Summary
Этот протокол обеспечивает простой, экономически эффективный метод выделения ДНК для анализа изменений микробиоты кишечника мышей во время развития аутоиммунного заболевания.
Abstract
Микробиота кишечника играет важную роль в обучении иммунной системы. Эта взаимосвязь чрезвычайно важна для понимания аутоиммунных заболеваний, которые обусловлены не только генетическими факторами, но и факторами окружающей среды, которые могут вызвать начало и / или ухудшить течение заболевания. Ранее опубликованное исследование динамики кишечной микробиоты у самок мышей, склонных к волчанке, показало, как изменения микробиоты кишечника могут изменить прогрессирование заболевания. Здесь описан протокол извлечения репрезентативных образцов из микробиоты кишечника для исследований аутоиммунитета. Образцы микробиоты собирают из ануса и обрабатывают, из которого извлекают ДНК с помощью фенол-хлороформного метода и очищают спиртовым осаждением. После проведения ПЦР очищенные ампликоны секвенируются с помощью платформы секвенирования следующего поколения в Аргоннской национальной лаборатории. Наконец, анализируются данные секвенирования гена рибосомальной РНК 16S. В качестве примера показаны данные, полученные из сравнений кишечной микробиоты мышей MRL/lpr с CX3CR1 или без него. Результаты показали значительные различия в родах, содержащих патогенные бактерии, такие как в типе Proteobacteria, а также в роде Bifidobacterium, который считается частью здоровой комменсальной микробиоты. Таким образом, этот простой, экономически эффективный метод выделения ДНК является надежным и может помочь в исследовании изменений микробиоты кишечника, связанных с аутоиммунными заболеваниями.
Introduction
Люди и бактерии сосуществуют уже давно. Они установили созависимую связь с взаимовыгодными эффектами, которая влияет на иммунные реакции хозяина количественными и качественными способами1. Недавние исследования предполагают связь между составом микробиоты кишечника и патогенезом аутоиммунных заболеваний, которые включают рассеянный склероз2, ревматоидный артрит3, диабет 2 типа4, воспалительное заболевание кишечника5 и системную красную волчанку (СКВ)6. Однако является ли микробиота кишечника основной причиной или вторичным эффектом этих аутоиммунных заболеваний, до сих пор неясно7. Потенциально микробиота кишечника может усугубить заболевание во время эффекторной фазы аутоиммунных расстройств или играть роль в регулировании индукции этих заболеваний8.
Сообщалось о дисбактериозе кишечника у самок мышей MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr), а изменения микробиоты кишечника со значительным истощением лактобактерий наблюдались9. Когда смесь из пяти штаммов Lactobacillus вводилась перорально, симптомы, подобные волчанке, были в значительной степени ослаблены у этих мышей, что свидетельствует о существенной роли микробиоты в регулировании патогенеза СКВ.
Следующая методика экстракции ДНК позволяет отслеживать колебания микробиоты и анализировать их качественно и количественно при течении мышиной СКВ-подобной болезни у склонных к волчанке мышей. Независимо от того, следует ли исследовать здоровую микробиоту кишечника или определить дисбактериоз, важно критически изучить, как собираются данные и являются ли они точными и воспроизводимыми10. Каждый шаг имеет решающее значение в этом процессе. Для извлечения микробной ДНК необходимо использовать соответствующую методологию, поскольку любая возможная проблема, приводящая к смещениям в процессе экстракции ДНК, может привести к неточному микробному представлению. Хотя фенол-хлороформный метод описан здесь, существуют коммерчески доступные наборы для извлечения ДНК из бактерий, которые хорошо работают в конкретных случаях11. Однако их удобство использования ограничено стоимостью и необходимым количеством образцов.
