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Biochemistry

वेस्टर्न ब्लोटिंग का उपयोग करके न्यूरोनल के-सीएल सह-ट्रांसपोर्टर केसीसी 2 के कार्यों और गतिविधियों का अध्ययन

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64179
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल न्यूरोनल के-सीएल सह-ट्रांसपोर्टर केसीसी 2 के कार्यों और गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए पश्चिमी सोख्ता तकनीक के अनुप्रयोग पर प्रकाश डालता है। प्रोटोकॉल पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से किनेज नियामक साइटों Thr906/1007 पर KCC2 फॉस्फोराइलेशन की जांच का वर्णन करता है। इसके अलावा, KCC2 गतिविधि की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त तरीकों को इस पाठ में संक्षेप में हाइलाइट किया गया है।

Abstract

पोटेशियम क्लोराइड कोट्रांसपोर्टर्स 2 (केसीसी 2) केशन-क्लोराइड-कोट्रांसपोर्टर्स (सीसीसी) के विलेय वाहक परिवार 12 (एसएलसी 12) का एक सदस्य है, जो विशेष रूप से न्यूरॉन में पाया जाता है और सीएल-होमोस्टेसिस और परिणामस्वरूप कार्यात्मक जीबीएर्जिक अवरोध के उचित कार्य के लिए आवश्यक है। केसीसी 2 के उचित विनियमन में विफलता हानिकारक है और मिर्गी सहित कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों की व्यापकता से जुड़ी हुई है। केसीसी 2 के विनियमन में शामिल तंत्र को समझने के संबंध में काफी प्रगति हुई है, जो उन तकनीकों के विकास के लिए मान्यता प्राप्त है जो शोधकर्ताओं को इसके कार्यों और गतिविधियों का अध्ययन करने में सक्षम बनाते हैं; या तो प्रत्यक्ष (काइनेज नियामक साइटों फॉस्फोराइलेशन का आकलन) या अप्रत्यक्ष (जीएबीए गतिविधि का अवलोकन और निगरानी) जांच के माध्यम से। यहां, प्रोटोकॉल इस बात पर प्रकाश डालता है कि पश्चिमी सोख्ता तकनीक का उपयोग करके किनेज नियामक साइटों - टीएचआर 906 और टीएचआर 1007 पर केसीसी 2 फॉस्फोराइलेशन की जांच कैसे करें। केसीसी 2 गतिविधि को सीधे मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य क्लासिक तरीके हैं, जैसे कि रूबिडियम आयन और थैलियम आयन अपटेक परख। जीएबीए गतिविधि को मापने के लिए पैच-क्लैंप-इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी जैसी आगे की तकनीकों का उपयोग किया जाता है; इसलिए, इंट्रासेल्युलर क्लोराइड आयन होमियोस्टेसिस के आकलन द्वारा सूचित के रूप में अप्रत्यक्ष रूप से सक्रिय और / या निष्क्रिय केसीसी 2 को दर्शाता है। इन अतिरिक्त तकनीकों में से कुछ पर इस पांडुलिपि में संक्षेप में चर्चा की जाएगी।

Introduction

पोटेशियम क्लोराइड कोट्रांसपोर्टर्स 2 (केसीसी 2) केशन-क्लोराइड-कोट्रांसपोर्टर्स (सीसीसी) के विलेय वाहक परिवार 12 (एसएलसी 12) का एक सदस्य है, जो विशेष रूप से न्यूरॉन में पाया जाता है और सीएल-होमियोस्टैसिस के उचित कार्य के लिए आवश्यक है और इसके परिणामस्वरूप कार्यात्मक जीबीएर्जिक अवरोध 1,2,3,4 है। केसीसी 2 द्वारा 4-6 एमएम पर कम इंट्रान्यूरोनल सीएल-एकाग्रता ([सीएल-]आई) का रखरखाव मस्तिष्कऔर रीढ़ की हड्डी में γ-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीए)/ग्लाइसिन हाइपरपोलराइजेशन और सिनैप्टिक अवरोध की सुविधा प्रदान करता है। केसीसी 2 के उचित विनियमन में विफलता मिर्गीसहित कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों की व्यापकता से जुड़ी हुई है। इसके अलावा, केसीसी 2-मध्यस्थता सीएल- एक्सट्रूज़न और बिगड़ा हुआ हाइपरपोलराइज़िंग जीएबीएए और / या ग्लाइसिन रिसेप्टर-मध्यस्थता धाराओं को मिर्गी, न्यूरोपैथिक दर्द और स्पास्टिकिटी 6,7 में फंसाया गया है। न्यूरोनल केसीसी 2 को अपने सी-टर्मिनल इंट्रासेल्युलर डोमेन के भीतर प्रमुख नियामक अवशेषों के फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से नकारात्मक रूप से संशोधित किया जाता है, जिसमें नो-लाइसिन (डब्ल्यूएनके)-एसटीई 20/ एसपीएस 1-संबंधित प्रोलाइन/ एलानिन-रिच (एसपीएके)/ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस-रिस्पॉन्सिव (ओएसआर) काइनेज सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स1 होता है, जो अपरिपक्व न्यूरॉन्स 2,8,9 में विध्रुवीकृत जीएबीए गतिविधि के रखरखाव की सुविधा प्रदान करता है। . डब्ल्यूएनके-एसपीएके /ओएसआर 1 थ्रेओनिन अवशेषों 906 और 1007 (टीएचआर 906 / टीएचआर 1007) को फॉस्फोराइलेट करता है और बाद में केसीसी 2 के एमआरएनए जीन अभिव्यक्ति को डाउनरेगुलेट करता है, जिससे इसके शारीरिक कार्य 8,10 में गिरावट आती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, हालांकि, यह पहले से ही एक तथ्य है कि WNK-SPAK / OSR1 किनेज कॉम्प्लेक्स को केसीसी 2 अभिव्यक्ति 1,2,4,11,12 को फॉस्फोराइलेट और बाधित करने के लिए जाना जाता है, और यह कि फॉस्फोराइलेट Thr906 / Thr1007 के लिए किनेज कॉम्प्लेक्स सिग्नलिंग मार्गों का निषेध KCC2 एमआरएनए जीन 13,14,15 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है। . यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से न्यूरोनल केसीसी 2 और एनए +-के +-2सीएल-कोट्रांसपोर्टर्स 1 (एनकेसीसी 1) अभिव्यक्ति का विनियमन सहवर्ती रूप से और इसके विपरीत पैटर्न 1,4,16 में काम करता है।

केसीसी 2 के विनियमन में शामिल तंत्र की समझ के संबंध में लगातार और काफी प्रगति हुई है, जो तकनीकों के विकास के लिए मान्यता प्राप्त है जो शोधकर्ताओं को इसके कार्यों और गतिविधियों का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है; या तो प्रत्यक्ष (काइनेज नियामक साइटों फॉस्फोराइलेशन का आकलन) या अप्रत्यक्ष (जीएबीए गतिविधि का अवलोकन और निगरानी) जांच के माध्यम से। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल किनेज नियामक साइटों Thr906/1007 पर कोट्रांसपोर्टर के फॉस्फोराइलेशन की जांच करके न्यूरोनल K+-Cl-सह-ट्रांसपोर्टर KCC2 के कार्यों और गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए पश्चिमी सोख्ता तकनीकों के अनुप्रयोग पर प्रकाश डालता है।

