten når detektoren13. For tykk vevsavbildning (>1-2 mm) eller prøver som er svært spredning (f.eks. beinvev), kan epimodusavbildning fungere bedre enn avbildning i overføringsmodus. Ved avbildning av friskt vev som hjernevev, er SRS-bildedybden vanligvis begrenset til 200-300 μm. For fast vev er spredning sterkere, og bildedybden er 100-200 μm. Dypere bildebehandling kan oppnås med høyere effekt, avvikskorreksjon eller optisk rydding22,23. Likevel er epimodusavbildning en foretrukket tilnærming for vevsdiagnose fordi det ikke krever vevsseksjon, og justeringen er enklere uten den høye NA-kondensatoren. Fremtidige vevsdiagnoseapplikasjoner vil dra nytte av rask, stor arealavbildning på intakte kirurgiske prøver etterfulgt av maskinlæring / dyp læringsbasert diagnose. Protokollen som presenteres her er også egnet for in vivo-applikasjoner, for eksempel hjerneavbildning eller hudavbildning, der epimodusavbildning er det eneste alternativet, og høyhastighetsavbildning er viktig for å unngå bevegelsesartefakter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av NIH R35 GM133435 til D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-100-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter Minicircuits BBP-21.4+ Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-200-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate Union Optic WPA2210-650-1100-M25.4 Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate Union Optic WPA4210-650-1100-M25.4 Broadband quarter waveplate
Beam Sampler THORLABS BSN11 10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror THORLABS DMSP1000 Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 472301 Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator THORLABS EO-AM-NR-C1 Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script Matlab https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer PRL-414B Pulse Research Lab 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode THORLABS DET10A2 Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider PRL-220A Pulse Research Lab TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods Union Optic CYLROD01 High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+ Newport Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. 
Lock-in Amplifier Liquid Instruments Moku Lab Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors THORLABS BB05-E03-10 Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage Zaber X-DMQ12P-DE52 Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor Nikon CSC1003 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope Tektronix TDS7054 Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter SigaTek SF50A2 For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode Hamamatsu Corp S3994-01 Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter Union Optic PBS9025-620-1000 Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database refractiveindex.info
Retro-reflector Edmund Optics 34-408 BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier Minicircuits ZHL-1-2W+ Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors Cambridge Technologies 6215H We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage Vidrio ScanImage Basic Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter THORLABS FESH1000 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope Nikon Eclipse FN1 Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective Olympus XLPLN25XWMP2 The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  2. Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
  3. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  4. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
  5. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  6. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  7. Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
  8. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  9. Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
  10. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  11. Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  14. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  15. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  16. Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
  17. Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
  18. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  19. Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
  20. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  21. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  22. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  23. Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).

Tags

Bioingeniør utgave 180
Sanntids, tofarget stimulert ramanspredningsavbildning av musehjerne for vevsdiagnose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D.… More

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (180), e63484, doi:10.3791/63484 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter