Summary
Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico per l'analisi delle alterazioni del microbiota intestinale murino durante lo sviluppo della malattia autoimmune.
Abstract
Il microbiota intestinale ha un ruolo importante nell'educazione del sistema immunitario. Questa relazione è estremamente importante per comprendere le malattie autoimmuni che non sono solo guidate da fattori genetici, ma anche da fattori ambientali che possono innescare l'insorgenza e / o peggiorare il decorso della malattia. Uno studio precedentemente pubblicato sulla dinamica del microbiota intestinale nei topi femmina MRL / lpr inclini al lupus ha mostrato come i cambiamenti del microbiota intestinale possono alterare la progressione della malattia. Qui, viene descritto un protocollo per estrarre campioni rappresentativi dal microbiota intestinale per studi di autoimmunità. I campioni di microbiota vengono raccolti dall'ano e lavorati, da cui il DNA viene estratto utilizzando un metodo fenolo-cloroformio e purificato mediante precipitazione alcolica. Dopo l'esecuzione della PCR, gli ampliconi purificati vengono sequenziati utilizzando una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione presso l'Argonne National Laboratory. Infine, vengono analizzati i dati di sequenziamento del gene RNA ribosomiale 16S. Ad esempio, vengono mostrati i dati ottenuti dai confronti del microbiota intestinale di topi MRL / lpr con o senza CX3CR1. I risultati hanno mostrato differenze significative nei generi contenenti batteri patogeni come quelli del phylum Proteobacteria, così come il genere Bifidobacterium, che è considerato parte del microbiota commensale sano. In sintesi, questo metodo di isolamento del DNA semplice ed economico è affidabile e può aiutare lo studio dei cambiamenti del microbiota intestinale associati alle malattie autoimmuni.
Introduction
Esseri umani e batteri hanno coesistito per molto tempo. Hanno stabilito una relazione codipendente con effetti benefici reciproci che influenza le risposte immunitarie dell'ospite in modi quantitativi e qualitativi1. Studi recenti suggeriscono un'associazione tra la composizione del microbiota intestinale e la patogenesi delle malattie autoimmuni che includono la sclerosi multipla 2, l'artrite reumatoide3, il diabete di tipo2 4, la malattia infiammatoria intestinale5 e il lupus eritematoso sistemico (LES)6. Tuttavia, non è ancora chiaro se il microbiota intestinale sia la causa principale o un effetto secondario di queste malattie autoimmuni7. Potenzialmente, il microbiota intestinale potrebbe esacerbare la malattia durante la fase effettrice dei disturbi autoimmuni o svolgere un ruolo nella regolazione dell'induzione di queste malattie8.
La disbiosi intestinale è stata riportata in topi MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) femminili inclini al lupus e sono stati osservati cambiamenti del microbiota intestinale con una significativa deplezione di lattobacilli9. Quando una miscela di cinque ceppi di Lactobacillus è stata somministrata per via orale, i sintomi simili al lupus sono stati ampiamente attenuati in questi topi, suggerendo un ruolo essenziale del microbiota nella regolazione della patogenesi del LES.
La seguente tecnica di estrazione del DNA consente di seguire le fluttuazioni del microbiota e analizzarle qualitativamente e quantitativamente durante il decorso della malattia murina simile al LES nei topi inclini al lupus. Sia che si tratti di esaminare il microbiota intestinale sano o di definire la disbiosi, è importante esaminare criticamente come vengono raccolti i dati e se sono accurati e riproducibili10. Ogni fase è fondamentale in questo processo. È necessario utilizzare una metodologia appropriata per estrarre il DNA microbico poiché qualsiasi possibile problema che introduce distorsioni durante il processo di estrazione del DNA potrebbe comportare una rappresentazione microbica imprecisa. Mentre il metodo fenolo-cloroformio è descritto qui, ci sono kit disponibili in commercio per estrarre il DNA da batteri che funzionano bene in casi particolari11. Tuttavia, la loro usabilità è limitata dal costo e dalla quantità di campione richiesta.