वेस्टर्न ब्लॉट एक विधि है जिसका उपयोग ऊतक या कोशिका के नमूने से रुचि के विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह विधि पहले वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से प्रोटीन को आकार से अलग करती है। एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन को चिह्नित करने से पहले प्रोटीन को इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से एक ठोस समर्थन (आमतौर पर एक झिल्ली) में स्थानांतरित किया जाता है। एंटीबॉडी को विभिन्न टैग या फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित किया जाता है जो या तो कलरिमेट्रिक, केमिल्यूमिनेसेंस या फ्लोरेसेंस विधियों का उपयोग करके पता लगाया जाता है। यह प्रोटीन के मिश्रण से एक विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति देता है। इस तकनीक का उपयोग केसीसी1 के फॉस्फोस्पेसिफिक साइटों को चिह्नित करने के लिए किया गया है और इसका उपयोग काइनेज इनहिबिटर की पहचान करने के लिए किया गया है जो केसीसी 3 टीएचआर 991 / टीएचआर 1048 फॉस्फोराइलेशन17 को रोकते हैं। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, कोई विशेष रूप से सेल / ऊतक लाइसेट से कुल और फॉस्फोराइलेटेड केसीसी 2 का पता लगा सकता है। सिद्धांत रूप में, इस तकनीक द्वारा प्रोटीन-संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाना अत्यधिक महत्वपूर्ण है क्योंकि यह केसीसी 2 के फॉस्फो-साइटों पर सहकारी गतिविधियों की समझ में सुधार करने में मदद करता है, जो उनके शारीरिक नियमों में शामिल आणविक तंत्र पर प्रकाश डालता है। कुल प्रोटीन अभिव्यक्ति का मात्रात्मक विश्लेषण केसीसी 2 के कार्य और गतिविधि का प्रतिनिधि है। केसीसी 2 गतिविधि को सीधे मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य शास्त्रीय तरीके हैं, जैसे कि रुबिडियम आयन और थैलियम आयन अपटेक परख। जीएबीए गतिविधि को मापने के लिए पैच-क्लैंप-इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी जैसी आगे की तकनीकों का उपयोग किया जाता है; इसलिए, इंट्रासेल्युलर क्लोराइड आयन होमियोस्टेसिस के आकलन द्वारा सूचित के रूप में अप्रत्यक्ष रूप से सक्रिय और / या निष्क्रिय केसीसी 2 को दर्शाता है।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल रुचि के विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए पश्चिमी सोख्ता विधि का वर्णन करता है।

1. सेल संस्कृति और अभिकर्मक

  1. सेल कल्चर प्रक्रिया से पहले मोती स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में सभी अभिकर्मकों को गर्म करें। कल्चर माध्यम तैयार करें, डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के 1% प्रत्येक, 100 एक्स गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 100 एमएम सोडियम पाइरूवेट और 100 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
  2. मानव भ्रूण गुर्दे की 293 कोशिकाओं (एचईके 293आरएनकेसीसी 2 बी) 18 को पूरी तरह से मोती स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित किया गया। क्रायोवियल ट्यूब से कोशिकाओं को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल ताजा मीडिया होता है। सेल को 3-5 मिनट के लिए 1200 × ग्राम पर घुमाएं।
  3. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करने के लिए एक एस्पिरेटर पिपेट (वैक्यूम पंप पर तय) का उपयोग करें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए 10 एमएल ताजा मीडिया जोड़ें। सेल निलंबन को 10 सेमी डिश प्लेट में स्थानांतरित करें।
  4. डिश को इनक्यूबेटर में रखें और इसे ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री पर 48 घंटे तक बढ़ने दें। स्वस्थ सेल विकास सुनिश्चित करने के लिए इनक्यूबेशन अवधि की निगरानी करें। इनक्यूबेशन अवधि के बाद 90% से अधिक संगम प्राप्त करने पर कोशिकाओं को विभाजित करें।
  5. कोशिकाओं से पुराने मीडिया को बाहर निकालें और धीरे से फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें। 2 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें और कमरे के तापमान पर लगभग 1-2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. डिश में ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं को धीरे से धोने के लिए 2 एमएल पूर्ण मीडिया का उपयोग करें। नए व्यंजनों में 9 एमएल ताजा मीडिया जोड़ें और प्रत्येक नए व्यंजन में पुराने पकवान से 1 एमएल समाधान जोड़ें। स्प्लिट सेल व्यंजनों को 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें ताकि ≥ 90% स्थिरता प्राप्त की जा सके।
  7. लाइसिस बफर में कोशिकाओं की कटाई से पहले 15 मिनट के लिए नियंत्रण के रूप में डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, 8 μM staurosporine, या 0.5 mM N-ethylmaleimide (NEM)।

2. सेल लाइसेट और लोडिंग नमूने की तैयारी

  1. संस्कृति पकवान (अभिकर्मक प्रक्रियाओं से) पर मीडिया को उत्तेजित करें। सेल कल्चर को बर्फ पर रखें और कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोएं।
  2. पीबीएस को एस्पिरेट करें, फिर 1.0 एमएल आइस-कोल्ड लाइसिस बफर जोड़ें जिसमें 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.5), 1 एमएम एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (β-एमिनोइथाइल ईथर) -एन, एन, एन', एन'-टेट्राएसिटिक एसिड (ईजीटीए), 1 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्रासिटिक एसिड (ईडीटीए), 50 एमएम सोडियम फ्लोराइड, 5 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 10 एमएम सोडियम-β-10 एमएम सोडियम-100, 1 एमएम सोडियम-100, 1 एमएम सोडियम-100, 1 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 1 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 1 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 1000, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-ग्लाइकेरोस, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-ग्लाइकेरोस, 1 एमएम एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (β-एमिनोइथाइल ईथर) -एन, एन, एन,एन', एन'-टेट्रासिटिक एसिड (ईडीटीए), 50 एमएम सोडियम फ्लोराइड, 5 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 10 एमएम सोडियम फ्लोराइड, 5 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 1 एमएम सोडियम-100, 1 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-100, 10 एमएम सोडियम-ग्लाइकेरोफॉस्फेट, 1 एमएम एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (β-एमिनोइथाइल ई डिश में 1 एमएम बेंजामाइन, 0.1% (वी / वी) 2-मर्काप्टोएथेनॉल, और 2 एमएम फेनिलमेथिलसल्फोनाइलफ्लोराइड (पीएमएसएफ)।
    नोट: सेल फसल के दौरान लाइसिस बफर की मात्रा डिश आकार के साथ भिन्न होती है, उदाहरण के लिए, 1 एमएल लाइसिस बफर प्रति 1 x 107 कोशिकाओं / 100 मिमी डिश / 150 सेमी2 फ्लास्क के लिए उपयुक्त है, जबकि 0.5 एमएल प्रति 5 x 10 6 कोशिकाओं /60 मिमी डिश / 75 सेमी2 फ्लास्क के लिए उपयुक्त है।
  3. डिश के तल से कोशिकाओं को स्क्रैप करने के लिए एक ठंडे प्लास्टिक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें, फिर सेल निलंबन को पहले से ही बर्फ पर माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए धीरे से एक पिपेट का उपयोग करें। लगातार ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए उत्तेजित करें।
  4. सेल लाइसेट को 20 मिनट के लिए 16,000 x g पर ठंडे सेंट्रीफ्यूज (4 डिग्री सेल्सियस) में घुमाएं, ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज से धीरे से हटा दें, और इसे बर्फ पर रखें। सुपरनैटेंट को एक प्री-कूल्ड ताजा ट्यूब में इकट्ठा करें और गोली को छोड़ दें।
    नोट: सेल प्रकार के आधार पर सेंट्रीफ्यूजेशन बल और समय को अलग करना आवश्यक हो सकता है। हालांकि, सामान्य दिशानिर्देश 20 मिनट के लिए 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन को प्रोत्साहित करते हैं। हालांकि, यह हर प्रयोग के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ल्यूकोसाइट्स जैसी नाजुक कोशिकाओं को बहुत हल्की सेंट्रीफ्यूजेशन गति की आवश्यकता होती है।

