Summary
Este protocolo fornece um método de isolamento de DNA simples e econômico para a análise de alterações da microbiota intestinal murina durante o desenvolvimento de doenças autoimunes.
Abstract
A microbiota intestinal tem um papel importante na educação do sistema imunológico. Essa relação é extremamente importante para a compreensão de doenças autoimunes que não são apenas impulsionadas por fatores genéticos, mas também por fatores ambientais que podem desencadear o início e/ou piorar o curso da doença. Um estudo publicado anteriormente sobre a dinâmica da microbiota intestinal em camundongos fêmeas MRL/lpr propensas ao lúpus mostrou como as mudanças da microbiota intestinal podem alterar a progressão da doença. Aqui, um protocolo é descrito para extrair amostras representativas da microbiota intestinal para estudos de autoimunidade. Amostras de microbiota são coletadas do ânus e processadas, das quais o DNA é extraído usando um método fenol-clorofórmio e purificado por precipitação de álcool. Após a execução da PCR, os amplificadores purificados são sequenciados usando uma plataforma de sequenciamento de próxima geração no Argonne National Laboratory. Finalmente, os dados de sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S são analisados. Como exemplo, são mostrados dados obtidos a partir de comparações da microbiota intestinal de camundongos MRL/lpr com ou sem CX3CR1. Os resultados mostraram diferenças significativas em gêneros contendo bactérias patogênicas, como as do filo Proteobacteria, bem como do gênero Bifidobacterium, que é considerado parte da microbiota comensal saudável. Em resumo, este método de isolamento de DNA simples e econômico é confiável e pode ajudar na investigação de alterações da microbiota intestinal associadas a doenças autoimunes.
Introduction
Humanos e bactérias coexistem há muito tempo. Eles estabeleceram uma relação codependente com efeitos benéficos mútuos que influencia as respostas imunes do hospedeiro de forma quantitativa e qualitativa1. Estudos recentes sugerem uma associação entre a composição da microbiota intestinal e a patogênese de doenças autoimunes que incluem esclerose múltipla 2, artrite reumatoide3, diabetes tipo2 4, doença inflamatória intestinal5 e lúpus eritematoso sistêmico (LES)6. No entanto, ainda não está claro se a microbiota intestinal é a principal causa ou um efeito secundário dessas doenças autoimunes7. Potencialmente, a microbiota intestinal poderia exacerbar a doença durante a fase efetora de doenças autoimunes ou desempenhar um papel na regulação da indução dessas doenças8.
Disbiose intestinal foi relatada em camundongos fêmeas com LMR/Mp-Faslpr (LMR/lpr) propensos a lúpus, e alterações na microbiota intestinal com uma depleção significativa de Lactobacilos foram observadas9. Quando uma mistura de cinco cepas de Lactobacillus foi administrada por via oral, sintomas semelhantes ao lúpus foram amplamente atenuados nesses camundongos, sugerindo um papel essencial da microbiota na regulação da patogênese do LES.
A seguinte técnica de extração de DNA permite acompanhar as flutuações da microbiota e analisá-las qualitativa e quantitativamente durante o curso da doença murina semelhante ao LES em camundongos propensos ao lúpus. Seja para examinar a microbiota intestinal saudável ou definir disbiose, é importante examinar criticamente como os dados são coletados e se são precisos e reprodutíveis10. Cada passo é fundamental nesse processo. Deve ser utilizada uma metodologia adequada para extrair ADN microbiano, uma vez que qualquer possível problema que introduza vieses durante o processo de extracção de ADN pode resultar numa representação microbiana imprecisa. Embora o método fenol-clorofórmio seja descrito aqui, existem kits comercialmente disponíveis para extrair DNA de bactérias que funcionam bem em casos particulares11. No entanto, sua usabilidade é limitada pelo custo e pela quantidade de amostra necessária.