Протокол, представленный здесь, является экономически эффективным и требует лишь небольшого количества выборки. Он отлично работает с любым типом образца стула и полезен для изучения динамики микробиоты кишечника с течением времени, а также для сравнения между группами. ДНК выделяют методом очистки спирта, в котором используют фенол, хлороформ и изоамиловый спирт. Экстракция на спиртовой основе помогает очистить и удалить образец белков и липидов, где ДНК выпадает в осадок на заключительном этапе. Предложенный метод обладает значительно высокой эффективностью и качеством и доказал свою точность при выявлении бактериальных популяций. Одним из критических замечаний во время процедуры является то, что может произойти загрязнение ДНК, и, таким образом, требуется соответствующая обработка образцов12.
Затем ДНК анализируется платформами секвенирования следующего поколения для гена 16S рРНК, такими как Illumina MiSeq. В частности, гипервариабельная область V4 анализируется для обеспечения лучшей количественной оценки для высокоранговых таксонов13. Последующий анализ биоинформатики передается на аутсорсинг, за которым следует внутренний анализ с использованием стандартных статистических методов. Существует множество программ биоинформатики с открытым исходным кодом, доступных для последующего секвенирования, и тип выполняемых анализов в значительной степени зависит от конкретного биологического вопроса, представляющего интерес14. Этот протокол фокусируется конкретно на экспериментальных этапах до секвенирования и обеспечивает более универсальный, экономически эффективный, сопоставимый и эффективный метод получения ДНК из образцов фекалий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Локус Cx3cr1gfp/gfp мышей B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J был перекрещен с MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) в течение 10 поколений для генерации мышей MRL/lpr-CX3CR1 gfp/gfp. Скрининг генома с использованием панелей однонуклеотидного полиморфизма (SNP) подтвердил, что генетический фон недавно сгенерированных мышей был более чем на 97% идентичен генетическому фону MRL / lpr. После этого мышей разводили и поддерживали в определенной среде, свободной от патогенов, в соответствии с конкретными требованиями Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Virginia Tech. Образцы были собраны, когда мышам было 13, 14 и 15 недель.
1. Сбор образцов микробиоты у мышей
- Выведите каждую мышь индивидуально из своей клетки. Соберите фекальную гранулу непосредственно из ануса и храните ее при -80 °C до обработки. Обработайте образцы стерильными и чистыми щипцами, трубками и перчатками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнер (например, стакан) может быть использован для размещения мыши в ожидании образца фекалий. Очистите контейнер этанолом до и после каждой мыши. - Добавьте замороженную гранулу в предварительно взвешенную трубку с завинчивающейся крышкой 2 мл. Запишите вес кала в граммах, который должен составлять в пределах 0,02-0,05 г на каловую гранулу.
- Добавьте к грануле тонкий слой стеклянных шариков толщиной 0,1 мм, 500 мкл лизисного буфера (50 мМ NaCl, 5 мМ Tris и 50 мМ ЭДТА) и 200 мкл 20% SDS.
- Бусину взбить трубку в течение 4 мин в гомогенизаторе (при максимальной мощности) с последующим 3-5 мин вихря.
- Вращайтесь в течение короткого времени, чтобы устранить пузырьки и пену (нажмите кнопку на центрифуге, пока она не достигнет 1000-1 200 х г, а затем отпустите).
2. Извлечение ДНК
- Перенесите 350 мкл супернатанта, полученного на стадии 1,5 (гарантируя, что вы не переносите мусор), в новую трубку с защелкивающейся крышкой объемом 1,5 мл. Добавить 500 мкл смеси фенол-хлороформ-изоамилового спирта (ЧКВ; 25:24:1, v/v) и вихрь в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отныне образцы должны обрабатываться внутри химической вытяжки. PCI токсичен. - Отжим при 6 000 х г в течение 3 мин при 4 °C. Перенесите 180 мкл водной фазы (верхнего слоя) в новую трубку с защелкивающимся колпачком объемом 1,5 мл. Добавьте 180 мкл (1:1) хлороформа, инвертируйте и перемешайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизируйте загрязнение из нижнего слоя при переносе верхнего слоя. - Отжим при 18 400 х г в течение 3 мин при 4 °C. Перенесите 180 мкл водной фазы в новую трубку с защелкивающейся крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: После выброса ЧКВ и хлороформа в шкафу биологической безопасности могут быть выполнены следующие этапы. - Добавьте 180 мкл холодного изопропанола и 36 мкл 5M NH4Ac. Переверните несколько раз, чтобы перемешать, и поместите трубку на лед на 20 мин.
