Summary
자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.
Abstract
자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 조직 진단을 위한 강력한 광학 이미징 기술로 부상하고 있습니다. 최근 몇 년 동안 두 가지 색상 SRS는 헤마톡실린과 에오신(H&E)과 동등한 이미지를 제공하여 뇌암을 빠르고 안정적으로 진단할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 기능은 흥미 진진한 수술 중 암 진단 응용 프로그램을 가능하게했습니다. 조직의 두 가지 컬러 SRS 이미징은 피코초 또는 펨토초 레이저 소스로 수행 할 수 있습니다. 펨토초 레이저는 빠른 하이퍼스펙트럼 이미징과 실시간 이색 SRS 이미징을 포함한 유연한 이미징 모드를 가능하게 하는 장점이 있습니다. 처프 레이저 펄스를 사용한 스펙트럼 포커싱 접근법은 일반적으로 높은 스펙트럼 분해능을 달성하기 위해 펨토초 레이저와 함께 사용됩니다.
두 가지 색상 SRS 수집은 직교 변조 및 잠금 감지를 통해 실현할 수 있습니다. 펄스 처핑, 변조 및 특성화의 복잡성은이 방법의 광범위한 채택을위한 병목 현상입니다. 이 기사는 에피 모드에서 마우스 뇌 조직의 스펙트럼 포커싱 SRS 및 실시간 이색 이미징의 구현 및 최적화를 입증하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 SRS의 고속 및 분광학적 이미징 기능을 활용하는 광범위한 SRS 이미징 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.
Introduction
전통적인 조직 진단은 염색 프로토콜에 의존하고 광학 현미경으로 검사합니다. 병리학자가 사용하는 일반적인 염색 방법 중 하나는 H & E 염색입니다 : 헤마톡실린은 세포 핵을 자줏빛 파란색으로 염색하고 에오신 염색은 세포외 매트릭스와 세포질 분홍색을 염색합니다. 이 간단한 염색은 많은 조직 진단 작업, 특히 암 진단을위한 병리학의 황금 표준으로 남아 있습니다. 그러나 H&E 조직병리학, 특히 수술내 환경에서 사용되는 냉동 절편술은 여전히 한계가 있다. 염색 절차는 조직 매립, 절개, 고정 및 염색1과 관련된 힘든 과정입니다. 일반적인 처리 시간은 20분 이상입니다. 동결 단면화 중에 H&E를 수행하는 것은 마진 평가를 위해 3D에서 세포 특징이나 성장 패턴을 평가해야 하기 때문에 여러 섹션을 한 번에 처리할 때 더욱 어려워질 수 있습니다. 또한, 수술 내 조직학 기술은 숙련 된 기술자와 임상의가 필요합니다. 많은 병원에서 보드 인증 병리학자 수의 제한은 많은 경우에 수술 내 상담의 제약입니다. 이러한 한계는 디지털 병리학 및 인공 지능 기반 진단에 대한 빠른 개발 관심으로 완화 될 수 있습니다2. 그러나 H&E 염색 결과는 기술자의 경험에 따라 가변적이어서 컴퓨터 기반 진단2에 추가적인 과제가 있습니다.
이러한 과제는 라벨이 없는 광학 이미징 기술로 잠재적으로 해결할 수 있습니다. 이러한 기술 중 하나는 SRS 현미경 검사입니다. SRS는 동기화된 펄스 레이저(펌프 및 스토크스)를 사용하여 고효율로 분자 진동을 자극합니다3. 최근 보고서에 따르면 단백질과 지질의 SRS 이미징은 손상되지 않은 신선한 조직으로 H & E 등가 이미지 (자극 된 라만 조직학 또는 SRH라고도 함)를 생성 할 수 있으며, 이는 조직 처리의 필요성을 우회하고 진단에 필요한 시간을 크게 단축하며 수술 중 적응되었습니다4. 또한, SRS 이미징은 3D 이미지를 제공할 수 있으며, 이는 2D 이미지가 불충분할 때 진단을 위한 추가 정보를 제공한다5. SRH는 편향되지 않으며 컴퓨터 기반 진단에 쉽게 사용할 수 있는 디지털 이미지를 생성합니다. 그것은 수술 중 암 진단 및 종양 마진 분석, 특히 뇌암 6,7,8에서 가능한 해결책으로 빠르게 등장합니다. 보다 최근에, 조직의 화학적 변화에 대한 SRS 영상화는 임상의가 상이한 암 유형 또는단계 9를 계층화하는 것을 추가로 도울 수 있는 유용한 진단 정보를 제공하기 위해 제안되었다.
조직 진단 응용 분야에서 엄청난 잠재력에도 불구하고 SRS 이미징은 초고속 레이저, 레이저 스캐닝 현미경 및 정교한 검출 전자 장치를 포함하는 이미징 플랫폼과 관련된 복잡성으로 인해 광학 전문 학술 실험실로 대부분 제한됩니다. 이 프로토콜은 실시간 두 가지 색상 SRS 이미징을 위한 일반적인 펨토초 레이저 소스의 사용과 마우스 뇌 조직에서 의사 H&E 이미지의 생성을 입증하기 위한 상세한 워크플로우를 제공합니다. 프로토콜은 다음 절차를 다룹니다.
정렬 및 처프 최적화
대부분의 SRS 이미징 체계는 피코초 또는 펨토초 레이저를 여기 소스로 사용합니다. 펨토초 레이저를 사용하면 레이저의 대역폭이 라만 선폭보다 훨씬 큽니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 스펙트럼 포커싱 접근법은 펨토초 레이저를 피코초 타임 스케일로 처핑하여 좁은 스펙트럼 분해능(10)을 달성하기 위해 사용된다. 최적의 스펙트럼 분해능은 시간적 처프(그룹 지연 분산 또는 단지 분산이라고도 함)가 펌프와 스토크스 레이저에 대해 적절하게 정합될 때만 달성됩니다. 고도로 분산된 유리 막대를 사용하여 레이저 빔의 분산을 최적화하는 데 필요한 정렬 절차 및 단계가 여기에서 시연됩니다.
주파수 보정
스펙트럼 포커싱 SRS의 장점은 펌프와 스토크스 레이저 사이의 시간 지연을 변경하여 라만 여기를 신속하게 조정할 수 있다는 것입니다. 이러한 튜닝은 레이저 파장 튜닝에 비해 빠른 이미징과 신뢰할 수 있는 스펙트럼 수집을 제공합니다. 그러나 여기 주파수와 시간 지연 사이의 선형 관계에는 외부 교정이 필요합니다. 알려진 라만 피크를 갖는 유기 용매는 스펙트럼 포커싱 SRS를 위해 라만 주파수를 교정하는데 사용된다.