O protocolo aqui apresentado é custo-efetivo e requer apenas uma pequena quantidade de amostra. Ele funciona bem com qualquer tipo de amostra de fezes e é útil no estudo da dinâmica da microbiota intestinal ao longo do tempo, bem como comparações entre grupos. O DNA é isolado com um método de purificação de álcool, que usa fenol, clorofórmio e álcool isoamílico. A extração à base de álcool ajuda a limpar e remover a amostra de proteínas e lipídios, onde o DNA é precipitado na etapa final. O método proposto tem eficiência e qualidade significativamente altas e provou ser preciso na identificação de populações bacterianas. Uma observação crítica durante o procedimento é que a contaminação do DNA pode ocorrer e, portanto, o manuseio adequado da amostra é necessário12.
O DNA é então analisado pelas plataformas Next Generation Sequencing para o gene 16S rRNA, como o Illumina MiSeq. Em particular, a região hipervariável V4 é analisada para fornecer uma melhor quantificação para táxons de alto nível13. A análise bioinformática subsequente é terceirizada, seguida de análise interna usando métodos estatísticos padrão. Existem inúmeros softwares de bioinformática de código aberto disponíveis para sequenciamento a jusante, e o tipo de análise realizada depende fortemente da questão biológica específica de interesse14. Este protocolo se concentra especificamente nas etapas experimentais anteriores ao sequenciamento e fornece um método mais versátil, econômico, comparável e eficiente para obter DNA de amostras fecais.
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Protocol
O locus Cx3cr1 gfp/gfp de camundongos B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J foi retrocruzado para camundongos MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) por 10 gerações para gerar camundongos MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp. A triagem do genoma usando painéis de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) confirmou que o fundo genético de camundongos recém-gerados era mais de 97% idêntico ao do LMR/lpr. Depois disso, os camundongos foram criados e mantidos em um ambiente específico livre de patógenos, seguindo os requisitos específicos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech. As amostras foram coletadas quando os camundongos tinham 13, 14 e 15 semanas de idade.
1. Coleta de amostras de microbiota de camundongos
- Tire cada rato individualmente de sua gaiola. Recolher um pellet fecal directamente do ânus e armazená-lo a -80 °C até ser processado. Processe as amostras com pinças, tubos e luvas estéreis e limpos.
NOTA: Um recipiente (por exemplo, um béquer) pode ser usado para colocar o rato enquanto aguarda a amostra fecal. Limpe o recipiente com etanol antes e depois de cada rato. - Adicione um pellet congelado a um tubo de tampa de rosca pré-pesado de 2 mL. Registre o peso fecal em gramas, que deve estar entre 0,02-0,05 g por pellet fecal.
- Adicione ao pellet uma fina camada de contas de vidro de 0,1 mm, 500 μL de tampão de lise (50 mM de NaCl, 5 mM Tris e 50 mM EDTA) e 200 μL de 20% de SDS.
- Bata o tubo por 4 minutos em um homogeneizador (na potência máxima), seguido por 3-5 min de vórtice.
- Gire por um curto período de tempo para eliminar as bolhas e a espuma (pressione o botão na centrífuga até atingir 1.000-1.200 x g e, em seguida, solte).
2. Extração de DNA
- Transfira 350 μL de sobrenadante obtido na etapa 1.5 (garantindo não transportar detritos) para um novo tubo de tampa de encaixe de 1,5 mL. Adicionar 500 μL de mistura de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (PCI; 25:24:1, v/v) e vórtice durante 1 min.
NOTA: A partir de agora, as amostras precisam ser manuseadas dentro de um exaustor químico. A ICP é tóxica. - Gire a 6.000 x g por 3 min a 4 °C. Transfira 180 μL da fase aquosa (camada superior) para um novo tubo de tampa de encaixe de 1,5 mL. Adicione 180 μL (1:1) de clorofórmio, inverta e misture.
NOTA: Minimize a contaminação da camada inferior ao transferir a camada superior. - Gire a 18.400 x g durante 3 min a 4 °C. Transfira 180 μL da fase aquosa para um novo tubo de encaixe.
NOTA: Depois de descartar PCI e clorofórmio, as etapas a seguir podem ser executadas em um gabinete de segurança biológica. - Adicione 180 μL de isopropanol frio e 36 μL de 5M NH4Ac. Inverta algumas vezes para misturar e coloque o tubo no gelo por 20 min.