Il protocollo qui presentato è conveniente e richiede solo una piccola quantità di campione. Funziona bene con qualsiasi tipo di campione di feci ed è utile nello studio delle dinamiche del microbiota intestinale nel tempo e nei confronti tra gruppi. Il DNA viene isolato con un metodo di purificazione dell'alcol, che utilizza fenolo, cloroformio e alcol isoamilico. L'estrazione a base alcolica aiuta a pulire e rimuovere il campione di proteine e lipidi, dove il DNA viene precipitato nella fase finale. Il metodo proposto ha un'efficienza e una qualità significativamente elevate e si è dimostrato accurato nell'identificazione delle popolazioni batteriche. Una nota critica durante la procedura è che può verificarsi una contaminazione del DNA e quindi è necessaria un'appropriata gestione del campione12.
Il DNA viene quindi analizzato dalle piattaforme Next Generation Sequencing per il gene rRNA 16S, come l'Illumina MiSeq. In particolare, la regione iper-variabile V4 viene analizzata per fornire una migliore quantificazione per i taxa di alto rango13. La successiva analisi bioinformatica viene esternalizzata, seguita da un'analisi interna utilizzando metodi statistici standard. Esistono numerosi programmi software bioinformatici open source disponibili per il sequenziamento a valle e il tipo di analisi eseguite dipende fortemente dalla specifica questione biologica di interesse14. Questo protocollo si concentra specificamente sulle fasi sperimentali prima del sequenziamento e fornisce un metodo più versatile, economico, confrontabile ed efficiente per ottenere DNA da campioni fecali.
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Protocol
Il locus Cx3cr1 gfp/gfp dei topi B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J è stato reincrociato con MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) per 10 generazioni per generare topi MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp. Lo screening del genoma utilizzando pannelli di polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) ha confermato che il background genetico dei topi di nuova generazione era identico per oltre il 97% a quello di MRL / lpr. Successivamente, i topi sono stati allevati e mantenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni seguendo i requisiti specifici dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso Virginia Tech. I campioni sono stati raccolti quando i topi avevano 13, 14 e 15 settimane.
1. Raccolta di campioni di microbiota da topi
- Porta ogni topo individualmente fuori dalla sua gabbia. Raccogliere un pellet fecale direttamente dall'ano e conservarlo a -80 ° C fino alla lavorazione. Elaborare i campioni con pinze, tubi e guanti sterili e puliti.
NOTA: Un contenitore (ad esempio, un becher) può essere utilizzato per posizionare il mouse in attesa del campione fecale. Pulire il contenitore con etanolo prima e dopo ogni topo. - Aggiungere un pellet congelato a un tubo a vite prepesato da 2 ml. Registra il peso fecale in grammi, che dovrebbe essere compreso tra 0,02-0,05 g per pellet fecale.
- Aggiungere al pellet un sottile strato di perle di vetro da 0,1 mm, 500 μL di tampone di lisi (50 mM NaCl, 5 mM Tris e 50 mM EDTA) e 200 μL di SDS al 20%.
- Bead-beat il tubo per 4 minuti in un omogeneizzatore (alla massima potenza), seguito da 3-5 minuti di vortice.
- Ruotare per un breve periodo per eliminare le bolle e la schiuma (premere il pulsante sulla centrifuga fino a raggiungere 1.000-1.200 x g, quindi rilasciare).
2. Estrazione del DNA
- Trasferire 350 μL di surnatante ottenuto nella fase 1.5 (assicurandosi di non trasportare detriti) in un nuovo tubo con tappo a scatto da 1,5 ml. Aggiungere 500 μL di miscela di alcool fenolo-cloroformio-isoamilico (PCI; 25:24:1, v/v) e vortice per 1 min.
NOTA: D'ora in poi, i campioni devono essere gestiti all'interno di una cappa chimica. PCI è tossico. - Centrifugare a 6.000 x g per 3 minuti a 4 °C. Trasferire 180 μL della fase acquosa (strato superiore) in un nuovo tubo con tappo a scatto da 1,5 ml. Aggiungere 180 μL (1:1) di cloroformio, capovolgere e mescolare.
NOTA: ridurre al minimo la contaminazione dallo strato inferiore durante il trasferimento dello strato superiore. - Centrifugare a 18.400 x g per 3 minuti a 4 °C. Trasferire 180 μL della fase acquosa in un nuovo tubo a pressione.
NOTA: dopo aver eliminato PCI e cloroformio, è possibile eseguire i seguenti passaggi in un armadio di sicurezza biologica. - Aggiungere 180 μL di isopropanolo freddo e 36 μL di 5M NH4Ac. Capovolgere alcune volte per mescolare e posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti.