실시간 두 가지 색상 이미징
조직 진단 응용 프로그램에서 이미징 속도를 높여 대형 조직 표본을 분석하는 데 필요한 시간을 단축하는 것이 중요합니다. 지질과 단백질의 동시 이색 SRS 이미징은 레이저 또는 시간 지연을 조정할 필요성을 없애고, 이는 이미징 속도를 두 배 이상 증가시킨다. 이것은 새로운 직교 변조 기법 및 록인 증폭기(11)를 이용한 이중 채널 복조를 사용함으로써 달성된다. 이 백서에서는 직교 변조 및 이중 채널 이미지 획득을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
에피 모드 SRS 이미징
현재까지 보여진 SRS 이미징의 대부분은 전송 모드에서 수행된다. 에피모드 영상화는 조직(12)으로부터 후방 산란된 광자를 검출한다. 병리학 적 적용의 경우, 수술 표본은 상당히 클 수 있습니다. 전송 모드 이미징의 경우, 조직 절편화가 종종 필요하며, 이는 바람직하지 않게 추가 시간이 필요합니다. 대조적으로, epi-mode 이미징은 손상되지 않은 수술 표본과 함께 작동 할 수 있습니다. 동일한 목적이 후방 산란광을 수집하는 데 사용되기 때문에 전송 이미징에 필요한 높은 수치 조리개 응축기를 정렬할 필요도 없습니다. Epi-mode는 또한 뼈와 같이 조직 절편이 어려울 때 유일한 옵션입니다. 이전에 우리는 뇌 조직의 경우 에피 모드 이미징이 2mm13의 조직 두께에 대해 우수한 이미징 품질을 제공한다는 것> 입증했습니다. 이 프로토콜은 편광 빔 스플리터 (PBS)를 사용하여 조직에 의해 탈분극 된 산란 광자를 수집합니다. 맞춤형 검출기 어셈블리(12)의 복잡성을 희생시키면서 환형 검출기로 더 많은 광자를 수집할 수 있다. PBS 접근 방식은 구현이 더 간단하며 (형광과 유사), 표준 광 다이오드는 이미 전송 모드 감지에 사용되고 있습니다.
의사 H&E 이미지 생성
두 가지 색상의 SRS 이미지가 수집되면 H&E 염색을 시뮬레이션하기 위해 다시 채색할 수 있습니다. 이 논문은 병리학 적용을 위해 지질 및 단백질 SRS 이미지를 의사 H & E SRS 이미지로 변환하는 절차를 보여줍니다. 실험 프로토콜은 고품질 SRS 이미지를 생성하는 데 필요한 중요한 단계를 자세히 설명합니다. 여기에 표시된 절차는 조직 진단에 적용 가능할 뿐만 아니라 약물 이미징 및 대사 영상(14,15)과 같은 많은 다른 하이퍼스펙트럼 SRS 이미징 응용에도 적용될 수 있다.
일반 시스템 요구 사항
이 프로토콜의 레이저 시스템은 2개의 동기화된 펨토초 레이저 빔을 출력할 수 있어야 합니다. 시스템은 이상적으로 레이저 빔 중 하나의 넓은 파장 튜닝을 위한 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 갖추고 있습니다. 이 프로토콜의 설정은 80MHz의 반복률로 두 개의 레이저(1,040nm에서 하나의 고정 빔과 680nm ~ 1,300nm의 OPO 기반 조정 가능 빔 1개)를 출력하는 상용 레이저 시스템 Insight DS+를 사용합니다. 주요 현미경 제조업체 또는 가정용 레이저 스캐닝 현미경을 SRS 이미징에 사용할 수 있습니다. 활용 된 현미경은 상업용 직립 현미경 프레임 위에 구축 된 직립 레이저 스캐닝 현미경입니다. 한 쌍의 5mm 갈보 거울이 레이저 빔을 스캔하는 데 사용됩니다. 가정용 레이저 스캐닝 현미경을 채택하기로 선택한 사용자는 레이저 스캐닝 현미경(16)의 구축을 위해 이전에 공개된 프로토콜을 참조한다.
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Protocol
모든 실험 동물 절차는 워싱턴 대학의 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜 (# 4395-01)에 따라 200 μm, 고정, 절편화 된 마우스 두뇌로 수행되었다. 야생형 마우스(C57BL/6J 균주)를CO2로 안락사시킨다. 그런 다음 인산염 완충 식염수의 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하기 위해 뇌를 추출하기 위해 두개골 절제술을 실시합니다. 뇌는 3% 아가로스와 0.3% 젤라틴 혼합물에 매립되어 비브라톰에 의해 200μm 두께의 조각으로 절편화된다.
1. 초기 정렬
주: 최상의 감도와 해상도를 위해 두 팔의 빔 크기와 발산이 일치하는지 확인하십시오. 펌프와 Stokes 빔을 대조하고 레이저 스캐닝 현미경에 들어가기 전에 크기를 조정하십시오. 이렇게하려면 이색성 거울에 결합하기 전에 각 빔에 한 쌍의 무색 렌즈를 사용하십시오. 빔 정렬을 위해 항상 적절한 레이저 고글을 착용하십시오.
- 빔 시준
- 펌프 빔을위한 무채색 렌즈 한 쌍을 설치하십시오. 시작점으로 100mm 렌즈와 200mm 렌즈를 사용하여 레이저 빔 크기를 2배 확대합니다. 두 렌즈의 거리가 대략 300mm인지 확인하십시오. 펌프 빔을 두 렌즈의 중심을 통해 정렬합니다.
- 두 번째 렌즈 뒤에 거울을 놓아 빔을 벽 쪽으로 보냅니다 (>1m 거리). 빔을 먼 거리로 보낼 때는주의하십시오. IR 카드로 거울에서 벽까지 빔을 추적하고 빔의 크기가 변하는지 확인하십시오. 빔의 크기가 거리의 함수로 변하는 경우 빔을 시준합니다.
- 빔이 수렴하는 경우(전파에 따라 크기가 감소함) 두 렌즈를 더 가깝게 이동합니다.
- 빔이 갈라지는 경우(전파에 따라 크기가 커짐) 두 렌즈를 더 멀리 떨어뜨립니다. 빔이 시준될 때까지 거리를 조정합니다.
- Stokes 빔에 대해 1.1.1단계와 1.1.2단계를 반복하여 빔을 시준합니다.
- 빔 크기 조정
- 빔 프로파일러를 사용할 수 있는 경우 각 빔에 대해 시준된 빔 크기를 측정합니다. 대안적으로, IR 카드 및 눈금자를 사용하여 빔 크기를 추정하여 4-5 mm의 빔 직경을 얻는다.
- 빔 크기가 너무 작거나 너무 큰 경우 1.1단계에서 사용한 렌즈 쌍을 변경합니다. 두 빔의 직경이 4-5mm가 될 때까지 렌즈 쌍을 조정합니다.
참고: 빔의 배율은 두 번째 렌즈와 첫 번째 렌즈의 초점 거리 사이의 비율입니다(f2/f1).
- 공간 겹침
참고: SRS 이미징은 분자 진동을 자극하기 위해 두 레이저 빔을 공간과 시간에 결합해야 합니다. 스펙트럼 포커싱 SRS 이미징의 개략도가 그림 1에 도시되어 있다.- 조정을 위해 여러 스티어링 미러와 이색성 거울을 설치하여 두 개의 레이저 빔을 결합하십시오. 멀리 떨어진 두 개의 서로 다른 위치 (~ 1m)에서 이색성 거울 뒤의 빔을 모니터링하여 펌프와 스토크스의 공간 중첩을 최적화하십시오. 이색성 및 이색성 거울 앞에 스티어링 미러를 반복적으로 조정하여 스토크스 빔을 펌프 빔과 정렬합니다.
참고: 두 빔이 두 위치에서 공간적으로 겹치는 경우 충분히 겹쳐집니다. - 스캔 미러가 주차 위치에있을 때 한 쌍의 스티어링 미러를 조정하여 결합 된 빔이 레이저 스캐닝 현미경의 스캔 미러의 중앙으로 보내지는지 확인하십시오. 두 빔이 현미경 대물렌즈와 콘덴서의 중심을 통과하는지 확인하십시오.