- Gire a 18.400 x g durante 20 min a 4 °C. Despeje para descartar o sobrenadante. Lave o pellet várias vezes com 500 μL de etanol frio a 70% durante a inversão.
NOTA: O etanol deve ser diluído com água estéril duplamente deionizada. - Gire a 18.400 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante para remover o etanol residual.
- Seque o tubo de cabeça para baixo sobre papel de seda por 20 minutos, até que o pellet fique claro. Suspender o pellet em 50 μL de água de grau molecular. Aqueça o líquido a 37 °C durante 10 minutos para dissolver completamente grandes pastilhas de ADN.
- Tubos de rotação após o aquecimento para recuperar gotículas de condensação na tampa (3.400 x g por 1 min).
- Meça a concentração e obtenha a relação 260/280 usando um espectrofotômetro. Use água de grau molecular como um espaço em branco. O DNA de boa qualidade deve ter proporções de 260/280 variando entre 1,8 e 2.
NOTA: O rendimento esperado de ADN é de pelo menos 0,03 g por pellet fecal.
3. Preparação da amostra para sequenciamento do gene 16S rRNA
- Envie as amostras de DNA para o Laboratório Nacional Argonne, onde passam pela preparação da biblioteca e são sequenciadas no Illumina Miseq.
- Enviar amostras em placas de 96 poços totalmente contornadas, com amostras dispostas em fileiras (A1-A12, B1-B12, etc.) e seladas com vedações de placa de folha.
- Enviar um volume final de 20 μL por amostra por poço, variando em concentração de 1-50 ng/μL.
NOTA: As diluições devem ser feitas com água de grau molecular. - Após a preparação das amostras, fiar a 600 x g durante 1 min à temperatura ambiente antes de congelar as amostras a -80 °C durante 24 h.
- Envie durante a noite em gelo seco.
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Representative Results
Os resultados do Argonne National Laboratory são analisados por um bioinformático qualificado, seguido por uma análise interna dos dados usando métodos estatísticos padrão. As análises típicas do microbioma envolvem o agrupamento de sequências semelhantes em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) ou variantes de sequência amplicon (ASVs) como proxy para diferentes microrganismos em uma amostra. As contagens de OTUs ou ASVs entre amostras podem então ser usadas para testar mudanças na diversidade dentro da amostra (alfa) e na diversidade entre amostras (beta). Eles também podem ser usados para testar táxons que são diferencialmente abundantes entre as categorias de metadados de interesse.
Como mostrado na Figura 1, a cepa de camundongo sem o receptor CX3CR1 tem uma composição de microbiota intestinal diferente. Em comparação com os camundongos MRL/lpr do tipo selvagem, camundongos MRL/lpr-CX 3 CR1gfp/gfp (expressando a proteína fluorescente verde em vezde CX3CR1) mostram diferenças significativas em certos gêneros relevantes para bactérias potencialmente patogênicas, como as do filo Proteobacteria. Além disso, algumas diferenças foram observadas para bactérias comensais "saudáveis", como Bifidobacterium, Mas não Lactobacillus.
Figura 1: Comparações da microbiota intestinal ao nível do género para ratinhos MRL/lpr e MRL/lpr-CX3CR1. A abundância de diferentes gêneros aos 13, 14 e 15 semanas de idade (n = 5 camundongos fêmeas por grupo). A ANOVA two-way foi realizada. Sem significância ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A microbiota intestinal equilibrada pode proteger o corpo humano de doenças. Uma vez que esse equilíbrio é interrompido por gatilhos externos ou internos, as consequências podem ser devastadoras. Este método apresenta uma forma de analisar a dinâmica da microbiota intestinal em modelos murinos. O método é adequado não apenas para comparações entre grupos, mas também para rastrear a microbiota intestinal ao longo do tempo para identificar melhor os fatores dependentes do tempo que perturbam a microbiota intestinal.