- Centrifugare a 18.400 x g per 20 minuti a 4 °C. Versare per scartare il surnatante. Lavare il pellet più volte con 500 μL di etanolo freddo al 70% invertendo.
NOTA: L'etanolo deve essere diluito con acqua sterile a doppia deionizzazione. - Centrifugare a 18.400 x g per 3 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante per rimuovere l'etanolo residuo.
- Asciugare all'aria il tubo capovolto su carta velina per 20 minuti, fino a quando il pellet diventa trasparente. Sospendere il pellet in 50 μL di acqua molecolare. Riscaldare il liquido a 37 °C per 10 minuti per sciogliere completamente grandi pellet di DNA.
- Spingere i tubi dopo il riscaldamento per recuperare le goccioline di condensa sul coperchio (3.400 x g per 1 min).
- Misurare la concentrazione e ottenere il rapporto 260/280 utilizzando uno spettrofotometro. Usa acqua di grado molecolare come uno spazio vuoto. Il DNA di buona qualità dovrebbe avere rapporti 260/280 compresi tra 1,8 e 2.
NOTA: La resa del DNA prevista è di almeno 0,03 g per pellet fecale.
3. Preparazione del campione per il sequenziamento del gene rRNA 16S
- Invia i campioni di DNA all'Argonne National Laboratory, dove vengono sottoposti alla preparazione della biblioteca e vengono sequenziati sull'Illumina Miseq.
- Inviare i campioni in piastre a 96 pozzetti completamente gonfie, con campioni disposti in file (A1-A12, B1-B12, ecc.) e sigillati con guarnizioni a piastre di alluminio.
- Inviare un volume finale di 20 μL per campione per pozzetto, in concentrazione compresa tra 1 e 50 ng/μL.
NOTA: Le diluizioni devono essere eseguite con acqua di grado molecolare. - Dopo aver preparato i campioni, centrifugare a 600 x g per 1 minuto a temperatura ambiente prima di congelare i campioni a -80 °C per 24 ore.
- Invia durante la notte su ghiaccio secco.
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Representative Results
I risultati dell'Argonne National Laboratory sono analizzati da un bioinformatico qualificato, seguito da un'analisi interna dei dati utilizzando metodi statistici standard. Le tipiche analisi del microbioma comportano il raggruppamento di sequenze simili in unità tassonomiche operative (OTU) o varianti di sequenza ampliconica (ASV) come proxy per diversi microrganismi in un campione. I conteggi di OTU o ASV tra i campioni possono quindi essere utilizzati per verificare i cambiamenti nella diversità all'interno del campione (alfa) e nella diversità tra campioni (beta). Possono anche essere utilizzati per testare i taxa che sono differenzialmente abbondanti tra le categorie di metadati di interesse.
Come mostrato nella Figura 1, il ceppo murino privo del recettore CX3CR1 ha una diversa composizione del microbiota intestinale. Rispetto ai topi wildtype MRL/lpr, i topi MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp (che esprimono la proteina fluorescente verde invece di CX3CR1) mostrano differenze significative in alcuni generi rilevanti per batteri potenzialmente patogeni come quelli del phylum Proteobacteria. Inoltre, alcune differenze sono state notate per batteri commensali "sani" come Bifidobacterium, ma non Lactobacillus.
Figura 1: Confronti del microbiota intestinale a livello di genere per topi MRL/lpr e MRL/lpr-CX3CR1. L'abbondanza di generi diversi a 13, 14 e 15 settimane di età (n = 5 topi femmina per gruppo). È stata eseguita ANOVA bidirezionale. Nessuna significatività ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il microbiota intestinale equilibrato può proteggere il corpo umano dalle malattie. Una volta che questo equilibrio viene interrotto da fattori scatenanti esterni o interni, le conseguenze possono essere devastanti. Questo metodo presenta un modo per analizzare la dinamica del microbiota intestinale in modelli murini. Il metodo è adatto non solo per i confronti tra gruppi, ma anche per tracciare il microbiota intestinale nel tempo per identificare meglio i fattori dipendenti dal tempo che interrompono il microbiota intestinale.
