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방법 논문

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

2.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64179

⸱

2022년 12월 9일

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 뉴런 K-Cl 공동 수송체 KCC2의 기능 및 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다. 상기 프로토콜은 웨스턴 블로팅을 통한 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서의 KCC2 인산화의 조사를 기술한다. 또한 KCC2 활성을 확인하는 추가 방법이이 텍스트에서 간략하게 강조 표시됩니다.

초록

염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며, 뉴런에서만 발견되며 Cl- 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제에 필수적입니다. KCC2의 적절한 조절 실패는 해롭고 간질을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. KCC2의 규제와 관련된 메커니즘을 이해하는 것과 관련하여 상당한 진전이 있었으며, 연구자가 그 기능과 활동을 연구 할 수있는 기술 개발에 대한 인증을 받았습니다. 직접(키나아제 조절 부위 인산화 평가) 또는 간접(GABA 활성 관찰 및 모니터링) 조사를 통해 . 여기에서 프로토콜은 웨스턴 블로팅 기술을 사용하여 키나아제 조절 부위(Thr906 및 Thr1007)에서 KCC2 인산화를 조사하는 방법을 강조합니다. 루비듐 이온 및 탈륨 이온 흡수 분석과 같은 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다. 이러한 추가 기술 중 몇 가지가이 원고에서 간략하게 논의 될 것입니다.

서론

염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 뉴런에서만 발견되는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며 Cl- 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제 1,2,3,4에 필수적입니다. KCC2에 의한 4-6 mM에서의 낮은 뉴런 내 Cl- 농도 ([Cl-] i)의 유지는 뇌 및 척수에서 γ- 아미노 부티르산 (GABA) / 글리신 과분극 및 시냅스 억제를 촉진한다5. KCC2의 적절한 조절 실패는 간질4을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. 또한, 감소된 KCC2-매개 Cl- 압출 및 손상된 과분극 GABAA 및/또는 글리신 수용체 매개 전류는 간질, 신경병증성 통증 및 경직과 관련이 있습니다6,7. 뉴런 KCC2는 미성숙 뉴런에서 탈분극된 GABA 활성의 유지를 용이하게 하는 비-라이신(WNK)-STE20/SPS1 관련 프롤린/알라닌 풍부(SPAK)/산화 스트레스 반응성(OSR) 키나아제 신호 전달 복합체1에 의해 C-말단 세포 내 도메인 내의 주요 조절 잔기의 인산화를 통해 음성으로 조절됩니다. . WNK-SPAK/OSR1은 트레오닌 잔기 906 및 1007(Thr906/Thr1007)을 인산화하고, 이어서 KCC2의 mRNA 유전자 발현을 하향조절하여 결과적으로 생리적 기능을 저하시킨다8,10. 그러나 더 중요한 것은 WNK-SPAK/OSR1 키나아제 복합체가 KCC2 발현 1,2,4,11,12를 인산화 및 억제하는 것으로 알려져 있으며, Thr906/Thr1007을 인산화하는 키나아제 복합체 신호전달 경로의 억제가 KCC2 mRNA 유전자13,14,15의 발현 증가와 관련이 있다는 것은 이미 사실입니다. . 단백질 인산화를 통한 신경 KCC2 및 Na+-K+-2Cl- 공수송체 1(NKCC1) 발현의 조절은 수반 작용하고 반대 패턴 1,4,16으로 작용한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

KCC2의 규제와 관련된 메커니즘에 대한 이해와 관련하여 일관되고 상당한 진전이 있었으며, 연구자가 그 기능과 활동을 연구 할 수있는 기술 개발에 대한 인증을 받았습니다. 직접(키나아제 조절 부위 인산화 평가) 또는 간접(GABA 활성 관찰 및 모니터링) 조사를 통해 . 여기에 제시된 프로토콜은 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서 공수송체의 인산화를 조사함으로써 뉴런 K+-Cl- 공동 수송체 KCC2의 기능과 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다.

웨스턴 블롯은 조직 또는 세포의 샘플에서 관심있는 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 방법입니다. 이 방법은 먼저 전기 영동을 통해 단백질을 크기별로 분리합니다. 그런 다음 단백질은 특정 항체를 사용하여 표적 단백질을 표시하기 전에 고체 지지체(일반적으로 막)로 전기영동적으로 전달됩니다. 항체는 비색, 화학발광 또는 형광 방법을 사용하여 검출되는 상이한 태그 또는 형광단-접합된 항체에 접합된다. 이를 통해 단백질 혼합물에서 특정 표적 단백질을 검출 할 수 있습니다. 이 기술은 KCC1 의 인특이적 부위를 특성화하는 데 사용되었으며 KCC3 Thr991/Thr1048 인산화17을 억제하는 키나아제 억제제를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜을 따르면 세포/조직 용해물에서 전체 및 인산화된 KCC2를 특이적으로 검출할 수 있습니다. 원칙적으로이 기술에 의한 단백질 접합 항체의 검출은 생리적 조절과 관련된 분자 메커니즘을 밝히는 KCC2의 인 부위에서의 협력 활동에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이되므로 매우 중요합니다. 전체 단백질 발현의 정량 분석은 KCC2의 기능 및 활성을 대표한다. 루비듐 이온 및 탈륨 이온 흡수 분석과 같은 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다.

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프로토콜

참고: 프로토콜은 관심 있는 특정 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅 방법을 설명합니다.

1. 세포 배양 및 형질감염

  1. 세포 배양 절차 전에 비드 배스(37°C)에서 모든 시약을 가온한다. 10 % 태아 소 혈청, 2mM L- 글루타민 각각 1 %, 100x 비 필수 아미노산, 100mM 나트륨 피루 베이트 및 100 단위 / mL 페니실린-스트렙토 마이신이 보충 된 배양 배지 인 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 준비합니다.
  2. 래트 KCC2b 인간 배아 신장 293 세포(HEK293rnKCC2b)18 를 비드 배스(37°C)에서 완전히 형질감염시켰다. 극저온 튜브에서 5mL의 새 배지가 들어 있는 원심분리 튜브로 세포를 옮깁니다. 셀을 1200 ×g에서 3-5 분 동안 돌립니다.
  3. 흡인기 피펫(진공 펌프에 고정)을 사용하여 상청액을 흡입하고 10mL의 새 배지를 추가하여 세포를 다시 부유시킵니다. 세포 현탁액을 10cm 접시에 옮깁니다.
  4. 접시를 인큐베이터에 넣고 가습 된 5 % CO2 분위기에서 37 °С에서 48 시간 동안 자라게합니다. 건강한 세포 성장을 보장하기 위해 잠복기를 모니터링합니다. 배양 기간 후에 90% 이상의 합류에 도달한 세포를 추가로 분할합니다.
  5. 세포 접시에서 오래된 배지를 흡인하고 2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 트립신 2mL를 넣고 실온에서 약 1-2분 동안 배양합니다.
  6. 2mL의 완전 배지를 사용하여 접시에서 트립신 세포를 부드럽게 씻습니다. 새 접시에 새 배지 9mL를 추가하고 기존 접시의 용액 1mL를 새 접시에 각각 추가합니다. 분할 된 세포 접시를 48 시간 동안 인큐베이터로 다시 옮겨 90 % 컨플루언시≥ 얻습니다.
  7. 세포를 용해 완충액에서 세포를 수확하기 전에 대조군으로 디메틸 설폭사이드(DMSO), 8μM 스타우로스포린 또는 0.5mM N-에틸말레이미드(NEM)로 15분 동안 처리합니다.

2. 세포 용해물 및 로딩 시료의 제조

  1. 배양 접시에서 배지를 흡인합니다 (형질 주입 절차에서). 세포 배양물을 얼음 위에 놓고 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척합니다.
  2. PBS를 흡인 한 다음 50mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1mM 에틸렌 글리콜 비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (EGTA), 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 50 mM 불화 나트륨, 5 mM 피로 인산 나트륨, 10 mM 나트륨 -β- 글리세로 포스페이트, 1 mM 나트륨 오르토 바나 데이트, 1 % (w / v) 트리톤 X-100, 0.27 M 자당, 1 mM 벤즈아민, 0.1 % (v / v) 2- 메르 캅토 에탄올 및 2 mM 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)를 접시에 넣습니다.
    참고: 세포 수확 중 용해 완충액의 부피는 접시 크기에 따라 다릅니다(예: 1 x 107 cells/100mm dish/150 cm2 플라스크당 1mL의 용해 완충액이 적합하고 5 x 106 cells/60 mm dish/75 cm2 플라스크당 0.5mL가 적합합니다.
  3. 차가운 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시 바닥에서 세포를 긁어낸 다음 피펫을 사용하여 셀 현탁액을 이미 얼음 위에 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 4 ° C에서 30 분 동안 튜브를 지속적으로 교반하십시오.
  4. 세포 용해물을 16,000 x g 의 차가운 원심분리기(4°C)에서 20분 동안 돌리고 원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거한 다음 얼음 위에 놓습니다. 상청액을 미리 냉각 된 신선한 튜브에 모으고 펠릿을 버립니다.
    참고: 셀 유형에 따라 원심분리력과 시간을 변경해야 할 수도 있습니다. 그러나 일반적인 지침은 16,000 x g 에서 20분 동안 원심분리할 것을 권장합니다. 그러나 이것은 모든 실험에 대해 결정되어야합니다. 예를 들어, 백혈구와 같은 섬세한 세포는 매우 가벼운 원심분리 속도가 필요합니다.

3. 세포 용해물로부터 면역침전제의 제조

  1. 피펫 300 μL의 단백질-G-세파로스를 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 용액을 500 x g 에서 2분 동안 돌리고 상청액을 버립니다.
  2. 500μL의 PBS를 넣고 용액을 잘 와동시킵니다. 용액을 500 x g 에서 2분 동안 돌리고 상청액을 버립니다. 이 단계를 반복하십시오.
  3. 1mg의 항 -KCC2 Thr906 및 항 -KCC2 Thr1007 항체를 200μL의 단백질 G- 세파 로스 비드와 혼합하고 PBS로 부피를 500μL로 구성합니다. 진동 플랫폼 또는 회전 휠에서 4°C에서 2시간 동안 흔듭니다. PBS로 2 번 씻으십시오.
  4. 전체 세포 용해물에 대해 단백질 정량을 수행하고 세척된 비드에 1mg의 세포 용해물을 추가합니다. 종단 간 회전 장치에서 4 ° C에서 2 시간 동안 부드럽게 배양합니다. 비드를 스핀다운하고 150mM 염화나트륨(NaCl)이 포함된 PBS로 3배 세척합니다.
  5. 면역침전제(비드)를 200μL의 PBS로 3x 세척합니다. 최종 펠릿을 100μL의 1x 리튬 도데실 설페이트(LDS) 샘플 버퍼에 재현탁합니다.
  6. 실온에서 로터 셰이커에서 튜브를 5분 동안 흔들고 75°C의 가열 블록에서 10분 동안 배양합니다. 로딩 샘플을 11,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하고 겔 로딩을 위해 상청액을 사용합니다.

4. 웨스턴 블롯 수행

  1. 주조 장치를 조립하고 새로 준비된 8% 분리 젤(레시피/준비는 표 1 참조)을 부어 주조 유리 상단에서 약 2cm의 공간을 허용하는 겔을 주조합니다. 200μL의 절대 이소프로판올을 설정에 추가하고 실온에서 60분 동안 그대로 둡니다.
    참고: 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 위한 폴리아크릴아미드 겔 제조법은 관심 단백질의 크기에 따라 다릅니다(표 2). 따라서 원하는 젤 비율을 결정하기 전에 단백질 크기를 기록해 두십시오.
  2. 피펫을 사용하여 이소프로판올을 제거하고 약 200μL의 증류수로 젤을 조심스럽게 헹굽니다. 새로 준비한 6% 스태킹 젤(레시피/준비는 표 1 참조)을 추가하여 주조 설정에서 약 2cm 공간을 채웁니다. 잘 빗에 부드럽게 끼우고 실온에서 30 분 동안 방치하십시오.
  3. 주조 된 젤을 전기 영동 탱크에 고정하십시오.
  4. 트리스 염기 30.3g, 글리신 144.1g 및 SDS 10g을 증류수 1000mL에 용해시켜 10x 전달 완충액을 제조합니다. 890mL의 증류수에 10mL의 10% SDS와 100mL의 10x 전달 완충액을 추가하여 1x 실행 완충액을 준비합니다.
  5. 1x 실행 버퍼를 탱크에 붓습니다. 5μL의 분자량 마커를 첫 번째 웰에 넣고 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE 젤의 각 웰에 로드합니다(사용된 빗 크기에 따라 18-30μL 사이). 빈 우물을 1x LDS로 채우고 90V에서 약 120-120분 동안 젤을 실행합니다.
  6. 58.2g의 트리스 염기와 29.3g의 글리신을 1000mL의 증류수에 녹여 10x 전달 완충액을 준비합니다. 20 % 메탄올을 함유 한 1x 전달 완충액으로 니트로 셀룰로오스 막을 활성화하십시오. 전달 버퍼로 젤과 멤브레인을 헹구고 준비 스택에 부드럽게 펼칩니다.
    참고: 실행 중인 버퍼 및 이송 버퍼의 pH는 필요한 최적의 pH에 있어야 하므로 조정할 필요가 없습니다. 또한 시간을 절약하기 위해 실험 전에 이러한 완충액을 준비하고 실온에서 보관하는 것이 좋습니다.
  7. 음극(검은색 프레임/끝) - 샌드위치 폼 - 여과지 - 헹군 SDS-PAGE 젤 - 헹군 니트로셀룰로오스 멤브레인 - 여과지 - 샌드위치 폼 - 양극(빨간색 프레임) 순서로 전송할 샌드위치를 정렬합니다. 조립 된 샌드위치를 이송 탱크에 쌓고 90 분 동안 90 V 또는 30 분 동안 360 V에서 작동합니다.