Todos os ratos do experimento devem ser manuseados no mesmo ambiente. Uma questão essencial a considerar ao coletar amostras fecais é ser consistente com a hora, o dia e o local. Os ratos são coprófagos. Isso significa que eles comem suas fezes ou as que os rodeiam para obter nutrientes essenciais. Portanto, as fezes não podem ser coletadas da gaiola. As amostras precisam ser coletadas frescas e diretamente do ânus. O melhor método é massagear o mouse enquanto o segura ou colocá-lo em um recipiente. Além disso, recomenda-se que as amostras sejam processadas ao mesmo tempo e congeladas a -80 °C, enquanto se aguarda que todas as amostras estejam prontas.
A extração de DNA é extremamente sensível à pipetagem e manuseio, portanto, todas as amostras devem ser processadas ao mesmo tempo. Outra consideração é evitar a contaminação ambiental; portanto, cada passo não necessariamente realizado no exaustor químico devido aos reagentes tóxicos deve ser feito em um gabinete de segurança biológica. Mesmo que as chances de contaminação ambiental sejam baixas e não haja nenhum passo para permitir que as bactérias cresçam, este método é extremamente sensível, e evitar qualquer possível contaminação é absolutamente recomendado. Além disso, a pesagem dos pellets ajudará a aumentar a consistência entre as amostras. Como uma vantagem sobre os kits comercialmente disponíveis, este método é particularmente bom para alcançar altas concentrações de DNA. O rendimento de DNA obtido com este protocolo varia entre 0,03 g e 0,07 g, dependendo do peso do pellet fecal. Em comparação, os kits comerciais podem render entre 0,005 g a 0,05 g, mas com maior chance de saturação, conforme limitado pela etapa de retenção da coluna.
A etapa de batida de contas é importante para quebrar o pellet fecal em pequenos pedaços para que o agente de lise possa alcançar todas as bactérias. Se esta etapa não for bem executada, os pellets podem ser parcialmente desintegrados e menos bactérias representativas podem ser alcançadas. Além disso, ao transferir sobrenadantes, a pipetagem correta é importante, uma vez que carregar parte do tampão residual da etapa anterior alteraria o rendimento e a qualidade do DNA no final.
Ao diluir as amostras para o sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S, é importante agir rapidamente antes que as amostras sejam colocadas no congelador. Também é importante misturar bem as amostras antes de realizar diluições. Evite deixar amostras à temperatura ambiente por longos períodos de tempo. Como os volumes são pequenos, congelar as amostras na placa antes de enviá-las ajudará a minimizar a perda.
O Argonne National Laboratory analisa a região V4 do gene 16S rRNA. A região V4 é melhor conservada do que as demais regiões e tem melhor estimativa para táxons de alto nível13. Enquanto as outras regiões são melhores para a análise de espécies em rápida evolução e podem ajudar a identificar e discriminar melhor gênero ou espécie, essas regiões acumulam mutações mais rapidamente do que V4.
Uma vez que os resultados são devolvidos e analisados por um bioinformático qualificado, um software estatístico pode ser usado para plotar os resultados e comparar grupos. É importante compreender as limitações dessa técnica e os resultados após a análise bioinformática. Quanto menor o nível taxonômico, menor a precisão ou maiores as variações. Do filo à família, e até mesmo o nível do gênero pode ser analisado com confiabilidade. No entanto, as anotações no nível da espécie não são precisas com este método. O sequenciamento de espingarda, por outro lado, pode atingir o nível da espécie; no entanto, embora possa fornecer mais informações sobre as funções biológicas de uma comunidade, o sequenciamento do gene 16S rRNA ainda é um método preciso e econômico para quantificar distribuições taxonômicas de uma comunidade microbiana15.
Em resumo, um protocolo custo-eficiente foi descrito para analisar a microbiota intestinal e estudar sua dinâmica com a máxima precisão que pode ajudar a revelar mudanças longitudinais ao longo do tempo, bem como diferenças entre os grupos.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos a ajuda do Laboratório Nacional Argonne e de nossos bioinformáticos colaboradores. Este trabalho é apoiado por vários subsídios internos e do NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
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