Tutti i topi nell'esperimento devono essere gestiti nello stesso ambiente. Una questione essenziale da considerare durante la raccolta di campioni fecali è essere coerenti con l'ora, il giorno e il luogo. I topi sono coprofagici. Ciò significa che mangiano le loro feci o quelle che li circondano per ottenere nutrienti essenziali. Pertanto, le feci non possono essere raccolte dalla gabbia. I campioni devono essere raccolti freschi e direttamente dall'ano. Il metodo migliore è massaggiare il mouse mentre lo si tiene o posizionare il mouse in un contenitore. Inoltre, si raccomanda che i campioni vengano elaborati contemporaneamente e congelati a -80 °C in attesa che tutti i campioni siano pronti.
L'estrazione del DNA è estremamente sensibile al pipettaggio e alla manipolazione, quindi tutti i campioni devono essere elaborati contemporaneamente. Un'altra considerazione è quella di evitare la contaminazione ambientale; Pertanto, ogni singolo passaggio non necessariamente eseguito nella cappa chimica a causa dei reagenti tossici dovrebbe essere fatto in un armadio di sicurezza biologica. Anche se le possibilità di contaminazione ambientale sono basse e non esiste un passo per consentire ai batteri di crescere, questo metodo è estremamente sensibile ed evitare ogni possibile contaminazione è assolutamente raccomandato. Inoltre, la pesatura dei pellet contribuirà ad aumentare la coerenza tra i campioni. Come vantaggio rispetto ai kit disponibili in commercio, questo metodo è particolarmente utile per raggiungere alte concentrazioni di DNA. La resa del DNA ottenuta con questo protocollo varia tra 0,03 g e 0,07 g a seconda del peso del pellet fecale. In confronto, i kit commerciali possono produrre tra 0,005 g e 0,05 g, ma con una maggiore probabilità di saturazione limitata dalla fase di ritenzione della colonna.
La fase di battitura delle perline è importante per rompere il pellet fecale in piccoli pezzi in modo che l'agente di lisi possa raggiungere tutti i batteri. Se questo passaggio non è ben eseguito, i pellet possono essere parzialmente disintegrati e si possono raggiungere meno batteri rappresentativi. Inoltre, quando si trasferiscono i surnatanti è importante un pipettaggio corretto, poiché trasportare parte del tampone residuo della fase precedente altererebbe la resa e la qualità del DNA alla fine.
Quando si diluiscono i campioni per il sequenziamento del gene RNA ribosomiale 16S, è importante agire rapidamente prima che i campioni vengano messi nel congelatore. È anche importante miscelare bene i campioni prima di eseguire le diluizioni. Evitare di lasciare campioni a temperatura ambiente per lunghi periodi di tempo. Poiché i volumi sono piccoli, congelare i campioni nella piastra prima di spedirli contribuirà a ridurre al minimo la perdita.
L'Argonne National Laboratory analizza la regione V4 del gene rRNA 16S. La regione V4 è meglio conservata rispetto alle altre regioni e ha una stima migliore per i taxa di alto rango13. Mentre le altre regioni sono migliori per l'analisi di specie in rapida evoluzione e possono aiutare a identificare e discriminare meglio il genere o la specie, quelle regioni accumulano mutazioni più velocemente di V4.
Una volta che i risultati sono tornati e analizzati da un bioinformatico qualificato, il software statistico può essere utilizzato per tracciare i risultati e confrontare i gruppi. È importante comprendere i limiti di questa tecnica e i risultati dopo l'analisi bioinformatica. Più basso è il livello tassonomico, minore è l'accuratezza o maggiori sono le variazioni. Dal phylum alla famiglia, e anche il livello del genere può essere analizzato con affidabilità. Tuttavia, le annotazioni a livello di specie non sono accurate con questo metodo. Il sequenziamento del fucile, d'altra parte, può raggiungere il livello della specie; tuttavia, mentre può fornire maggiori informazioni sulle funzioni biologiche di una comunità, il sequenziamento del gene rRNA 16S è ancora un metodo accurato ed economico per quantificare le distribuzioni tassonomiche di una comunità microbica15.
In sintesi, è stato descritto un protocollo economico per analizzare il microbiota intestinale e studiarne le dinamiche con la massima accuratezza che può aiutare a rivelare i cambiamenti longitudinali nel tempo e le differenze tra i gruppi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è conflitto di interessi.
Acknowledgments
Apprezziamo l'aiuto dell'Argonne National Laboratory e dei nostri bioinformatici che collaborano. Questo lavoro è supportato da vari NIH e sovvenzioni interne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B.
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