5. 항체 염색 및 이미지 개발

  1. 멤브레인을 제거하고 건조시킵니다. 0.1% 1x Tween 20(1x TBS-T)을 함유하는 트리스-완충 식염수 중 5% 탈지유로 만든 블로킹 완충액을 사용하여 실온에서 1시간 동안 막을 차단한다.
  2. 1차 항체 8,15,19 및 베타-액틴(로딩 대조군)의 적절한 희석액과 함께 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 차단 완충액에서 배양합니다. 멤브레인을 1x TBS-T를 각각 5분 동안 세 번 세척하여 세척합니다.
    참고: 베타-액틴, 알파-튜불린 또는 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 항체와 같은 로딩 대조군과 함께 분리된 막의 배양은 후속 정량화 동안 다른 웨스턴 블로팅 결과를 정상화하기 위한 것입니다. 각 1차 항체에 대한 권장 희석액은 제조업체 매뉴얼에서 확인할 수 있습니다.
  3. 세척된 멤브레인을 블로킹 완충액에서 5000배 희석한 2차 항체와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션한다. 다시 멤브레인을 1x TBS-T에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
    참고: 1차 항체가 제기된 종에 대해 2차 항체를 올려야 하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 총 KCC2의 1 차 항체가 마우스 항 -KCC2 인 경우 항 마우스에 대한 2 차 항체를 사용해야합니다.
  4. 세척된 멤브레인을 이미징 보드에 놓습니다. 동일한 부피의 각 강화 화학발광(ECL) 시약을 혼합하고 혼합 용액을 멤브레인에 부드럽게 펴 신호를 발생시킵니다.

6. 이미징 시스템 및 데이터 정량화를 이용한 이미지 획득

  1. 이미징 보드를 이미징 시스템의 적절한 구획으로 옮겨 이미징합니다. 이미지 처리를 위해 컴퓨터에서 이미징 소프트웨어를 엽니다.
  2. 도구 모음에서 새 프로토콜을 클릭하고 단일 채널을 선택합니다. 젤 이미징/적용 대화 상자에서 선택을 클릭하고 블롯으로 스크롤한 다음 Chemi Hi 감도 또는 Chemi Hi 해상도를 선택합니다. 그런 다음 신호 누적 설정을 클릭하여 획득할 이미지의 지속 시간과 수를 설정합니다.
  3. 프로토콜 설정에서 젤 배치를 클릭하고 필요한 경우 이미징 시스템에서 젤 을 조정합니다. 프로토콜 실행을 클릭하여 이미지를 가져옵니다.
  4. 이미징 카탈로그 상자 아래에서 획득한 이미지 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 이미지를 컴퓨터에 저장합니다. 원하는 이미지로 이동하고 실행 대화 상자에서 이미지 선택 및 계속 을 클릭합니다.
  5. 이미지 변환 아이콘을 클릭하여 이미지의 대비와 픽셀 채도를 조정합니다. 일반 도구 모음에서 스크린 샷 아이콘을 클릭하여 원하는 이미지 형식에 따라 이미지를 컴퓨터에 저장합니다.
  6. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도를 측정하고 적절한 통계 도구를 사용하여 분석합니다.