3. सेल लाइसेट से इम्यूनोप्रेसिपेंट्स की तैयारी

  1. प्रोटीन-जी-सेफ्राइज का पिपेट 300 μL एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में उत्पन्न हुआ। घोल को 2 मिनट के लिए 500 x g पर घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  2. पीबीएस के 500 μL जोड़ें और घोल को अच्छी तरह से भंवर करें। घोल को 2 मिनट के लिए 500 x g पर घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। इस चरण को दोहराएँ।
  3. 1 मिलीग्राम एंटी-केसीसी 2 टीएचआर 906 और एंटी-केसीसी 2 टीएचआर 1007 एंटीबॉडी को 200 μL प्रोटीन जी-सेफ्रोस मोतियों के साथ मिलाएं और पीबीएस के साथ मात्रा को 500 μL तक बनाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए कंपन मंच या घूर्णन पहिया पर हिलाएं। पीबीएस के साथ 2x धो लें।
  4. पूरे सेल लाइसेट पर प्रोटीन का परिमाणीकरण करें और धुले हुए मोतियों में 1 मिलीग्राम सेल लाइसेट जोड़ें। धीरे से 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एंड-टू-एंड रोटेटर में इनक्यूबेट करें। मोतियों को स्पिन करें और उन्हें 150 एमएम सोडियम क्लोराइड (NaCl) युक्त पीबीएस के साथ 3x धोएं।
  5. इम्यूनोप्रेसिपिटेंट्स (बीड्स) को 200 μL PBS के साथ 3x धोएं। 1x लिथियम डोडेसिल सल्फेट (एलडीएस) नमूना बफर के 100 μL में अंतिम गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रोटर शेकर में हिलाएं और उन्हें 10 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक में इनक्यूबेट करें। 2 मिनट के लिए 11,000 x g पर लोडिंग नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और जेल लोडिंग के लिए सुपरनैटेंट का उपयोग करें।

4. पश्चिमी धब्बा का प्रदर्शन

  1. कास्टिंग उपकरण को इकट्ठा करें और कास्टिंग ग्लास के शीर्ष से लगभग 2 सेमी जगह की अनुमति देने के लिए जेल डालने के लिए ताजा तैयार 8% अलग जेल डालें (नुस्खा / तैयारी के लिए तालिका 1 देखें)। सेटअप में पूर्ण आइसोप्रोपेनोल का 200 μL जोड़ें और इसे 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने दें।
    नोट: सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) के लिए पॉलीक्रिलामाइड जेल नुस्खा रुचि के प्रोटीन के आकार पर निर्भर करता है (तालिका 2)। इसलिए, वांछित जेल प्रतिशत निर्धारित करने से पहले प्रोटीन के आकार पर ध्यान दें।
  2. आइसोप्रोपेनॉल को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और लगभग 200 μL आसुत जल के साथ जेल को सावधानीपूर्वक कुल्ला करें। कास्टिंग सेटअप पर लगभग 2 सेमी स्थान को भरने के लिए ताजा तैयार 6% स्टैकिंग जेल जोड़ें (नुस्खा / तैयारी के लिए तालिका 1 देखें)। धीरे से कुएं की कंघी में फिट करें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने दें।
  3. कैस्टेड जेल को वैद्युतकणसंचलन टैंक में ठीक करें।
  4. 10x ट्रांसफर बफर तैयार करने के लिए 1000 एमएल आसुत जल में 30.3 ग्राम ट्राइस बेस, 144.1 ग्राम ग्लाइसिन और 10 ग्राम एसडीएस को भंग करें। 890 एमएल आसुत जल में 10% एसडीएस के 10 एमएल और 100 एमएल 10एक्स ट्रांसफर बफर को जोड़कर 1एक्स रनिंग बफर तैयार करें।
  5. टैंक में 1x रनिंग बफर डालें। पहले कुएं में आणविक भार मार्कर के 5 μL लोड करें और SDS-PAGE जेल के प्रत्येक कुएं में समान मात्रा में प्रोटीन लोड करें (उपयोग किए गए कंघी आकार के आधार पर 18-30 μL के बीच)। खाली कुओं को 1x LDS से भरें और जेल को 120 V पर लगभग 90-120 मिनट तक चलाएं।
  6. 10x ट्रांसफर बफर तैयार करने के लिए 1000 एमएल आसुत जल में 58.2 ग्राम ट्राइस बेस और 29.3 ग्राम ग्लाइसिन को भंग करें। नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को 20% मेथनॉल युक्त 1x स्थानांतरण बफर के साथ सक्रिय करें। ट्रांसफर बफर के साथ जेल और झिल्ली को कुल्ला करें और धीरे से उन्हें तैयार स्टैक पर फैलाएं।
    नोट: रनिंग और ट्रांसफर बफर के पीएच को समायोजित करने की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि उन्हें आवश्यक इष्टतम पीएच पर होना चाहिए। इसके अलावा, समय बचाने के लिए प्रयोग से पहले इन बफर को तैयार करना और उन्हें कमरे के तापमान पर स्टोर करना उचित है।
  7. सैंडविच को इस क्रम में स्थानांतरित करने के लिए व्यवस्थित करें: नकारात्मक इलेक्ट्रोड (काला फ्रेम / अंत) - सैंडविच फोम - फिल्टर पेपर - कुल्ला एसडीएस-पेज जेल - कुल्ला नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली - फिल्टर पेपर - सैंडविच फोम - सकारात्मक इलेक्ट्रोड (लाल फ्रेम)। ट्रांसफर टैंक में इकट्ठे सैंडविच को ढेर करें और 90 मिनट के लिए 90 वी या 360 मिनट के लिए 30 वी पर चलाएं।