- 콘덴서 후, 초점 거리가 각각 100mm 및 30mm인 다른 렌즈 쌍을 사용하여 전송된 빔을 광 다이오드에 릴레이합니다. 두 빔이 모두 광 다이오드 내에 포함되어 있는지 확인하고 두 개의 저역 통과 필터를 설치하여 변조된 스토크스 빔을 차단합니다.
- 조정을 위해 여러 스티어링 미러와 이색성 거울을 설치하여 두 개의 레이저 빔을 결합하십시오. 멀리 떨어진 두 개의 서로 다른 위치 (~ 1m)에서 이색성 거울 뒤의 빔을 모니터링하여 펌프와 스토크스의 공간 중첩을 최적화하십시오. 이색성 및 이색성 거울 앞에 스티어링 미러를 반복적으로 조정하여 스토크스 빔을 펌프 빔과 정렬합니다.
2. SRS 신호 검출
- 전기 광학 변조 (EOM)
참고: 20MHz의 EOM은 스토크스 진폭을 변조하는 데 사용됩니다. 후술하는 바와 같이, EOM은 직교 변조에 필요한 80MHz 레이저 펄스 트레인으로부터 유도된다. 단색 또는 하이퍼스펙트럼 SRS만이 수행되는 경우 다른 변조 주파수가 사용될 수 있다. 이 경우 변조 주파수와 레이저 주파수의 동기화가 불필요합니다. RF 전력 증폭기가 있는 주파수 발생기를 사용하여 EOM을 구동할 수 있습니다. 따라서 2.1.1-2.1.4 단계를 건너뛸 수 있습니다.- 빔 샘플러를 스토크스 빔 경로에 배치하여 빔의 10%를 픽업하고 빠른 광 다이오드로 보내 80MHz 펄스 트레인을 감지합니다.
주: 광 다이오드 신호는 주파수 분배기로 전송되어 20MHz TTL 출력을 생성합니다. 이 출력은 팬아웃 버퍼로 추가로 전송되어 출력을 네 개의 동일한 20MHz 출력으로 복제합니다. 출력 중 하나는 오실로스코프를 트리거하는 데 사용됩니다. - 팬아웃 버퍼의 출력 중 하나를 가져와 대역통과 필터로 필터링하여 20MHz 정현파를 얻습니다. RF 감쇠기를 사용하여 출력 피크 대 피크 전압을 ~500mV로 조정합니다.
- 결과 출력을 위상 시프터로 보내면 전압 소스로 RF 위상을 미세하게 조정할 수 있습니다. 이 출력을 RF 전력 증폭기로 보내고 증폭기의 출력을 EOM에 연결합니다.
- 스토크스 빔의 차단을 해제하고 빔 경로에 광 다이오드를 배치하여 EOM1의 변조 깊이를 최적화합니다. EOM 전압 및 반파 플레이트를 변조 깊이(밸리 대 피크 비율)가 만족스럽게 나타날 때까지 조정한다.
참고: 20MHz 변조(레이저 반복률의 1/4)에서 50ns마다 두 개의 펄스가 예상됩니다.
- 빔 샘플러를 스토크스 빔 경로에 배치하여 빔의 10%를 픽업하고 빠른 광 다이오드로 보내 80MHz 펄스 트레인을 감지합니다.
- 시간적 겹침
참고: 펌프와 스토크스의 시간적 중첩은 지연 스테이지에 역반사기가 장착된 두 개의 레이저 펄스 트레인 중 하나를 지연시킴으로써 이루어집니다(그림 1 은 스토크가 지연되는 것을 보여줍니다). 거친 오버랩은 오실로스코프로 모니터링되고, 미세한 오버랩은 SRS 신호에 의해 모니터링됩니다. 미세한 시간적 중첩은 가능한 경우 자동 상관기를 사용하여 달성 될 수도 있습니다.- 이색성 거울 뒤에 광 다이오드를 배치하여 레이저 빔을 감지합니다. 스토크스 빔을 먼저 차단하십시오. 오실로스코프의 펌프 펄스 피크 중 하나를 확대합니다. 수직 커서를 배치하여 이 피크의 시간적 위치를 오실로스코프로 표시합니다.
- 펌프 빔을 차단하고 스토크스 빔의 차단을 해제합니다. 지연 단계를 변환하여 오실로스코프의 피크 위치를 이전 단계의 표시된 위치와 일시적으로 일치시킵니다. 두 빔의 시간적 겹침을 표시하려면 그림 2 를 참조하십시오.
- (선택 사항) 지연 단계의 변환이 두 빔을 일시적으로 일치시키기에 충분하지 않은 경우 지연 단계를 이동 범위의 가운데로 이동합니다.
- 두 빔 간의 시간적 차이를 취하고 그 차이를 빛의 속도에 곱하여 두 빔을 일시적으로 일치시키는 데 필요한 거리의 양을 찾아 두 빔을 일치시키는 데 필요한 지연 거리를 계산합니다.
- 더 빠른 빔의 빔 경로를 길게하거나 느린 빔의 빔 경로를 짧게 하여 그에 따라 시간 지연과 대략적으로 일치시킵니다.
- DMSO 및 양면 테이프를 스페이서로서 사용하여 현미경 슬라이드 샘플을 준비하여 슬라이드와 커버슬립 사이에 샘플을 고정시킵니다.
- 시료를 현미경 표면에 놓고 커버슬립 면이 현미경 목표를 향하도록 합니다. 현미경을 밝은 필드 조명으로 변경하고 아이피스에서 샘플을 관찰하십시오. 먼저 유리 테이프 인터페이스에서 기포의 위쪽 및 아래쪽 레이어에서 초점을 찾은 다음 테이프의 두 레이어 사이에 초점을 이동하여 샘플의 초점을 찾습니다.
주: 아이피스를 들여다보기 전에 레이저 빔이 막혀 있는지 확인하십시오. - 조정 가능한 빔 출력을 798nm로 설정합니다. 콘덴서의 광학 처리량에 따라 목표 초점에서 펌프 및 스토크스 빔에 대해 각각 ~ 40mW가 되도록 광 전력을 조정하십시오.
- MATLAB(또는 현미경을 제어하는 다른 스캐닝 소프트웨어)에서 ScanImage 를 열고 FOCUS 라고 표시된 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
참고: 레이저 빔은 샘플을 통해 래스터 스캔되어 이미지를 생성합니다. 광 다이오드에서 출력되는 저주파 신호(<100kHz)는 데이터 수집 카드의 채널 1(DC 채널이라고 함)로 직접 전송됩니다. 광 다이오드의 고주파 출력(>100kHz)은 록인 증폭기로 전송되고, 록인 증폭기 신호의 X-출력은 데이터 수집 카드의 채널 2(AC 채널이라고 함)로 전송됩니다. - galvo 스캐너 앞의 스티어링 미러를 조정하여 DC 신호를 채널 1 디스플레이에 중앙에 맞춥니다. 전동 지연 스테이지를 이동하고 채널 2(즉, AC 채널) 디스플레이에 표시된 잠금 출력을 면밀히 관찰합니다.
참고: 펌프와 스토크스가 제 시간에 일치하면 AC 채널에 신호가 표시됩니다. AC 채널의 색상 배율을 조정하여 작은 강도 변화를 표시하는 것이 유용합니다. - 시간 지연을 미세하게 조정하여 AC 신호 강도를 최대화합니다. DC 채널을 중앙에 두면서 SRS 신호를 AC 채널의 중앙에 맞추도록 이색성 미러를 조정합니다. 록인 증폭기의 위상을 조정하여 신호를 최대화합니다. 만족스러운 신호에 대해서는 그림 3 을 참조하십시오.
