본 프로토콜은 뉴런 K-Cl 공동 수송체 KCC2의 기능 및 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다. 상기 프로토콜은 웨스턴 블로팅을 통한 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서의 KCC2 인산화의 조사를 기술한다. 또한 KCC2 활성을 확인하는 추가 방법이이 텍스트에서 간략하게 강조 표시됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며, 뉴런에서만 발견되며 Cl- 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제에 필수적입니다. KCC2의 적절한 조절 실패는 해롭고 간질을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. KCC2의 규제와 관련된 메커니즘을 이해하는 것과 관련하여 상당한 진전이 있었으며, 연구자가 그 기능과 활동을 연구 할 수있는 기술 개발에 대한 인증을 받았습니다. 직접(키나아제 조절 부위 인산화 평가) 또는 간접(GABA 활성 관찰 및 모니터링) 조사를 통해 . 여기에서 프로토콜은 웨스턴 블로팅 기술을 사용하여 키나아제 조절 부위(Thr906 및 Thr1007)에서 KCC2 인산화를 조사하는 방법을 강조합니다. 루비듐 이온 및 탈륨 이온 흡수 분석과 같은 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다. 이러한 추가 기술 중 몇 가지가이 원고에서 간략하게 논의 될 것입니다.
서론
염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 뉴런에서만 발견되는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며 Cl- 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제 1,2,3,4에 필수적입니다. KCC2에 의한 4-6 mM에서의 낮은 뉴런 내 Cl- 농도 ([Cl-] i)의 유지는 뇌 및 척수에서 γ- 아미노 부티르산 (GABA) / 글리신 과분극 및 시냅스 억제를 촉진한다5. KCC2의 적절한 조절 실패는 간질4을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. 또한, 감소된 KCC2-매개 Cl- 압출 및 손상된 과분극 GABAA 및/또는 글리신 수용체 매개 전류는 간질, 신경병증성 통증 및 경직과 관련이 있습니다6,7
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프로토콜
참고: 프로토콜은 관심 있는 특정 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅 방법을 설명합니다.
1. 세포 배양 및 형질감염
- 세포 배양 절차 전에 비드 배스(37°C)에서 모든 시약을 가온한다. 10 % 태아 소 혈청, 2mM L- 글루타민 각각 1 %, 100x 비 필수 아미노산, 100mM 나트륨 피루 베이트 및 100 단위 / mL 페니실린-스트렙토 마이신이 보충 된 배양 배지 인 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 준비합니다.
- 래트 KCC2b 인간 배아 신장 293 세포(HEK293rnKCC2b)18 를 비드 배스(37°C)에서 완전히 형질감염시켰다. 극저온 튜브에서 5mL의 새 배지가 들어 있는 원심분리 튜브로 세포를 옮깁니다. 셀을 1200 ×g에서 3-5 분 동안 돌립니다.
- 흡인기 피펫(진공 펌프에 고정)을 사용하여 상청액을 흡입하고 10mL의 새 배지를 추가하여 세포를 다시 부유시킵니다. 세포 현탁액을 10cm 접시에 옮깁니다.
- 접시를 인큐베이터에 넣고 가습 된 5 % CO2 분위기에서 37 °С에서 48 시간 동안 자....
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결과
여기서, 도 1에 제시된 대표적인 결과는 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 KCC2b(HEKrnKCC2b)18을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주에서 KCC2 및 NKCC1의 WNK-SPAK/OSR1 매개 인산화에 대한 스타우로스포린과 NEM의 영향을 조사하였다. 대표적인 결과에 대한 포괄적인 세부 사항은 Zhang et al.15에서 논의됩니다. NEM과 유사하게, 스타우로스포린은 KCC2 수송 활성을 향상시키고 NKCC1 활성을 억제할 수 있는 광범위한 키나아제 억제제이다15,20. HEK293 세포를 스타우로스포린 및 NEM으로 처리하면 T-루프 키나아제 도메인에 위치한 Thr233 및 hsSPAK의 S-루프 인산화 부위 Ser373인 SPAK .......
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토론
KCC2를 포함하는 뉴런에서 발현되는 CCC의 SLC12의 활성을 측정하기 위해 많은 방법이 사용되었습니다. 이러한 기술 중 다수는 다양한 질병 관련 돌연변이에서 이러한 수송체의 기능적 관련성과 구조-기능 패턴 분석에 대한 과학적 지식을 향상시키는 것으로 입증되었습니다. 비판적으로, 다양한 방법(21)에 대한 장점과 주의사항이 있다. 그러나 위에서 설명한 프로토콜은 KCC2의 기능과 활성을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 웨스턴 블롯을 사용하여 키나아제 조절 부위인 Thr906 및 Thr1007에서 KCC2 인산화를 평가하는 방법을 설명했습니다.