5. एंटीबॉडी धुंधला और छवि विकास

  1. झिल्ली को हटा दें और इसे सूखने दें। 0.1% 1x ट्वीन 20 (1x TBS-T) युक्त ट्राइस-बफर्ड खारा में 5% स्किम्ड दूध से बने ब्लॉकिंग बफर का उपयोग करके कमरे के तापमान पर झिल्ली को 1 घंटे के लिए ब्लॉक करें।
  2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी 8,15,19 और बीटा-एक्टिन (लोडिंग नियंत्रण) के उचित कमजोर पड़ने के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें। झिल्ली को 5 मिनट के लिए 1x TBS-T के तीन वॉश में धोएं।
    नोट: बीटा-एक्टिन, अल्फा-ट्यूबुलिन, या ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज एंटीबॉडी जैसे लोडिंग नियंत्रण के साथ अलग झिल्ली का इनक्यूबेशन बाद के परिमाणीकरण के दौरान अन्य पश्चिमी सोख्ता परिणामों को सामान्य करना है। प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए अनुशंसित कमजोर पड़ने निर्माता के मैनुअल में उपलब्ध है।
  3. कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध करने में द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ धुली हुई झिल्ली को 5000 गुना पतला करें। फिर, झिल्ली 3x को 1x TBS-T में 5 मिनट के लिए धो लें।
    नोट: यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि द्वितीयक एंटीबॉडी को उन प्रजातियों के खिलाफ उठाया जाना चाहिए जिनमें प्राथमिक एंटीबॉडी उठाया जाता है। उदाहरण के लिए, यदि कुल KCC2 का प्राथमिक एंटीबॉडी माउस एंटी-KCC2 है, तो एंटी-माउस के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. इमेजिंग बोर्ड पर धुली हुई झिल्ली रखें। प्रत्येक बढ़ी हुई केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) अभिकर्मक के बराबर मात्रा में मिलाएं और संकेतों को विकसित करने के लिए झिल्ली पर मिश्रित समाधान को धीरे से फैलाएं।

6. इमेजिंग सिस्टम और डेटा परिमाणीकरण का उपयोग करके छवि अधिग्रहण

  1. इमेजिंग बोर्ड को इमेजिंग के लिए इमेजिंग सिस्टम पर उपयुक्त डिब्बे में स्थानांतरित करें। छवि प्रसंस्करण के लिए कंप्यूटर पर इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें।
  2. उपकरण पट्टी पर, नया प्रोटोकॉल क्लिक करें और एकल चैनल चुनें. एप्लिकेशन संवाद बॉक्स के तहत चयन करें पर क्लिक करें , ब्लोट पर स्क्रॉल करें और या तो केमी हाय संवेदनशीलता या केमी हाय रिज़ॉल्यूशन का चयन करें। फिर प्राप्त करने के लिए छवियों की अवधि और संख्या सेट करने के लिए सिग्नल संचय सेटअप पर क्लिक करें।
  3. प्रोटोकॉल सेटअप के तहत स्थिति जेल पर क्लिक करें और यदि आवश्यक हो तो जेल को इमेजिंग सिस्टम में समायोजित करें। चित्र प्राप्त करने के लिए रन प्रोटोकॉल क्लिक करें.
  4. कंप्यूटर पर छवियों को सहेजने के लिए इमेजिंग कैटलॉग बॉक्स के तहत अधिग्रहित छवियों में से एक पर राइट-क्लिक करें। वांछित छवि पर नेविगेट करें और छवि का चयन करें पर क्लिक करें और रन संवाद बॉक्स के तहत जारी रखें।
  5. छवि के कंट्रास्ट और पिक्सेल संतृप्ति को समायोजित करने के लिए छवि ट्रांसफॉर्म आइकन पर क्लिक करें। वांछित छवि प्रारूप के आधार पर कंप्यूटर पर छवि को सहेजने के लिए सामान्य टूलबार पर स्क्रीनशॉट आइकन पर क्लिक करें।
  6. इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बैंड घनत्व को मापें और उपयुक्त सांख्यिकीय उपकरणों का उपयोग करके विश्लेषण करें।

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Representative Results

यहां, चित्रा 1 में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम ने पश्चिमी सोख्ता तकनीक का उपयोग करके एचईके 293 सेल लाइनों में केसीसी 2 और एनकेसीसी 1 के डब्ल्यूएनके-एसपीएके / ओएसआर 1 मध्यस्थता फॉस्फोराइलेशन पर स्टॉरोस्पोरिन और एनईएम के प्रभाव की जांच की। प्रतिनिधि परिणामों पर व्यापक विवरण झांग एट अल .15 में चर्चा की गई है। एनईएम के समान, स्टौरोस्पोरिन एक व्यापक किनेज अवरोधक है जो केसीसी 2 परिवहन गतिविधि को बढ़ा सकता है और एनकेसीसी 1 गतिविधि15,20 को रोक सकता है। स्टौरोस्पोरिन और एनईएम के साथ एचईके 293 कोशिकाओं के उपचार ने एसपीएके लक्ष्य साइटों पर फॉस्फोराइलेशन में कमी का कारण बना - टी-लूप काइनेज डोमेन में स्थित टीएचआर 233 और एचएसएसपीएके के एस-लूप फॉस्फोराइलेशन साइट सेर 373। इस प्रकार, दोनों यौगिकों ने उपरोक्त एसपीएके फॉस्फो-साइटों के फॉस्फोराइलेशन स्तर को कम किया। इसके अलावा, स्टौरोस्पोरिन ने एचईकेआरएनकेसीसी 2 बी में सेर 940 के फॉस्फोराइलेशन को कम कर दिया, लेकिन एनईएम ने इसके फॉस्फोराइलेशन में काफी वृद्धि की। इसके अलावा, स्टॉरोस्पोरिन टीएचआर 505 साइट पर फॉस्फोराइलेशन को कम करता है, जबकि एनईएम ने उसी साइट पर फॉस्फोराइलेशन में मामूली, लेकिन महत्वहीन वृद्धि का कारण बना। टीएचआर 505 साइट पर प्रोटीन काइनेज सी (पीकेसी) के फॉस्फोराइलेशन पर दोनों यौगिकों के अंतर प्रभाव, और सेर 940 साइट पर केसीसी 2 बी अच्छी तरह से सहसंबंधित हैं। प्रतिनिधि परिणाम से यह भी पता चला कि दोनों एजेंटों ने कुल rnKCC2b, hsNKCC1, या hsSPAK की अभिव्यक्ति को बदल दिया। एनईएम (लेकिन स्टॉरोस्पोरिन उपचार नहीं) ने कुल केसीसी 2 राशि की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि की, जबकि दोनों यौगिकों के साथ इलाज किए जाने पर कुल एनकेसीसी 1 और एसपीएके की अभिव्यक्ति में काफी बदलाव नहीं हुआ। इसके अलावा, दो यौगिकों ने Thr233 और Ser373 साइटों पर SPAK के फॉस्फोराइलेशन में कमी का कारण बना, और यह क्रमशः rnKCC2b और HSNKCC1 में Thr906/Thr1007 और Thr203/207/212 साइटों के संक्षिप्त फॉस्फोराइलेशन के साथ सहसंबद्ध है। इसके अतिरिक्त, स्टॉरोस्पोरिन और एनईएम ने क्रमशः आरएनकेसीसी 2 बी में सेर 940 साइट पर पीकेसी के फॉस्फोराइलेशन को कम और बढ़ाया, जो क्रमशः स्टॉरोस्पोरिन और एनईएम उपचार पर टीएचआर 505 साइट पर पीकेसी -δ के फॉस्फोराइलेशन में कमी और वृद्धि के साथ सहसंबद्ध है (चित्रा 1)।