3. 스펙트럼 분해능 최적화
참고: 샘플에 도달하는 펌프 및 스토크스 빔은 스펙트럼 분해능을 최대화하기 위해 동일한 양의 그룹 지연 분산(GDD)을 가져야 합니다. 분산은 실험 설정에 크게 의존합니다. 여기에 설명된 실험 설정은 1,040nm 및 800nm의 펨토초 펄스를 각각 스토크스와 펌프로 사용합니다. 조밀 한 부싯돌 유리 막대 (H-ZF52A)는 펄스 연신 매체로 사용됩니다.
- 48cm의 고분산성 유리 막대(H-ZF52A 또는 이에 상응하는 고밀도 부싯돌 유리)를 800nm 빔 경로에 삽입합니다. Eq (1)을 사용하여 GDD를 추정하십시오.
(1)
참고: 서로 다른 파장의 다양한 유리 재료의 GVD는 굴절률 데이터베이스 리소스에서 찾을 수 있습니다. 예를 들어, H-ZF52A는 800nm에서 220.40fs2/mm의 GVD를 갖는다. 총 GDD는 fs2 105792입니다. - 펌프의 GDD와 일치하도록 1,040nm 빔 경로에 추가하는 데 필요한 분산 유리 막대의 수를 계산합니다. 적절한 길이의 분산 유리 막대를 1,040nm 빔 경로에 삽입하여 800nm 빔의 GDD와 대략 일치시킵니다. 유리 막대를 추가하면 두 빔의 시간적 중첩이 변경되고 지연 조정이 필요할 수 있습니다.
- 스펙트럼 분해능의 교정
- DMSO로 현미경 슬라이드 샘플을 만듭니다. 슬라이드를 현미경 위에 놓고 현미경 콘덴서에서 나오는 빔의 힘을 확인하십시오. 샘플 초점에서 각각 ~ 40mW를 갖도록 그에 따라 전력을 조정하십시오.
- MATLAB에서 ScanImage를 엽니다. DMSO의 2,913 cm-1 라만 피크에 해당하는 지연 단계를 통해 스캐닝함으로써 최대 SRS 신호를 찾으십시오. 막대의 삽입으로 인해 증가된 광 경로 길이로 이전 단계 위치를 기준으로 스테이지 위치를 추정합니다. 유리 막대가 추가될 때 빔의 편차가 작기 때문에 빔 공간 중첩을 다시 정렬합니다.
- 전동 스테이지를 이동하는 동안 일련의 SRS 이미지를 순차적으로 촬영하여 하이퍼스펙트럼 SRS 스캔을 저장합니다.
참고: 지연 스캔 범위는 DMSO의 2,913cm-1 및 2,994cm-1 라만 피크에 해당하는 두 개의 라만 피크를 포함합니다. 이 두 가지 전환은 800nm 펌프와 1,040nm 스토크스 레이저를 사용할 때 관찰됩니다. - ImageJ 또는 MATLAB을 사용하여 DMSO 솔루션의 SRS 스펙트럼을 플로팅합니다. 대형 DMSO 2,913cm-1 피크를 MATLAB의 가우시안 또는 로렌치안 함수에 맞추어 피크의 FWHM(절반 최대)에서 전체 너비를 계산합니다.
참고: 대표적인 결과는 그림 4에 나와 있습니다. 하나의 넓은 피크만 존재하는 경우, 이는 스펙트럼 분해능이 너무 불량하여 두 피크를 구별할 수 없고 더 많은 유리 로드가 필요하거나 스캔된 범위가 너무 작아서 두 번째 피크를 감지할 수 없음을 의미합니다. 일반적으로 허용 가능한 스펙트럼 분해능 DMSO는 >60cm의 유리 막대 길이가 사용될 때 ~ 20-25cm-1 입니다. 더 낮은 분해능은 더 짧은 펄스(17)를 갖는 더 높은 신호를 위해 거래하기 위해 조직 영상화에 종종 사용된다.
- (선택 사항) 자동 상관기 또는 FROG(주파수 분해 광학 게이팅)를 사용하여 각 암의 펄스 지속 시간을 결정하여 GDD의 양과 펌프와 스토크스 사이의 GDD를 일치시키는 데 필요한 막대의 길이를 정확하게 계산합니다.
- Stokes 빔의 다양한 막대 길이에 대해 3.3.2-3.3.4단계를 반복하여 최적의 스펙트럼 분해능을 찾으며, 이는 실험적으로 최상의 GDD 일치가 발견되었음을 의미합니다. 최적의 스펙트럼 분해능을 얻기 위해 길이가 다른 여러 세트의 유리 막대를 사용하십시오.
(1)4. 신호 대 잡음 (SNR) 특성화
- 4.2단계가 완전한 공간 및 시간 정렬 후에 수행되는지 확인하십시오.
- DMSO의 2,913 cm-1 라만 피크에 대응하는 SRS 이미지를 획득한다. ImageJ에서 이미지를 열고 프레임 중앙의 작은 영역을 선택합니다. 측정 값 함수를 사용하여 선택한 영역에서 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다.
- 선택한 영역의 평균값을 표준 편차로 나누어 Eq (2)에서와 같이 SNR 값을 찾습니다.
(2)
주: 양쪽 팔에 초점을 맞춘 40mw/40mw의 DMSO를 사용하는 시스템(잠금 시간 상수가 4μs인 경우)에 적합한 SNR은 >800입니다. 데이터 수집 카드가 제한된 비트 깊이를 갖는 경우 더 낮은 농도의 DMSO 또는 더 낮은 전력을 SNR의 보다 정확한 추정에 사용할 수 있습니다. - SNR이 너무 낮으면 레이저 펄스를 다시 정렬하여 공간 중첩, 시간 중첩, 빔 크기/시준 일치 및/또는 분산 정합을 최적화합니다. 수차 보정 칼라가 있는 목표의 경우 보정 칼라를 조정하여 신호를 최적화합니다.
(2)5. 주파수 축 교정
참고: 이 단계는 지연 단계 위치를 스캔한 라만 전이와 관련시키기 위해 수행됩니다. 적절한 "라만 통치자"를 생성하기 위해서는 용매의 신중한 선택이 필요합니다. DMSO는 2,913 cm-1 및 2,994 cm-1에서 두 개의 날카로운 라만 피크를 가지고 있기 때문에 CH 결합에 효과적인 용매입니다.
- DMSO의 2,913cm-1 및 2,994cm-1 라만 피크를 커버하는 지연 단계 범위로 하이퍼스펙트럼 스캔을 저장합니다. 하이퍼스펙트럼 데이터 세트에 해당하는 스테이지 위치를 저장합니다.
참고: 스펙트럼의 글로벌 최대 피크는 DMSO 2,913 cm-1 라만 시프트에 해당하고 두 번째 최대 피크는 DMSO 2,994 cm-1 라만 시프트에 해당합니다. - 스테이지 위치에 대해 선형 회귀를 수행하고 라만 시프트는 2,913cm-1 및 2,994cm-1에서 수행합니다. 스테이지 위치와 라만 시프트를 관련된 선형 회귀 방정식을 사용하여 지연 위치를 해당 라만 주파수로 변환합니다.
6. 직교 변조 및 두 가지 색상 이미징
참고: 직교 변조 단계는 실시간 두 가지 색상 이미징이 필요한 경우에만 필요합니다. 이 체계의 개략도는 그림 5에 나와 있습니다. 직교 변조는 레이저 주파수의 분기(80MHz 레이저의 경우 20MHz)에서 구동되는 한 쌍의 EOM을 사용하며 둘 사이에 90° 위상 이동이 있습니다. 이러한 직교 변조 단계는 단색 SRS 이미징 또는 하이퍼스펙트럼 SRS 이미징을 위해 건너뛸 수 있다.