- Отжим при 18 400 х г в течение 20 мин при 4 °C. Вылить, чтобы выбросить супернатант. Промыть гранулу несколько раз 500 мкл холодного 70% этанола при инвертировании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол следует разбавлять двойной деионизированной стерильной водой. - Отжим при 18 400 х г в течение 3 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант для удаления остаточного этанола.
- Высушите трубку вверх ногами на папиросной бумаге в течение 20 мин, пока гранула не станет прозрачной. Суспендировать гранулу в 50 мкл молекулярной воды. Нагревайте жидкость при 37 °C в течение 10 мин, чтобы полностью растворить крупные гранулы ДНК.
- Отжимные трубки после нагрева для восстановления капель конденсата на крышке (3 400 х г в течение 1 мин).
- Измерьте концентрацию и получите соотношение 260/280 с помощью спектрофотометра. Используйте молекулярную воду в качестве заготовки. ДНК хорошего качества должна иметь соотношение 260/280 в диапазоне от 1,8 до 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый выход ДНК составляет не менее 0,03 г на фекальную гранулу.
3. Пробоподготовка для секвенирования гена 16S рРНК
- Отправьте образцы ДНК в Аргоннскую национальную лабораторию, где они проходят библиотечную подготовку и секвенируются на Illumina Miseq.
- Отправляйте образцы в полностью обогнутых 96-луночных пластинах, с образцами, расположенными рядами (A1-A12, B1-B12 и т. Д.), И запечатанными уплотнениями фольгированных пластин.
- Отправьте конечный объем 20 мкл на образец на скважину в диапазоне концентраций от 1 до 50 нг/мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавления следует проводить с помощью молекулярной воды. - После подготовки образцов вращают при 600 х г в течение 1 мин при комнатной температуре перед замораживанием образцов при -80 °C в течение 24 ч.
- Отправить на ночь на сухой лед.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты Аргоннской национальной лаборатории анализируются квалифицированным биоинформатиком, после чего проводится внутренний анализ данных с использованием стандартных статистических методов. Типичные анализы микробиома включают кластеризацию аналогичных последовательностей в операционные таксономические единицы (OTU) или варианты последовательности ампликонов (ASV) в качестве прокси для различных микроорганизмов в образце. Количество ОТУ или ASV в образцах затем может быть использовано для проверки изменений в разнообразии внутри выборки (альфа) и между выборками (бета). Они также могут быть использованы для тестирования таксонов, которые дифференциально распространены по категориям метаданных, представляющим интерес.
Как показано на рисунке 1, штамм мыши, лишенный рецептора CX3CR1, имеет другой состав кишечной микробиоты. По сравнению с диким типом MRL/lpr, мыши MRL/lpr-CX3CR1 gfp/gfp (экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок вместо CX3CR1) демонстрируют значительные различия в определенных родах, относящихся к потенциально патогенным бактериям, таким как протеобактерии типа. Кроме того, некоторые различия были отмечены для «здоровых» комменсальных бактерий, таких как Bifidobacterium, но не Lactobacillus.
Рисунок 1: Сравнение кишечной микробиоты на уровне рода для мышей MRL/lpr и MRL/lpr-CX3CR1. Обилие различных родов в возрасте 13, 14 и 15 недель (n = 5 самок мышей в группе). Была выполнена двусторонняя ANOVA. Нет значимости ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сбалансированная микробиота кишечника может защитить организм человека от заболеваний. Как только этот баланс нарушается внешними или внутренними триггерами, последствия могут быть разрушительными. Этот метод представляет собой способ анализа динамики кишечной микробиоты в мышиных моделях. Метод подходит не только для сравнения между группами, но и для отслеживания микробиоты кишечника с течением времени, чтобы лучше идентифицировать зависящие от времени факторы, нарушающие микробиоту кишечника.