KCC2의 조절은 주요 세린/트레오닌 잔기1에서 인산화 및 탈인산화를 통해 발생합니다. 웨스턴 블로팅은 Thr906 및 Thr1007의 키나아제 조절 부위에서 KCC2 인산화를 조사하는 데 사용할 수 있는 효율적인 기술입니다. 원칙적으로, KCC2의 인.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 영국 왕립 학회 (보조금 번호 IEC \ NSFC \ 201094) 및 Commonwealth Ph.D. 장학금.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 40% 아크릴아미드 | Sigma-Aldrich | A2917 | SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용됩니다. |
| 황산염 당 암모늄 | Sigma-Aldrich | 248614 | SDS-PAGE를 위한 분리 및 쌓는 젤을 만드는 데 사용됩니다 |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | 웨스턴 블로팅 |
| 안티 KCC2 | Dundee University | S700C | 1차 항체로 사용 |
| pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | 의 1차 항체로 사용 |
| Dundee University | S961C | 웨스턴 블로팅 | |
| 안티 KCC2 pThr906 | , Dundee University | S959C | , 웨스턴 블로팅 |
| 안티 마우스 | 세포 신호 기술의 | 66002 | 2차 항체로 사용 |
| , Dundee University | S841B | 1차 항체로 사용 | |
| pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | 웨스턴 블로팅 |
| 안티 토끼 | 세포 신호 기술의 | C29F4 | 의 2 차 항체로 사용 |
| 웨스턴 블로팅 안티 SPAK의 2 차 항체로 사용 | |||
| Dundee University | S669D | 웨스턴 블로팅 | |
| 의 1 차 항체로 사용항-&베타;-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | UK의 1차 항체로 사용 |
| 135828 | 용해 완충액의 구성 요소로 사용 | ||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | 로딩 완충액 및 용해 완충액의 구성 요소로 사용 |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | 용해물 단백질 정량화에 사용 |
| 주조 장치 | Atto | WSE-1165W | SDS-page 전기영동 실행에 사용 |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5804 | 용해물 준비에 사용 |
| 원심분리기 | VWR | MicroStar 17R | 시료 방사에 사용 |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | 세포 배양 실험에 사용 |
| 건조 탈지유 | Marvel | N/A | 차단에 사용 완충 |
| 액 Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | 세포 배양 |
| ECL 시약 | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | 웨스턴 블로팅용 이미지 개발에 사용 |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | 용해 완충액 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | 의 구성 요소로 사용 완충액 |
| 전기영동 전원 공급 장치 | BioRad | PowerPAC HC | SDS 페이지 전기영동 실행에 전원을 공급하려면 |
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| 젤 블로팅 - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | 트랜스퍼 샌드위치를 만들기 위해 웨스턴 블로팅에 사용됨 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | 버퍼를 만드는 데 사용됨 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | 버전 6.0 | 그래프 플롯 및 데이터 분석에 사용됨 웨스턴 블로팅 |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | SDS-PAGE용 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용됨 |
| 가열 블록 | Grant | QBT1 | WB 로딩 샘플을 가열하는 데 사용됨 |
| HEK293 셀 | Merck UK | 12022001-1VL | 배양 실험용 세포주 |
| ImageJ Software | , Wayne Rasband 및 기여자; 미국 NIH | ImageJ 1.53e | 웨스턴 블로팅 이미지에서 밴드 강도를 측정하는 데 사용 |
| 이미징 시스템 | BioRad | ChemiDoc MP | 웨스턴 블로팅 이미지를 촬영하는 데 사용 |
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| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | 용해 버퍼 |
| 인산염 버퍼 식염수 | Sigma-Aldrich | D8537 | 세포 배양에 사용 |
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| 나트륨 염화물 | Sigma-Aldrich | S7653 | 세척 완충액의 구성 요소로 사용 |
| Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | TBS-T 완충액 준비 데 사용 |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | SDS-PAGE용 분리 및 쌓기 젤 제작에 사용; |
| 오르토 바나 데이트 | 나트륨 Sigma-Aldrich | S6508 | 용해 완충액의 구성 요소로 사용 |
| 피루브산 나트륨 | 그마 알드리치 | S8636 | 세포 배양 |
| 나트륨 -&베타 - 글리세로 인산염 | Merck UK | G9422 | 의 구성 요소로 사용 |
| (Streptomyces sp.< / em>) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | 세포 배양 실험에 사용됩니다 |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | 의 구성 요소로 사용됩니다 |
| SDS-PAGE를 위한 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용됩니다. | |||
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | 웨스턴 블로팅에서 단백질을 막에 전달하는 데 사용됩니다 |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | SDS-PAGE를 위한 분리 및 스태킹 젤을 만드는 데 사용됩니다. |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 용해 완충액 |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | 세포 배양에 사용 |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | TBS-T 완충액 진공 펌프로 사용 |
| Charles Austen | Dymax 5 | 세포 배양에 사용 | |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | 샘플 준비에 사용 |
| Vortex 믹서 | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | 분해된 시료 수조 혼합에 사용 |
| Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | 용액 배양에 사용 |
참고문헌
- de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
- Heubl, M., et al.
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