- EOM1 변조
- PBS(PBS2), 쿼터웨이브 플레이트(QWP2) 및 두 번째 EOM(EOM2)을 첫 번째 EOM 이후의 스톡스 빔 경로에 설치합니다. EOM2에 대한 신호 입력을 뽑습니다. 신호 입력을 EOM1에 연결하고 켭니다.
- 첫 번째 EOM을 통해 빔을 전송하여 20MHz(f 0/4)에서 스토크스 빔(1,040nm로 고정)을 변조합니다. EOM1의 기울기와 위치를 조정하여 빔이 EOM 크리스탈을 통해 직선과 중앙에 닿도록 합니다.
- 두 개의 광 다이오드로 PBS1에서 나오는 두 편광을 관찰하고 오실로스코프에 변조를 표시하여 변조 깊이를 모니터링합니다.
- QWP1, EOM1 전압 및 20MHz 입력의 위상을 조정(위상 시프터 사용)하여 전송된 빔의 변조 깊이를 100%에 가깝게 최적화합니다. 양호한 변조 깊이의 예는 그림 2B 를 참조하십시오.
- EOM2 변조
- EOM1의 플러그를 뽑고 EOM2를 연결합니다.
- 20MHz에서 두 번째 증폭기의 고전압 출력을 EOM2로 보냅니다. EOM2의 기울기와 위치를 조정하여 빔이 EOM 크리스털을 통해 직선과 중앙에 닿도록 합니다.
- 다시 한번, 오실로스코프를 사용하여 PBS2에서 나오는 두 편광을 모두 관찰하여 변조 깊이를 모니터링합니다. 필요에 따라 QWP2, EOM2 전압 및 위상 시프터를 조정하여 두 편광 모두에 대해 거의 100% 변조를 달성하십시오.
- 펄스 트레인 변조가 첫 번째 변조에서 90° 위상 시프트를 갖는지 확인하십시오.
참고: 두 펌프 펄스 트레인이 90° 직교하지 않으면 두 채널 간의 누화가 문제가 됩니다. - EOM1 및 EOM2를 모두 켜고 연결하여 변조의 직교성을 테스트합니다. PBS2에 의해 분할되는 두 편광을 오실로스코프로 모니터링합니다. EOM1 및 EOM2를 개별적으로 재최적화하는 것은 제2 PBS 이후의 펄스 트레인이 도 2C와 유사하지 않은 경우이다.
- EOM2의 20mm 복굴절성 석영 수정(BRC) 및 HWP 다운스트림에 설치합니다. 두 EOM을 한 번에 연결하고 펄스 트레인이 그림 2D와 유사하도록 모니터링합니다.
참고: 이 실험에 사용된 처프의 경우, 20mm BRC는 80cm-1 라만 시프트에 해당하는 시간 지연을 유도합니다. 다른 처프가 사용되는 경우 다른 BRC 길이가 필요할 수 있습니다.
- 교정
- 록인 증폭기 X 및 Y 채널 출력(데이터 수집 카드의 채널 2 및 3으로 전송)에서 신호를 감지하여 DMSO를 사용하여 시스템을 교정합니다.
- 더 빠른 편광에서 2,913cm-1 피크에 의해 생성된 신호와 느린 편광으로 인해 발생하는 신호가 록인 증폭기에서 위상을 벗어나 90°에 가까운지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 두 신호가 위상을 벗어나 90°에 가까워질 때까지 EOM 정렬을 조정하십시오.
- 교정이 완료되면 직교 빔 중 하나에 대해 2,930cm-1에서 단백질 전이를 조사하는 지연 위치를 찾으십시오. 다른 분극 프로브가 2,850 cm-1의 지질 전이가 있는지 확인한다.
7. 에피 모드 SRS 이미징
참고: 전송 모드 이미징 방식에서 목표는 레이저를 샘플에 집중시킨 다음 콘덴서 렌즈가 전송된 빔을 광 다이오드로 향하게 하여 잠금 감지를 수행합니다. 에피모드 이미징 방식에서, 샘플에 의해 후방 산란 및 탈분극되는 빛은 초점 목표에 의해 재수집되고 편광 빔 스플리터를 사용하여 분리된다. 절연 및 후방 산란 광자는 잠금 감지를 위해 한 쌍의 릴레이 렌즈를 통해 광 다이오드로 전송됩니다. 도 6은 에피모드 이미징 스킴을 도시한다.
- 빔이 현미경에 들어가기 전에 HWP를 설치하여 현미경으로 들어가는 빔의 편광을 변경하십시오. PBS를 목표 위에 놓아 탈분극된 역반사 빔이 검출기에 도달할 수 있도록 한다.
- 75mm 무채색 렌즈와 30mm 비구면 렌즈로 구성된 한 쌍의 렌즈를 사용하여 목표물의 후면 조리개에서 광검출기로 후방 산란 광자를 릴레이하십시오. PBS에 의해 지시된 후방 산란광을 수집하기 위해 검출기를 장착한다. 필터를 설치하여 변조된 빔이 검출기에 들어가는 것을 차단합니다.
- 조직 샘플을 목표 아래에 놓습니다. 에피 모드 이미징에는 콘덴서가 필요하지 않으므로 더 많은 공간이 필요한 경우 콘덴서를 제거하십시오.
- 이미징
- 셔터로 빔을 차단하십시오. 측면에서 샘플에 흰색 광원을 비추십시오. 밝은 필드를 사용하여 객관적인 초점을 찾으십시오.
- 두 빔의 차단을 해제하고 사전 보정된 지연 위치를 사용하여 록인 증폭기의 두 출력에서 조직으로부터 지질 및 단백질 SRS 이미지를 획득합니다.
- 잠금 게인 및 픽셀 빈 계수를 조정하여 좋은 품질의 이미지를 얻을 수 있습니다.
8. 거짓 색깔 염색
- ImageJ로 이미지 스택을 엽니다.
- 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복제를 클릭하여 지질 (2,850cm-1) 및 단백질 (2,930cm-1) 종에 해당하는 두 개의 이미지를 꺼냅니다.
- 지질 이미지의 이름을 지 질 로, 단백질 이미지를 단백질로 바꿉 니다.
- 프로세스 |로 이동 이미지 계산기 및 수행 단백질은 지질을 뺍니다.
- 이미지 |로 이동하여 이미지 결합 색상 | 채널을 병합하여 지질을 녹색으로, 단백질을 파란색으로 설정합니다. 이미지 채널 도구 열기(이미지 | 색상 | 채널 도구) 및 밝기와 대비를 조정 (이미지 | | 조정 밝기/대비).
- 채널 도구를 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다. 지질 채널의 경우, 세포 특징이 어두워 보일 때까지 대비를 조정하십시오. 단백질 채널의 경우 세포 특징이 파란색으로 나타날 때까지 대비를 조정하십시오. 이미지 |로 이동하여 병합된 채널 녹색/파란색 이미지를 RGB 이미지로 변환합니다. 유형 | RGB 색상. 파일 |별로 이 이미지 내보내기 |한 이름으로 저장 티프.
참고 : 거짓 H & E 염색의 경우, 색 구성표는 분홍색 세포질을 보여 주며 핵은 진한 파란색 - 자주색입니다. - 재료 표의 잘못된 H&E 염색 스크립트 리소스에서 HE.m MATLAB 스크립트를 다운로드합니다.