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결과

여기서, 도 1에 제시된 대표적인 결과는 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 KCC2b(HEKrnKCC2b)18을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주에서 KCC2 및 NKCC1의 WNK-SPAK/OSR1 매개 인산화에 대한 스타우로스포린과 NEM의 영향을 조사하였다. 대표적인 결과에 대한 포괄적인 세부 사항은 Zhang et al.15에서 논의됩니다. NEM과 유사하게, 스타우로스포린은 KCC2 수송 활성을 향상시키고 NKCC1 활성을 억제할 수 있는 광범위한 키나아제 억제제이다15,20. HEK293 세포를 스타우로스포린 및 NEM으로 처리하면 T-루프 키나아제 도메인에 위치한 Thr233 및 hsSPAK의 S-루프 인산화 부위 Ser373인 SPAK ...

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토론

KCC2를 포함하는 뉴런에서 발현되는 CCC의 SLC12의 활성을 측정하기 위해 많은 방법이 사용되었습니다. 이러한 기술 중 다수는 다양한 질병 관련 돌연변이에서 이러한 수송체의 기능적 관련성과 구조-기능 패턴 분석에 대한 과학적 지식을 향상시키는 것으로 입증되었습니다. 비판적으로, 다양한 방법(21)에 대한 장점과 주의사항이 있다. 그러나 위에서 설명한 프로토콜은 KCC2의 기능과 활성을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 웨스턴 블롯을 사용하여 키나아제 조절 부위인 Thr906 및 Thr1007에서 KCC2 인산화를 평가하는 방법을 설명했습니다.