Все мыши в эксперименте должны быть обработаны в одной и той же среде. Одним из важных вопросов, которые следует учитывать при сборе образцов фекалий, является соответствие времени, дню и месту. Мыши копрофагичны. Это означает, что они едят свои фекалии или те, которые их окружают, чтобы получить необходимые питательные вещества. Поэтому кал нельзя собирать из клетки. Образцы должны быть собраны свежими и непосредственно из ануса. Лучший метод — массировать мышь, удерживая ее, или поместить мышь в контейнер. Кроме того, рекомендуется, чтобы образцы обрабатывались в одно и то же время и замораживались при -80 °C в ожидании готовности всех образцов.
Экстракция ДНК чрезвычайно чувствительна к пипетированию и обработке, поэтому все образцы должны обрабатываться одновременно. Другое соображение заключается в том, чтобы избежать загрязнения окружающей среды; поэтому каждый шаг, не обязательно выполняемый в химической вытяжке из-за токсичных реагентов, должен быть выполнен в шкафу биологической безопасности. Несмотря на то, что вероятность загрязнения окружающей среды низка, и нет никакого шага, чтобы позволить бактериям расти, этот метод чрезвычайно чувствителен, и избегать любого возможного загрязнения абсолютно рекомендуется. Кроме того, взвешивание гранул поможет увеличить консистенцию среди образцов. Как преимущество перед коммерчески доступными наборами, этот метод особенно хорош для достижения высоких концентраций ДНК. Выход ДНК, полученный с помощью этого протокола, колеблется от 0,03 г до 0,07 г в зависимости от веса фекальной гранулы. Для сравнения, коммерческие наборы могут давать от 0,005 г до 0,05 г, но с более высокой вероятностью насыщения, ограниченной стадией удержания колонки.
Этап бисерного взбивания важен для разбиения фекальной гранулы на мелкие кусочки, чтобы агент лизиса мог достичь всех бактерий. Если этот этап не выполнен хорошо, гранулы могут быть частично распущены, и может быть достигнуто меньше репрезентативных бактерий. Кроме того, при переносе супернатантов важна правильная пипетка, поскольку перенос части остаточного буфера с предыдущей стадии изменит выход и качество ДНК в конце.
При разбавлении образцов для секвенирования гена рибосомальной РНК 16S важно действовать быстро, прежде чем образцы будут помещены в морозильную камеру. Также важно хорошо смешивать образцы перед выполнением разбавления. Избегайте оставлять образцы при комнатной температуре в течение длительных периодов времени. Поскольку объемы небольшие, замораживание образцов в пластине перед их отправкой поможет минимизировать потери.
Аргоннская национальная лаборатория анализирует область V4 гена 16S рРНК. Регион V4 лучше сохраняется, чем другие регионы, и имеет лучшую оценку для высокоранговых таксонов13. В то время как другие регионы лучше подходят для анализа быстро развивающихся видов и могут помочь идентифицировать и лучше различать род или виды, эти регионы накапливают мутации быстрее, чем V4.
После того, как результаты возвращаются и анализируются квалифицированным биоинформатиком, статистическое программное обеспечение может быть использовано для построения результатов и сравнения групп. Важно понимать ограничения этого метода и результаты после анализа биоинформатики. Чем ниже таксономический уровень, тем меньше точность или больше вариаций. От типа к семейству, и даже уровень рода можно проанализировать с достоверностью. Однако аннотации на уровне видов не являются точными при использовании этого метода. Секвенирование дробовика, с другой стороны, может достигать видового уровня; однако, хотя секвенирование гена 16S рРНК может дать больше информации о биологических функциях сообщества, оно по-прежнему является точным и экономически эффективным методом количественной оценки таксономических распределений микробного сообщества15.
Таким образом, был описан экономически эффективный протокол для анализа микробиоты кишечника и изучения ее динамики с максимальной точностью, которая может помочь выявить продольные изменения с течением времени, а также различия между группами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.
Acknowledgments
Мы ценим помощь Аргоннской национальной лаборатории и наших сотрудничающих биоинформатиков. Эта работа поддерживается различными NIH и внутренними грантами.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B.
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