- MATLAB에서 HE.m 스크립트를 실행합니다. 이전 단계에서 내보낸 RGB 이미지를 선택하여 인위적으로 H&E 염색된 이미지를 생성합니다.
- (선택 사항) 큰 시야각 이미징의 경우 이미지가 중앙보다 주변에서 더 어둡게 보이기 때문에 이미지 강도를 정규화합니다.
- 이미지의 필드 정규화를 수행하려면 가능한 한 많은 이미지를 평균화합니다. 그런 다음 ImageJ(프로세스 |를 사용하여 강도 피쳐를 제거합니다. 필터 | 가우시안 블러 | 반지름=50).
- 흐리게 표시된 이미지의 최대 강도를 측정합니다(Ctrl+M). 흐린 이미지를 최대 강도로 나눕니다 (프로세스 | 수학 | 나누기). 흐리게 표시된 이미지로 원시 SRS 이미지를 분할합니다(프로세스 | 이미지 | 계산기).
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Representative Results
스펙트럼 분해능 최적화:
물질을 통한 분산은 분산 매질(길이 및 물질) 및 파장에 의해 영향을 받는다. 분산봉 길이를 변경하면 스펙트럼 분해능과 신호 크기에 영향을 미칩니다. 그것은 응용 프로그램에 따라 다르게 무게가 가질 수있는 주고받는 관계입니다. 막대는 빔 펄스를 주파수가 넓고 시간이 좁아지는 것에서 주파수가 좁고 시간이 넓어지는 것까지 뻗어 나갑니다. 그림 7은 다양한 막대 길이가 스펙트럼 분해능에 미치는 영향을 보여줍니다. 도 7A는 매우 불량한 스펙트럼 분해능을 보여준다; 이 설정에는 유리 짹짹 거리는 막대가 없으며 DMSO의 두 라만 피크는 전혀 해결되지 않습니다. 그림 7B,C에서, 유리 짹짹 막대의 수의 증가는 두 피크를 해결하기 시작한다. 마지막으로, 그림 7D는 일치하는 처핑이 두 피크를 모두 해결하고 스테이지 위치를 주파수로 보정하는 데 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다.
DMSO를 사용한 교정:
DMSO는 C-H 영역에서 교정에 편리한 2,913 및 2,994cm-1 에서 두 개의 날카로운 라만 피크를 가지고 있습니다. 일단 DMSO 스펙트럼이 하이퍼스펙트럼 SRS 스캔으로부터 얻어지면, 간단한 선형 회귀는 스테이지 위치를 라만 시프트로 변환한다. 스펙트럼 분해능이 불량하고 ( 그림 7A에 표시된 것처럼) 두 피크가 분리 할 수없는 경우 선형 회귀로 보정 할 수 없습니다. 이 경우 유리 막대를 추가하거나 제거하여 더 나은 분산 정합이 필요합니다. 보정을 위해 DMSO 신호를 찾는 데 있어 가장 일반적인 어려움은 두 빔의 시간적 중첩 또는 공간 중첩의 오류 때문입니다. DMSO 보정을 시도하기 전에 공간 및 시간 정렬 단계를 반복하여 SRS 신호를 최적화합니다.
두 가지 색상 DMSO :
두 가지 컬러 SRS에서, 두 개의 펌프 펄스 트레인은 고정된 시간 지연(복굴절성 결정으로 인해)과 함께 직교 분극으로 생성된다. 변조 깊이 및 90° 위상 시프트의 평가는 DMSO SRS 신호에 이어 광 다이오드로 수행됩니다. 그림 8은 허용 가능한 변조 깊이 및 시간 분리를 보여줍니다. 도 8 에서 DMSO의 스펙트럼 분해능이 이상적이지는 않지만, 더 짧은 펄스로 더 높은 신호를 달성하기 위해 조직 영상 실험에서 종종 희생된다. 그림 9는 반전 또는 음의 피크를 발생시키는 불량한 위상 이동을 보여줍니다.
에피 모드에서 마우스 뇌 조직의 두 가지 색상 SRS :
에피 모드 (후방 산란 광자 검출) SRS는 두꺼운 조직 (>1 mm)을 이미징하는 데 사용됩니다. 도 10A,B는 생체외 마우스 뇌 조직의 2,850 cm-1 및 2,930 cm-1에서 실시간 2색 SRS 이미징을 시연한다. 지질 및 단백질 채널로부터의 원시 이미지(도 10A,B)는 지질 및 단백질 기여도를 묘사하는 단일 이미지를 생성하도록 컬러 코딩되었다(도 10C). H&E 염색을 모방하기 위해 도 10C에서 거짓 H&E 염색을 수행하였다(도 10D). 이미징 품질이 좋지 않으면 이미징 깊이가 크거나 보정 불량(주파수 축 또는 변조 깊이)이 불량할 수 있습니다. 뇌 조직의 전형적인 영상 깊이는 100-200 μm13입니다.
그림 1: 단색 SRS 이미징 설정의 회로도. 전송 모드에서 스펙트럼 포커싱 SRS 현미경의 구성. X와 Y는 직교 출력을 나타냅니다. 약어: SRS = 자극된 라만 산란; DL = 역반사기 기반 지연 라인; Div = 분배기; FB = 팬아웃 버퍼; AT = 감쇠기; PS = 위상 시프터; PA = 전력 증폭기; DCM = 이색성 거울; GM = 갈보 거울; EOM = 전기 광학 조절제; POM = 픽업 미러; PBS = 편광 빔 스플리터, BRC = 복굴절성 결정; QWP = 쿼터 웨이브 플레이트; HWP: 반파판; PD = 광 다이오드; GR = 유리 막대; BB = 빔 블록; SPF = 단축 필터; CL = 시준하는 렌즈; BS = 빔 크기 변경 렌즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대표적인 시간적 중첩 . (A) 펌프와 스토크스 빔은 오실로스코프에서 일시적으로 겹쳐진 것으로 보입니다. 오실로스코프 커서는 펌프와 스토크스 빔의 시간 위치를 표시하는 데 사용됩니다. 이러한 중첩은 지연 단계와 시간적 중첩을 추가로 조정하기 위한 시작점으로 만족스럽습니다. (B) 20MHz에서 하나의 EOM의 만족스러운 대표적인 변조 깊이. (C) 두 개의 EOM이 사용 중일 때 만족스러운 펄스 변조. (D) 이중 변조된 스토크스 암에 복굴절성 석영 결정 및 반파 플레이트 설치 후 만족스러운 펄스 트레인 변조. 약어: EOM = 전기 광학 변조기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표적인 SRS 및 펌프 신호. (A) DC 채널에서 잘못 정렬된 펌프 신호가 감지되었습니다. (B) 광 다이오드에 의해 검출된 잘못 정렬된 SRS 신호. (C) DC 채널에서 만족스럽고 중심적인 펌프 신호. (d) AC 채널을 중심으로 한 만족스러운 SRS 신호. 약어: SRS = 자극된 라만 산란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 스펙트럼 분해능 특성화. 가우시안 기능은 2,913 cm-1 라만 DMSO 피크에 적합하였다. FWHM은 시스템에 대해 15cm-1 의 해상도를 계산했습니다. 약어: DMSO = 디메틸설폭사이드; FWHM = 최대 절반의 전체 너비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 두 가지 색상 SRS 이미징 설정의 회로도. 전송 모드에서 두 가지 컬러 SRS 현미경의 구축. X와 Y는 직교 출력을 나타냅니다. 약어: DL = 역반사기 기반 지연 라인; Div = 분배기; FB = 팬아웃 버퍼; AT = 감쇠기; PS = 위상 시프터; PA = 전력 증폭기; DCM = 이색성 거울; GM = 갈보 거울; EOM = 전기 광학 조절제; PBS = 편광 빔 스플리터; BRC = 복굴절성 결정; QWP = 쿼터 웨이브 플레이트; HWP = 반파판; PD = 광 다이오드; GR = 유리 막대; BB = 빔 블록, SPF = 단거리 통과 필터; CL = 시준하는 렌즈; POM = 픽업 미러; BS = 빔 크기 변경 렌즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 두 가지 색상 SRS 이미징 Epi 모드 설정의 회로도. 