Figure 1
चित्र 1: RNKCC2b और HSNKCC1 फॉस्फो-साइटों का मात्रात्मक विश्लेषण HEKrnKCC2b कोशिकाओं में Staurosporine और NEM उपचार पर। (A) स्थिर रूप से स्थानांतरित HEK rn KCC2b कोशिकाओं कोDMSO (नियंत्रण), 8 μM staurosporine, या 0.5 mM NEM के साथ 15 मिनट के लिए इलाज किया गया था। सेल लाइसेट को काटा गया और संकेतित एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोप्रेसिपेशन (आईपी) और इम्यूनोब्लॉट (आईबी) के अधीन किया गया। संक्षेप: डी = डिमेरिक केसीसी 2; एम = मोनोमेरिक केसीसी 2। (बी) स्थिर रूप से स्थानांतरित एचईकेआरएनकेसीसी 2 बी कोशिकाओं का इम्यूनोब्लॉट परिमाणीकरण। बैंड तीव्रता को इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ निर्धारित किया गया था। पी < 0.001; ** पी < 0.01; विलकॉक्सन-मैन व्हिटनी परीक्षण (एन = 6)। इस आंकड़े को झांग एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

8% अलग करने वाले जेल का 8 एमएल 6% स्टैकिंग जेल का 5 एमएल
आवश्यक सामग्री Volume (μL) आवश्यक सामग्री Volume (μL)
आसुत H2O 4200 आसुत H2O 2900
40% एक्रिलामाइड 1600 40% एक्रिलामाइड 750
1.5 M Tris pH 8.8 2000 0.5 M Tris pH 6.8 1250
10% एसडीएस 80 10% एसडीएस 50
10% एपीएस 80 10% एपीएस 50
TEMED 8 TEMED 5
अलग करने वाला जेल बनाना:
1) ddH2O के 4.2 mL से शुरू करें
2) 40% एक्रिलामाइड/bis-acrylamide समाधान का 1.6 mL जोड़ें
3) 1.5 M Tris pH 8.8 का 2 mL जोड़ें और मिलाएं
4) 10% SDS के 80 μL में मिलाएं
5) उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, 8 μL TEMED जोड़ें और मिलाएं
6) 10% APS* का 80 μL जोड़ें और मिलाएं
स्टैकिंग जेल बनाना:
1) ddH2O के 2.9 mL से शुरू करें
2) 40% एक्रिलामाइड/bis-acrylamide समाधान का 0.75 mL जोड़ें
3) 0.5 M Tris pH 6.8 का 1.25 mL जोड़ें और मिलाएं
4) 10% SDS के 50 μL में मिलाएं
5) उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, 5 μL TEMED जोड़ें और मिलाएं
6) 10% APS* का 50 μL जोड़ें और मिलाएं
एसडीएस = सोडियम डोडेसिल सल्फेट
एपीएस = अमोनियम प्रति सल्फेट
TEMED = N, N, N, N-टेट्रामेथाइलेथिलीनडायमाइन
* एपीएस के अतिरिक्त, समाधान को तुरंत कास्टिंग उपकरण में डाला जाना चाहिए क्योंकि समाधान कुछ ही मिनटों में बहुलक हो जाता है। इसलिए, समाधान की आवश्यकता होने पर जेल समाधानों को अलग करने और ढेर करने की सलाह दी जाती है।

तालिका 1: पॉलीक्रिलामाइड जेल मिश्रण बनाने के लिए नुस्खा (जेल समाधान को अलग करना और ढेर करना)।

जेल प्रतिशत (%) प्रोटीन का आकार (केडीए)
20 तक 4 से 40
15 12 से 45
12.5 10 से 70
10 15 से 100
8 50 से 200
4 से 6 > 200

तालिका 2: प्रोटीन के विभिन्न आकारों के लिए अनुशंसित एसडीएस-पेज जेल प्रतिशत

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Discussion

सीसीसी के एसएलसी 12 की गतिविधियों को मापने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है जो न्यूरॉन्स में व्यक्त किए जाते हैं, जिसमें केसीसी 2 भी शामिल है। इनमें से कई तकनीकों ने इन ट्रांसपोर्टरों की कार्यात्मक प्रासंगिकता और विभिन्न रोग-संबंधी उत्परिवर्तनों में उनकी संरचना-कार्य पैटर्न के विश्लेषण पर वैज्ञानिक ज्ञान को बढ़ाने के लिए साबित किया है। गंभीर रूप से,विभिन्न तरीकों के फायदे और चेतावनी हैं। हालांकि, ऊपर बताए गए प्रोटोकॉल ने पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके किनेज नियामक साइटों, टीएचआर 906 और टीएचआर 1007 पर केसीसी 2 फॉस्फोराइलेशन का आकलन कैसे किया जाए, जो केसीसी 2 के कार्यों और गतिविधियों का अध्ययन करने में सहायक हो सकता है।

केसीसी 2 का विनियमन प्रमुख सेरीन / थ्रेओनिनअवशेषों पर फॉस्फोराइलेशन और डीफॉस्फोराइलेशन के माध्यम से होता है। वेस्टर्न ब्लॉटिंग एक कुशल तकनीक है जिसका उपयोग टीएचआर 906 और टीएचआर 1007 में किनेज नियामक साइटों पर केसीसी 2 फॉस्फोराइलेशन की जांच के लिए किया जा सकता है। सिद्धांत रूप में, केसीसी 2 के फॉस्फोराइलेशन में परिवर्तन का पता फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके लगाया जाता है जो इम्यूनोब्लोट नमूने / रुचि के प्रोटीन के फॉस्फो-पेप्टाइड्स के खिलाफ निर्देशित होते हैं। वेस्टर्न ब्लॉट एक विधि है जिसका उपयोग ऊतक या कोशिका के नमूने से रुचि के विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह विधि पहले वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से प्रोटीन को आकार से अलग करती है। एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन को चिह्नित करने से पहले प्रोटीन को इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से एक ठोस समर्थन (आमतौर पर एक झिल्ली) में स्थानांतरित किया जाता है। एंटीबॉडी को विभिन्न टैग या फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित किया जाता है जो या तो कलरिमेट्रिक, केमिल्यूमिनेसेंस या फ्लोरेसेंस विधियों का उपयोग करके पता लगाया जाता है। यह प्रोटीन के मिश्रण से एक विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति देता है। इस तकनीक का उपयोग केसीसी 2,8 के फॉस्फोस्पेसिफिक साइटों को चिह्नित करने के लिए किया गया है और इसका उपयोग केसीसी 2 के अवरोधकों की पहचान करने के लिए किया गया है जो केसीसी 2 टीएचआर 906 / टीएचआर 1007 फॉस्फोराइलेशन15 का विरोध करते हैं। आणविक जीव विज्ञान प्रयोगों में उनके लाभ के कारण एचईके 293 लाइनें कई प्रयोगों के लिए उपयोग में हैं। वे पुनरुत्पादन करने के लिए त्वरित हैं, बनाए रखने में आसान हैं, और अभिकर्मक और प्रोटीन उत्पादन के लिए अत्यधिक कुशलहैं। हालांकि, कुछ राय यह मानती हैं कि यह न्यूरोबायोलॉजी प्रयोगों को पूरा करने के लिए सबसे उपयुक्त उम्मीदवार नहीं हो सकता है क्योंकि यह मस्तिष्क से प्राप्त कोशिका नहीं है, और इसलिए इसकी शारीरिक विशिष्टता तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में संदिग्ध हो सकती है। हालांकि, पिछले कार्यों से पता चला है कि एचईके 293 कोशिकाओं और वास्तविक न्यूरोनल ऊतकों / कोशिकाओं15,23 में केसीसी 2 की अभिव्यक्ति में समान परिणाम देखे जाते हैं। इसलिए, तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एचईके 293 की प्रासंगिकता को पूरी तरह से त्याग नहीं दिया जा सकता है।