KCC2의 조절은 주요 세린/트레오닌 잔기1에서 인산화 및 탈인산화를 통해 발생합니다. 웨스턴 블로팅은 Thr906 및 Thr1007의 키나아제 조절 부위에서 KCC2 인산화를 조사하는 데 사용할 수 있는 효율적인 기술입니다. 원칙적으로, KCC2의 인...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 영국 왕립 학회 (보조금 번호 IEC \ NSFC \ 201094) 및 Commonwealth Ph.D. 장학금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
40% 아크릴아미드Sigma-AldrichA2917SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용됩니다.
황산염 당 암모늄Sigma-Aldrich248614SDS-PAGE를 위한 분리 및 쌓는 젤을 만드는 데 사용됩니다 
anti pSPAKDundee UniversityS670B웨스턴 블로팅
안티 KCC2Dundee UniversityS700C1차 항체로 사용
pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678의 1차 항체로 사용
Dundee UniversityS961C웨스턴 블로팅
안티 KCC2 pThr906, Dundee UniversityS959C, 웨스턴 블로팅
안티 마우스세포 신호 기술의660022차 항체로 사용
, Dundee UniversityS841B1차 항체로 사용
pThr203/207/212Dundee UniversityS763B웨스턴 블로팅
안티 토끼세포 신호 기술의C29F4의 2 차 항체로 사용
웨스턴 블로팅 안티 SPAK의 2 차 항체로 사용
Dundee UniversityS669D웨스턴 블로팅
의 1 차 항체로 사용항-&베타;-Tubulin IIISigma-AldrichT8578UK의 1차 항체로 사용
135828용해 완충액의 구성 요소로 사용
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148로딩 완충액 및 용해 완충액의 구성 요소로 사용
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209용해물 단백질 정량화에 사용
주조 장치Atto WSE-1165WSDS-page 전기영동 실행에 사용
원심분리기Eppendorf5804용해물 준비에 사용
원심분리기VWRMicroStar 17R시료 방사에 사용
디메틸설폭사이드(DMSO)Sigma-AldrichD2650-100ML세포 배양 실험에 사용
건조 탈지유MarvelN/A차단에 사용 완충
액 Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High glucoseSigma-AldrichD6429세포 배양
ECL 시약Perkin ElmerORTT755/2655웨스턴 블로팅용 이미지 개발에 사용
EDTAFisher ScientificD/0700/53용해 완충액
EGTASigma-Aldriche4378의 구성 요소로 사용 완충액
전기영동 전원 공급 장치BioRadPowerPAC HCSDS 페이지 전기영동 실행에 전원을 공급하려면
에탄올 ThermoFisherE/0650DF/17멸균 장비 및 환경 준비에 사용
Fetal Bovine Serum -  열 비활성화Merck Life Sciences UKF9665세포 배양에 사용
FumehoodWalkerA7277세포 배양에 사용
젤 블로팅 - WhatmanGE Healthcare 10426981트랜스퍼 샌드위치를 만들기 위해 웨스턴 블로팅에 사용됨
GlycineSigma-Aldrich15527버퍼를 만드는 데 사용됨
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USA버전 6.0그래프 플롯 및 데이터 분석에 사용됨  웨스턴 블로팅
HClAcros Organics10647282SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용됨 
가열 블록GrantQBT1WB 로딩 샘플을 가열하는 데 사용됨
HEK293 셀Merck UK12022001-1VL배양 실험용 세포주
ImageJ Software, Wayne Rasband 및 기여자; 미국 NIH ImageJ 1.53e웨스턴 블로팅 이미지에서 밴드 강도를 측정하는 데 사용
이미징 시스템BioRadChemiDoc MP웨스턴 블로팅 이미지를 촬영하는 데 사용
인큐베이터LEEC LEECprecision 190D세포 배양에 사용
이소프로판올Honeywell24137
용 주조 젤에 사용세포배양에 사용되는
리튬 도데실 설페이트(LDS)NovexNP0008의 로딩 버퍼로 사용
 Merck Life Sciences UKM7145세포 배양에 사용
MicrocentrifugeEppendorf5418BioRad iMark의 용해물 준비에
사용 용해물 단백질 농도 판독에 사용
Microsoft PowerPointMicrosoft, USAPowerPoint2016웨스턴 블로팅 이미지 편집에 사용
분자량 마커BioRad1610373웨스턴 블로팅에 사용
N-에틸말레이미드Thermo Fisher Scientific23030세포 배양 실험에 사용
니트로셀룰로오스 멤브레인Fisher Scientific45004091웨스턴 블로팅에 사용
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122세포 배양에 사용
pH 측정기Mettler ToledoSeven compact s210버퍼 용액의 pH를 모니터링하는 데 사용
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626용해 버퍼
인산염 버퍼 식염수Sigma-AldrichD8537세포 배양에 사용
PKCδ pThr505세포 신호 전달 기술9374
의 기본 항체로 사용GeneronPG50-00-0002면역침전
나트륨 염화물Sigma-AldrichS7653세척 완충액의 구성 요소로 사용
ChlorideSigma-AldrichS7653TBS-T 완충액 준비 데 사용
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL5750SDS-PAGE용 분리 및 쌓기 젤 제작에 사용;
오르토 바나 데이트나트륨 Sigma-AldrichS6508용해 완충액의 구성 요소로 사용
피루브산 나트륨그마 알드리치S8636세포 배양
나트륨 -&베타 - 글리세로 인산염Merck UKG9422의 구성 요소로 사용
(Streptomyces sp.< / em>)Scientific Laboratory Supplies, UKS4400-1MG세포 배양 실험에 사용됩니다
SucroseScientifc Laboratory SuppliesS0389의 구성 요소로 사용됩니다
SDS-PAGE를 위한 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용됩니다.
Transfer ChamberBioRad1658005EDU웨스턴 블로팅에서 단백질을 막에 전달하는 데 사용됩니다
TrisSigma-AldrichT6066SDS-PAGE를 위한 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용됩니다.
Triton-X100Sigma-AldrichT8787용해 완충액
Trypsin-EDTA SolutionMerck Life Sciences UKT4049세포 배양에 사용
Tween-20Sigma-AldrichP3179TBS-T 완충액 진공 펌프로 사용
Charles AustenDymax 5세포 배양에 사용
VortexScientific IndustriesK-550-GE샘플 준비에 사용
Vortex 믹서Scientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GE분해된 시료 수조 혼합에 사용
Grant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5용액 배양에 사용
의 1차 항체로 사용 웨스턴 블로팅 anti-KCC2의 웨스턴 블로팅 anti-KCC2 pThr1007의 1차 항체로 사용 1차 항체로 사용 , 웨스턴 블로팅 안티 NKCC1의 , 웨스턴 블로팅 안티 NKCC1의 , 1 차 항체로 사용 웨스턴 블로팅 안티 양 abcam ab6900 웨스턴 블로팅 벤자민 Merck 에 사용 의 구성 요소로 사용 용해 전기 영동 L-글루타민 용액 Sigma-AldrichG7513 웨스턴 블로팅 MEM 비필수 아미노산 WB Microplate reader 웨스턴 블로팅 Sepharose Protein G수 Sodium 나트륨 - 시 용해 완충액 Staurosporine.는 용해 완충액 TEMED Sigma-Aldrich T7024. . 의 구성 요소로 사용

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