에피 모드에서 두 가지 컬러 SRS 현미경의 구축. X와 Y는 직교 출력을 나타냅니다. 약어: DL = 역반사기 기반 지연 라인; Div = 분배기; FB = 팬아웃 버퍼; AT = 감쇠기; PS = 위상 시프터; PA = 전력 증폭기; DCM = 이색성 거울; GM = 갈보 거울; EOM = 전기 광학 조절제; PBS = 편광 빔 스플리터; BRC = 복굴절성 결정; QWP = 쿼터 웨이브 플레이트; HWP = 반파판; PD = 광 다이오드; GR = 유리 막대; BB = 빔 블록, BPF = 대역 통과 필터; CL = 시준하는 렌즈; POM = 픽업 미러; BS = 빔 크기 변경 렌즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 25% DMSO로 스펙트럼 분해능을 최적화 . (A) 제로 유리 처핑 로드를 사용하여 DMSO 스펙트럼을 얻었다. 두 봉우리가 해결되지 않습니다. (B) 유리 처핑 막대를 사용하였고, 펌프 암에는 20cm, 스토크스 암에는 24cm를 사용하였다. 두 개의 피크가 만족스러운 지점으로 해결되기 시작합니다. (c) 더 나은 분해된 DMSO 스펙트럼을 얻기 위해 40cm 길이의 펌프 및 24cm 길이의 스톡스, 치핑 로드를 사용하였다. (D) 더 높은 스펙트럼 분해능을 얻기 위해 치핑 막대, 64cm 길이 펌프 및 60cm 길이의 스톡을 사용하였다. 약어: DMSO = 디메틸설폭사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 두 가지 색상 SRS, 다양한 편광 및 시간 지연. 직교 편광(s&p)의 두 개의 시간-지연 펄스 트레인은 SRS 여기 사이의 시간 지연(및 라만 주파수 차이)을 보여주기 위해 DMSO 스펙트럼을 이미지화하는데 사용된다. 약어: DMSO = 디메틸설폭사이드; SRS = 라만 산란을 자극하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 불량한 두 가지 색상 SRS 위상 이동으로 인한 SRS 스펙트럼. 스테이지 위치(48) 근처의 음의 2,994cm-1 피크는 불량한 위상차를 나타낸다. 약어: SRS = 자극된 라만 산란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: SRS 이미지의 거짓 두 가지 색상 H&E 염색의 생성. (a) 2,930 cm-1 전이에서 마우스 뇌 조직으로부터의 원시 단백질 SRS 이미지. (b) 2,850 cm-1 전이에서 마우스 뇌 조직으로부터의 생 지질 SRS 이미지. (C) A 와 B 의 병합 및 색상 코드 채널로, 녹색의 지질 기여와 파란색의 단백질 기여. (D) 병리학적 적용을 위해 H&E 염색을 모방하기 위해 C 에 대해 거짓 H&E 재착색을 수행하였다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: SRS = 자극된 라만 산란; H&E = 헤마톡실린과 에오신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에 제시된 두 가지 색상 SRS 이미징 체계는 단색 SRS 이미징의 적절한 구현에 달려 있습니다. 단색 SRS 이미징에서 중요한 단계는 공간 정렬, 시간 정렬, 변조 깊이 및 위상 이동입니다. 두 빔을 공간적으로 결합하는 것은 이색성 거울에 의해 달성된다. 여러 스티어링 미러는 빔을 이색성 거울로 보낼 때 미세 조정에 사용됩니다. 빔이 이색성 미러와 결합되면 결합 된 빔이 IR 카드와 겹치는지 확인하는 동안 >1m 떨어진 벽쪽으로 보내기 위해 거울과 결합 된 빔 경로를 선택하여 공간 정렬을 확인할 수 있습니다. 현미경을 통한 공간 정렬에 따라, 시간적 중첩은 역반사기 기반 지연 단계로 경로 길이를 조정함으로써 수행되며, 이는 공간 정렬을 보존하는 이점이 있다. 1,040nm 암은 이 프로토콜에서 지연된 빔입니다. 지연 스테이지가 두 빔이 일시적으로 겹치도록 하는 범위를 갖지 않는 경우 시간적 중첩은 불가능합니다. 이 경우, 시간적 중첩이 지연 스캔 범위의 중간에가까운지 확인하기 위해 전체 지연 스테이지를 다른 위치로 이동해야 할 수도 있다. 예를 들어, 두 빔 사이의 시간적 차이가 6ns로 측정되면 1.8m의 조정이 필요합니다. 필요한 조정은 더 빠른 빔에 대한 빔 경로의 신장 길이 또는 느린 빔에 대한 빔 경로의 단축을 나타냅니다.
정렬 외에도 SRS 신호를 최대화하기 위해 Stokes 빔의 빔 크기 정합 및 변조도 중요합니다. 이상적으로는 두 빔을 목표 평면에서 시준하고 목표 백 조리개 크기와 일치해야합니다. 목표 평면이 사용자에게 노출되는 경우 시준 및 빔 크기를 확인하는 것이 유용합니다. 빔이 수렴 또는 발산되는 경우, 시준을 달성하기 위해 시준 렌즈 쌍의 두 번째 렌즈를 조정할 필요가 있다(프로토콜 단계 1.1). 마찬가지로, 목표 백 조리개에서 빔 크기가 너무 작으면 배율이 높은 렌즈 쌍을 사용해야 합니다(프로토콜 단계 1.2). SRS는 스토크스 빔의 변조 깊이에 따라 선형으로 스케일링됩니다. 밸리의 펄스 높이가 오실로스코프의 피크에서 펄스 높이의 <10%가 되도록 하는 것이 중요합니다. Stokes 빔의 불량한 변조는 불량한 SNR로 직접 변환됩니다.
SRS 이미징을 위해 펨토초 레이저를 사용할 때, 펌프와 스토크스 사이의 시간 지연을 라만 주파수 시프트로 변환하기 위해서는 스펙트럼 초점이 필요합니다. 변환 계수는 적용된 처프의 양에 따라 달라집니다. 최적의 스펙트럼 분해능을 달성하기 위해서는 펌프와 스토크스의 GDD를 일치시키는 것이 중요합니다. GDD는 사용된 분산 물질의 길이 및 그의 GVD에 기초하여 추정될 수 있다. 예를 들어, SF11 조밀 한 부싯돌 유리봉은 1,040nm에서 123.270 fs 2 / mm의 GVD와 800 nm에서 187.486 fs2 / mm의 GVD를 가지고 있습니다. 800nm 빔 경로에서 240mm의 SF11의 경우 GDD는 240mm × 187.486fs2/mm = 45,000fs2입니다. 1,040nm 빔 경로에서 240mm의 SF11의 경우 GDD는 240mm× 123.270fs2/mm = 30,000fs2입니다. 이 예제 계산은 1,040nm 암에 추가 유리 막대를 추가하거나 GDD와 일치하도록 800nm 암에서 유리 막대를 제거해야 함을 의미합니다. 더 높은 스펙트럼 분해능을 달성하려면 더 큰 GDD가 필요하며, 이는 더 긴 막대를 의미합니다. 그러나 GDD를 계산할 때 EOM의 기여도와 목표는 무시되었습니다. GDD의 실제 정합은 펌프 또는 스톡스에서 주어진 막대 길이에 대한 최상의 스펙트럼 분해능을 찾아 실험적으로 결정됩니다. 계산은 좋은 시작 단계로 작용합니다. 반복적 인 추가 및 유리 막대 제거를 통한 실험적 최적화는 스펙트럼 분해능을 최적화하기 위해 여전히 필요합니다.