पश्चिमी सोख्ता तकनीक द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण से जुड़े अध्ययनों में, लाइसिस बफर संरचना, उपयोग किए जाने वाले डिटर्जेंट की प्रकृति (प्रकार और एकाग्रता) और प्रोटीज अवरोधकों की पसंद पर विशिष्ट ध्यान दिया जाना चाहिए। बफर की संरचना को लक्ष्य प्रोटीन के अनुरूप अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि इसकी घुलनशीलता और निष्कर्षण प्रक्रियाओं को सुविधाजनक बनाया जा सके, और पश्चिमी ब्लॉट25 द्वारा इसका आसानी से पता लगाने की अनुमति दी जा सके। कम सांद्रता पर हल्के डिटर्जेंट को आमतौर पर घुलनशील प्रोटीन के लिए आवश्यक होता है, जबकि झिल्ली प्रोटीन को मजबूत डिटर्जेंट स्थितियों की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, मजबूत डिटर्जेंट बातचीत को बाधित कर सकते हैं और कॉम्प्लेक्स खो सकते हैं। डिटर्जेंट के प्रकार और सांद्रता दोनों प्रोटीन की प्रकृति और गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए, इन डिटर्जेंट के लिए सांद्रता की प्रतिबंधित / सहन सीमा से चिपके रहने की आवश्यकता है। प्रोटीज अवरोधक के अलावा लक्ष्य प्रोटीन को अंतर्जात प्रोटीन द्वारा अवक्रमित होने से रोका जाएगा, और प्रोटियोलिटिक दरों को प्रभावी ढंग से कम करने के लिए इष्टतम अनुशंसित कार्य तापमान 4 डिग्री सेल्सियस है। कभी-कभी, एंटीबॉडी के लिए उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोब्लॉट संकेतों को प्राप्त करने के लिए जो खराब इम्यूनोब्लॉट सिग्नल देते हैं, इम्यूनोप्रेसिपेशन (आईपी) को पश्चिमी सोख्ता के लिए अपस्ट्रीम प्रयोग के रूप में किया जाता है। यह तकनीक लाभप्रद है क्योंकि यह एंटीजन और उनके संबंधित एंटीबॉडी के बीच उनके मूल रचना में उनके परिणामस्वरूप पृथक्करण और परिमाणीकरण से पहले बातचीत की सुविधा प्रदान करतीहै। इसलिए, आईपी पश्चिमी सोख्ता प्रक्रियाओं से आउटपुट की गुणवत्ता को बढ़ा सकता है। आईपी तकनीक के आवेदन से पहले, पश्चिमी सोख्ता द्वारा पूरे सेल लाइसेट या इनपुट अंशों का विश्लेषण करके लाइसेट में सह-इम्यूनोप्रेसिपिटेटेड पार्टनर प्रोटीन की अभिव्यक्ति की उपस्थिति और दक्षता का आकलन करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन के लिए वांछित प्रतिशत जेल समाधान तैयार करने से पहले जांच किए जाने वाले प्रोटीन के आणविक भार का पूर्व ज्ञान आवश्यक है क्योंकि प्रोटीन का आकार जेल मैट्रिक्स के चोरी प्रभाव को प्रभावित करता है।

हालांकि, इस तकनीक द्वारा प्रोटीन-संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाना अत्यधिक महत्वपूर्ण है क्योंकि यह केसीसी 2 के फॉस्फो-साइटों पर सहकारी गतिविधियों की समझ में सुधार करने में मदद करता है जो कोट्रांसपोर्टर फॉस्फोराइलेशन और सिग्नलिंग मार्ग की अखंडता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है जो कोट्रांसपोर्टर गतिविधि की विश्वसनीय भविष्यवाणी के लिए कोट्रांसपोर्टर को विनियमित कर सकता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पश्चिमी धब्बा तकनीक केवल अर्ध-मात्रात्मक डेटा का उत्पादन करने में सक्षम है, जिसका अर्थ है कि तकनीक केवल प्रोटीन अभिव्यक्तियों के सापेक्ष मूल्यांकन पर प्रकाश डालती है लेकिन पूर्ण परिमाणीकरण नहीं। यह अलग-अलग लेन में नमूना लोडिंग और ट्रांसफर की दरों में विसंगतियों के लिए मान्यता प्राप्त है, जो व्यक्तिगत धब्बों पर अलग-अलग हैं। उत्पन्न पता लगाया गया संकेत भी रैखिक नहीं है और नमूने27 की एकाग्रता सीमा को प्रतिबिंबित नहीं करता है। इसके अलावा, फॉस्फोराइलेशन की स्थिति प्रोटीन गतिविधि की रिपोर्ट करने के लिए एक विश्वसनीय कारक नहीं हो सकती है क्योंकि इसके पर्यावरण के साथ अवरोधक, उत्परिवर्तन और प्रोटीन इंटरैक्शन जैसे हस्तक्षेप सीधे इसके फॉस्फोराइलेशन स्तर 28,29,30 को बदले बिना प्रोटीन गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, अन्य जैव रासायनिक तरीकों के पूरक के लिए फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करना अधिक फायदेमंद हो सकता है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, केसीसी 2 गतिविधि को सीधे मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य क्लासिक तरीके हैं। समरूप सेल तैयारी की झिल्ली के माध्यम से रेडियोधर्मी 86आरबी + फ्लक्स को मापने के माध्यम से केसीसी 2 का आकलन एक लोकप्रिय दृष्टिकोण है। यह विधि आयनिक चैनलों के माध्यम से उन्हें पारित करके ट्रेसर के रूप में सक्रिय रेडियोआइसोटोप का उपयोग करती है। संक्षेप में, रुचि की कोशिकाओं को अंतर्जात केसीसी 2 को रोकने के लिए केशन मुक्त समाधानों में इनक्यूबेट किया जाता है, इसके बाद विशिष्ट अवरोधकों जैसे कि ओआबेन के साथ इनक्यूबेशन किया जाता है, और फिर अवरोधक और 86आरबी + युक्त अपटेक माध्यम के साथ। सेल लाइसिस की अगली कड़ी की गतिविधियों को मापने / ट्रेस करने के लिए तरल सिंटिलेशन काउंटरों का उपयोग किया जाता है। हालांकि, यह विधि मजबूत, अत्यधिक संवेदनशील और चयनात्मक है और गड़बड़ी के लिए कम प्रवण है। हालांकि, इसके अनुप्रयोग मस्तिष्क या न्यूरॉन संस्कृतियों जैसे कई सेल प्रकारों वाले ऊतकों तक विस्तारित नहीं होते हैं। इसके अलावा, यह तकनीक उपकोशिकीय स्तर पर आयन एकाग्रता के संकल्प में परिवर्तन को प्रतिबंधित करती है। इसके अलावा, उच्च ऊर्जा उत्सर्जन (अधिकतम 1.77 MeV; अधिकतम 1.08 MeV) 31 की विशेषता वाले लघु आधे जीवन (18.65 दिन) रेडियोआइसोटोप के साथ काम करने की संभावित विषाक्तता और स्वास्थ्य खतरे के बारे में सुरक्षा मुद्दे हैं। यह बड़े पैमाने पर न्यूरोनल कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक अनुपयुक्तता का सुझाव दे सकता है जहां आमतौर पर उच्च संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इन मुद्दों से आयन फ्लक्स के निर्धारण के लिए रेडियोधर्मी 86आरबी + के विकल्प के रूप में टेरस्टापेन 1999 द्वारा गैर-रेडियोधर्मी 85आरबी + एफ्लक्स परख का विकास होता है। गैर-रेडियोधर्मी दृष्टिकोण ने दवा उद्योग में के + और गैर-चयनात्मक केशन चैनलों के विश्लेषण के लिए रेडियोधर्मी 86आरबी + परखों को बहुत निर्वासित कर दिया है। गैर-रेडियोधर्मी 85आरबी + एफ्लक्स परख में दो प्रमुख प्रक्रियाएं शामिल हैं, पहली सेल संस्कृति और हेरफेर है और दूसरा परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (एएएस) द्वारा ट्रेसर रूबिडियम का निर्धारण है। इस विधि का उपयोग करना आसान है, हालांकि, इसके लिए कई परख सत्यापन प्रयोगों की आवश्यकता होती है और खराब अस्थायी संकल्प32 से पीड़ित होता है। फिर भी, गैर-रेडियोधर्मी 85आरबी + एफ्लक्स परख उत्तरोत्तर केसीसी और एनकेसीसी33 के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय तकनीक साबित हुई है।

थैलियम (टीआई +) फ्लक्स परख केसीसी 2 और एनकेसीसी 2 पर के + साइट के लिए अपने उच्च बाध्यकारी संबंध के कारण के + के लिए एक सरोगेट आयन के रूप में टीआई + का उपयोग करता है। कोशिकाओं में टीआई + प्रवाह का पता थैलियम-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई जैसे बेंजोथियाज़ोल कौमारिन और फ्लुओज़िन -2 का उपयोग करके लगाया जा सकता है। एक बार चैनल द्वारा ले जाने के बाद, टीआई + बीटीसी / फ्लूज़िन -2 डाई के साथ जुड़ सकता है जिससे एक फ्लोरोसेंट परिवर्तन होता है जिसे फ्लोरोमेट्रिक इमेजिंग प्लेट रीडर31 द्वारा पता लगाया जा सकता है। टीआई + संकेतक रंजक कोशिकाओं को एसिटॉक्सीमिथाइल एस्टर के रूप में प्रवेश करते हैं जो तब सक्रिय फ्लोरोजेनिक रूपों को जारी करने के लिए साइटोप्लाज्मिक एस्टरेज़ द्वारा क्लीवर किए जाते हैं। केसीसी को सक्रिय करने के लिए, कोशिकाओं को परीक्षण यौगिकों (जैसे, केसीसी 2 अवरोधक) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में के + और टीएल + के मिश्रण के साथ उत्तेजित किया जाता है। थैलियम फ्लोरेसेंस डाई में प्रवेश करता है और बांधता है। फ्लोरोसेंट सिग्नल में वृद्धि विशेष रूप से कोट्रांसपोर्टर के माध्यम से सेल में टीएल + की आमद के समानुपाती है, और इसलिए कोट्रांसपोर्टर गतिविधि के कार्यात्मक माप का प्रतिनिधित्व करती है। इस विधि को विभिन्न प्रकार की सेल संस्कृतियों में केसीसी 2 और एनकेसीसी 2 गतिविधि को मापने में भी अच्छी तरह से लागू किया गया है, उदाहरण के लिए, एचईके 293 सेल लाइन पर अध्ययन मानव केसीसी 234 को स्थिर रूप से व्यक्त करता है। एक डिमेरिट छोर पर, विभिन्न प्रकार की संभावित ऑफ-टारगेट पाथवे लाइनें हैं जो टीआई + प्रवाह में हस्तक्षेप कर सकती हैं, उदाहरण के लिए, एचईके 293 कोशिकाओं में Na +/K + ATPase उच्च झूठी सकारात्मक या झूठी नकारात्मक हिट दर35 का कारण बन सकता है। इसके अलावा, अन्य फ्लक्स परखों के साथ, न्यूरोनल कोशिकाओं में इस तरह के दृष्टिकोण का कार्यान्वयन कई धोने के चरणों के बाद न्यूरोनल कोशिकाओं के खराब अस्तित्व के कारण सीमित रहता है। कई के + चैनलों और ट्रांसपोर्टर की न्यूरोनल अभिव्यक्ति भी केसीसी 2 विशिष्ट के + फ्लक्स के सटीक मूल्यांकन में बाधा डाल सकती है। यह तकनीक छोटे न्यूरोनल डिब्बे जैसे डेंड्राइट और डेंड्राइटिक स्पाइन में चैनलों के अध्ययन के लिए सीमाएं प्रस्तुत करती है, और अक्षतंतु कम अस्थायी संकल्प के साथ युग्मित स्थानिक संकल्प की कमी के कारण होते हैं।