큰 처프는 더 높은 스펙트럼 분해능을 제공하지만 신호 강도를 희생한다는 것을 깨닫는 것이 중요합니다. 더 작은 처프와 짧은 펄스는 단백질과 지질 라만 피크가 넓기 때문에 C-H 영역의 조직 이미징에 유용합니다. 더 낮은 스펙트럼 분해능은 두 가지 컬러 조직 콘트라스트(17)를 희생하지 않으면서 더 높은 SRS 신호(또는 더 빠른 이미징 속도)에 대해 거래될 수 있다. 높은 스펙트럼 분해능이 필요한 다른 응용 분야에서, 특히 지문 영역에서는 긴 유리 막대를 사용하여 더 큰 처프를 적용해야합니다. 또는 격자 들것을 사용하여 더 긴 펄스를 얻는 것이 더 쉬울 수도 있습니다 (3ps보다 긴 펄스 지속 시간의 경우). 그러나, 이용된 상용 레이저의 하나의 주요 한계는 그의 스펙트럼 대역폭이다. 스펙트럼 초점 SRS의 스펙트럼 커버리지는 여기 레이저의 대역폭에 따라 달라집니다. 활용된 레이저 시스템은 일반적으로 약 200-250cm-1의 스펙트럼 커버리지를 갖는다. 이것은 C-H 영역을 커버하기에 거의 충분하지 않습니다. 일반적으로 지문 영역에서 이미징을 위해 화학 종을 해결하기 위해 더 큰 스펙트럼 커버리지가 필요합니다. 이 문제는 Stokes 레이저의 대역폭을 6nm에서 60nm로 넓히는 파이버 레이저 애드온으로 해결할 수 있습니다18. 두 가지 색상 SRS 이미징 기술의 또 다른 중요한 한계는 두 개의 전환만 모니터링된다는 것입니다. 이 접근법은 많은 겹치는 라만 피크 또는 여러 종을 가진 복잡한 샘플에는 적합하지 않습니다.
실시간 이색 SRS 이미징 방법은 레이저 또는 지연 튜닝의 필요성을 제거함으로써 고속 조직 이미징을 제공합니다. 그러나 두 EOM 모두에 대해 거의 완벽한 변조 깊이를 달성하는 데 어려움이 있기 때문에 설정하기가 어렵습니다. EOM1 및 EOM2를 독립적으로 최적화하는 것이 가장 좋습니다. EOM1이 켜져 있는 경우 EOM2의 플러그를 뽑아야 하며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 두 변조가 거의 완벽에 가까운(>95% 변조 깊이)에 최적화되면 두 EOM이 모두 연결되어 직교 변조가 가능합니다. 두 직교 펄스 트레인 사이의 시간 지연의 길이는 BRC와 처프의 길이에 의존한다. 이 변조 방법은 두 EOM을 구동하기 위해 조정 가능한 위상 이동이 가능한 두 개의 RF 펄스 트레인을 제공하기 위해 복잡한 전자 장치가 필요하기 때문에 임상 응용 제품에서 즉시 실현 가능하지 않습니다. EOM의 정렬은 또한 두 채널 간의 높은 전송, 양호한 변조 및 직교를 보장하기 위해 거의 완벽해야합니다. 이 기술은 일반적으로 움직임 또는 샘플 변경으로 인해 두 개의 라만 피크를 빠르고 동시에 이미징해야 하는 다른 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 예로는 지질 액적 또는 소기관(11,19)과 같은 수온 측정 또는 이동 물체의 추적이 포함된다.
미래의 임상 적용을 위해 견고한 파이버 레이저가 필요합니다4. 프로토콜에 의해 설명된 접근법은 또한 비디오 속도까지 획득 속도를 향상시키기 위해 확장될 수 있으며, 이는 합리적인 시간 내에 큰 조직 표본을 스캔하는 것이 중요하다. 이미징 시간 또는 모션 아티팩트가 중요하지 않은 경우, 단백질 및 지질 SRS 이미지는 전동식 지연 스테이지를 프레임별로 이동함으로써 순차적으로 획득될 수 있다. 또 다른 실시간 이색 SRS 이미징 방법은 동일한 두 개의 직교 채널(20)을 제공하기 위해 스토크스 빔을 재활용하는 이중 위상 방식이다. 그러나 이중 위상 체계를 구현하려면 세 개의 빔을 포함하는 추가 정렬이 필요합니다. 또한 빔 크기와 세 개의 레이저 빔의 발산을 일치시켜야합니다. 동시 이색 한계를 극복하기 위해 두 기술을 모두 개선하기 위한 잠재적 수단은 특정 스펙트럼 영역(21)을 프로브하기 위해 빠르게 튜닝 가능한 파이버 레이저를 혼입하는 것이다. 이미지 처리는 시뮬레이션된 H&E 이미지를 생성하기 위한 프로토콜에 설명된 것과 동일합니다.
마지막으로, 이 프로토콜은 에피모드 SRS 이미징을 시연한다. 전형적으로 검출기(13)에 도달하는 더 낮은 펌프 전력 때문에 얇은 조직 절편에 대한 전송 모드 이미징에 비해 낮은 품질의 이미지를 생성한다. 두꺼운 조직 이미징 (>1-2 mm) 또는 고도로 산란되는 샘플 (예를 들어, 뼈 조직)의 경우, 에피 모드 이미징은 전송 모드 이미징보다 더 잘 수행 할 수 있습니다. 뇌 조직과 같은 신선한 조직을 이미징하는 경우, SRS 이미징 깊이는 전형적으로 200-300 μm로 제한된다. 고정 조직의 경우 산란이 더 강하고 이미징 깊이는 100-200 μm입니다. 더 깊은 이미징은 더 높은 전력, 수차 보정 또는 광학 클리어링22,23으로 달성 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 에피모드 영상화는 어떠한 조직 절편도 필요로 하지 않기 때문에, 조직 진단을 위한 바람직한 접근법이며, 높은 NA 응축기 없이 정렬이 더 간단하다. 미래의 조직 진단 응용 프로그램은 손상되지 않은 수술 표본에 대한 신속하고 넓은 영역 이미징과 기계 학습 / 딥 러닝 기반 진단의 이점을 누릴 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 에피 모드 이미징이 유일한 옵션인 뇌 영상 또는 피부 이미징과 같은 생체 내 응용에도 적합하며, 모션 아티팩트를 피하기 위해 고속 이미징이 중요합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
본 연구는 NIH R35 GM133435 내지 D.F.에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
| 20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
| Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
| Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
| Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
| False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
| Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
| Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
| Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
| Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
| Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
| Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
| Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
| Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
| Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
| RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω |
| Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
| Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
- Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
- Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
- Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
- Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
- Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
- Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
- Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
- He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).