जीएबीए गतिविधि को मापने के लिए पैच-क्लैंप-इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी जैसी आगे की तकनीकों का उपयोग किया जाता है; इसलिए, इंट्रासेल्युलर क्लोराइड आयन होमियोस्टेसिस के आकलन द्वारा सूचित के रूप में अप्रत्यक्ष रूप से सक्रिय और / या निष्क्रिय केसीसी 2 को दर्शाता है। आम तौर पर, एसएलसी 12 फ़ंक्शन के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप इस सिद्धांत पर निर्भर करते हैं कि जीएबीएए रिसेप्टर्स (जीएबीएएआर) क्लोराइड36 के लिए पारगम्य हैं। केसीसी 2 जीबीएर्जिक निषेध के मॉड्यूलेशन में महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, केसीसी 2 की [सीएल-] आई एक्सट्रूज़न गतिविधि जीएबीएएआर 6 के हाइपरपोलराइजेशन को रेखांकित करतीहै। इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग जीएबीएएआर-मध्यस्थता धाराओं (ईजीएबीए) की क्षमता में उलटफेर से केसीसी 2 की क्लोराइड एक्सट्रूडिंग क्षमता के बहिर्वेशन के माध्यम से महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। एक हाइपरपोलराइज्ड ईजीएबीए कम [सीएल-] आई को इंगित करता है और इस प्रकार केसीसी 2 की गतिविधि में वृद्धि होती है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में ग्रामिसिडिन पैच-क्लैंप तकनीक जीएबीए गतिविधि को मापने के लिए एक स्वर्ण मानक दृष्टिकोण है। पहले प्रकाशित कुछ अध्ययनों ने केसीसी 2 के कार्यों और गतिविधियों की जांच के लिए ग्रामिसिडिन पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग किया है ताकि [सीएल-] आई होमियोस्टेसिस का आकलन / निगरानी की जा सके, जो वास्तव में सफल साबित हुआ है 8,9,37,38,39,40 . ग्रामिसिडिन पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के दौरान, सेल / ऊतक के आसपास के स्नान में एक अन्य इलेक्ट्रोड के संदर्भ में आयन चैनलों की इंट्रासेल्युलर गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए सापेक्ष पैच के साथ ग्लास इलेक्ट्रोड का उपयोग करके सेल / ऊतक की सतह पर एक तंग सील बनाई जाती है। यह तकनीक वोल्टेज-क्लैंप मोड में एक निश्चित वोल्टेज पर कोशिका की झिल्ली को पार करने वाले प्रवाह की मात्रा को मापकर या वर्तमान क्लैंप मोड36 में एक निश्चित धारा पर झिल्ली में चलने वाले वोल्टेज की मात्रा को रिकॉर्ड करके की जा सकती है। बुनियादी तकनीक के कई रूपों को लागू किया जा सकता है जो काफी हद तक शोध प्रश्न पर निर्भर करता है। तकनीक अपेक्षाकृत बड़े छिद्र जैसी पूरे सेल पैच रिकॉर्डिंग नहीं बनाती है, लेकिन इलेक्ट्रोड समाधान में निहित छिद्र बनाने वाले एंटीबायोटिक (ग्रामिसिडिन) का उपयोग झिल्ली36 में छोटे छिद्र बनाने के लिए किया जाता है। विशेष रूप से, ग्रामिसिडिन के अलावा झिल्ली में केशन-चयनात्मक छिद्र बनते हैं, जो महत्वहीन आयन पारगम्यता प्रदर्शित करते हैं। वोल्टेज रैंप प्रोटोकॉल एक स्थिर वोल्टेज पर वर्तमान को रिकॉर्ड करने के लिए एक प्रभावी और विश्वसनीय विकल्प है। वोल्टेज रैंप प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त वर्तमान / वोल्टेज संबंध जीएबीएएआर-मध्यस्थता झिल्ली धाराओं की बेहतर रिकॉर्डिंग देते हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक लगातार बदलते लेकिन निगरानी वोल्टेज (स्थिर दर पर) लागू किया जाता है और वर्तमान को लगातारएक साथ 36,41 मापा जाता है। इस प्रोटोकॉल के दौरान, ओमिक प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप रिसाव प्रवाह को सक्रिय करने के लिए वोल्टेज दालों (आमतौर पर हाइपरपोलराइज़िंग दिशा में) के आवेदन का उपयोग किया जाता है। आमतौर पर, जीएबीएएआर-मध्यस्थता झिल्ली धाराओं की गणना रिसाव धारा (यानी, रिसाव-घटाए गए एगोनिस्ट धाराओं की रिवर्सल क्षमता) 36 से की जाती है। इस प्रोटोकॉल से प्राप्त वर्तमान-वोल्टेज संघ इस बात की बेहतर समझ प्रदान करने में मदद करते हैं कि जीएबीएए रिसेप्टर चैनलों से जुड़े प्रयोगात्मक परिदृश्य के दौरान आयन सांद्रता में परिवर्तन कहां हो रहे हैं। येल्हेकर एट अल .41 ने यह दिखाने के लिए एक कम्प्यूटेशनल मॉडल का उपयोग किया कि प्रक्षेप विधि से स्थिर आयन सांद्रता पर निष्कर्ष उचित नहीं हो सकता है क्योंकि विधि से अनुमानित रिवर्सल क्षमता गलत हो सकती है।

अधिकांश रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला औसत प्रतिरोध 5 MH है। 3-4 एम के कम प्रतिरोध वाले पिपेट के परिणामस्वरूप कम श्रृंखला प्रतिरोध हो सकता है जो वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए बेहतर है। हालांकि, पिपेट की नोक उच्च प्रतिरोध पिपेट के लिए तुलनात्मक रूप से व्यापक होगी और परिणामस्वरूप, यह सील गठन और स्थिरता36,42 में कठिनाई के रूप में एक चुनौती पैदा करती है। इसलिए, उत्पन्न शोर डेटा के स्तर में काफी कमी के साथ रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए जीई गठन की निगरानी करना आवश्यक है। जीएबीए गतिविधि के माप में इसकी उपयुक्तता और विश्वसनीयता द्वारा निर्धारित केसीसी 2 के कार्य और गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक की मजबूती की पुष्टि कई अध्ययनों द्वारा की गई है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि [सीएल-] आई अपने संबंधित एगोनिस्ट के लिए जीएबीएएआरएस (जो क्लोराइड चालकता को गेट करने में सक्षम हैं) की प्रतिक्रियाओं को मापकर इस तकनीक का उपयोग करके स्थिर रहता है। निहितार्थ से, निरंतर विद्युत पहुंच इंट्रासेल्युलर क्लोराइड एकाग्रता43,44 के बहुत कम या बिना संशोधन के साथ आती है। इसके अलावा, यह तकनीकजीएबीए एआर सक्रियण (जो क्लोराइड और बाइकार्बोनेट चालकता को खोलता है) के दौरान झिल्ली क्षमता और ई जीएबीए में कृत्रिम परिवर्तनों के उल्लंघन की सुविधा प्रदान करती है। उपरोक्त इस तकनीक को अन्य प्रकार के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग से आगे एक बढ़त प्रदान करता है। हालांकि, इस तकनीक की सीमाओं में निम्नलिखित शामिल हैं: (1) झिल्ली के हिस्से पर कब्जा करने वाले इलेक्ट्रोड की नोक के कारण लगातार रिकॉर्डिंग शोर हो सकता है जो वर्तमान रिज़ॉल्यूशन को कम कर सकता है, और (2) ग्रामिसिडिन के साथ झिल्ली के छिद्र में आमतौर पर अपेक्षाकृत अधिक समय लगता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को द रॉयल सोसाइटी यूके (अनुदान संख्या आईईसी \ एनएसएफसी 201094), और एक राष्ट्रमंडल पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions

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References

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जैव रसायन अंक 190
वेस्टर्न ब्लोटिंग का उपयोग करके न्यूरोनल के-सीएल सह-ट्रांसपोर्टर केसीसी 2 के कार्यों और गतिविधियों का अध्ययन
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Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F.,… More

Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).

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