Summary
O presente protocolo destaca a aplicação da técnica de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K-Cl KCC2. O protocolo descreve a investigação da fosforilação de KCC2 em sítios reguladores de quinase Thr906/1007 via western blotting. Além disso, métodos adicionais para confirmar a atividade do KCC2 são brevemente destacados neste texto.
Abstract
Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são um membro da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de catião (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da Cl-homeostase e, consequentemente, da inibição funcional do GABAérgico. A falha na regulação adequada da KCC2 é deletéria e tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo epilepsia. Houve avanços consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). Aqui, o protocolo destaca como investigar a fosforilação de KCC2 em locais reguladores de quinase - Thr906 e Thr1007 - usando a técnica de western blotting. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto. Algumas dessas técnicas adicionais serão brevemente discutidas neste manuscrito.
Introduction
Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são membros da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de cátions (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da Cl-homeostase e, consequentemente, para a inibição funcional do GABAérgico 1,2,3,4. A manutenção da baixa concentração intraneuronal de Cl- ([Cl-]i) a 4-6 mM pelo KCC2 facilita a hiperpolarização do ácido γ-aminobutírico (GABA)/glicina e a inibição sináptica no cérebro e na medula espinhal5. A falha na regulação adequada da KCC2 tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo a epilepsia4. Além disso, a diminuição da extrusão de Cl− mediada por KCC2 e as correntes hiperpolarizantes hiperpolarizantes GABAA e/ou mediadas pelo receptor de glicina têm sido implicadas na epilepsia, dor neuropática e espasticidade 6,7. O KCC2 neuronal é modulado negativamente via fosforilação de resíduos reguladores chave dentro de seu domínio intracelular C-terminal pelo complexode sinalização 1 da quinase com não-lisina (WNK)-STE20/SPS1-related proline/alanine-rich (SPAK)/Oxidative stress-responsive (OSR), o que facilita a manutenção da atividade despolarizada do GABA em neurônios imaturos 2,8,9 . O WNK-SPAK/OSR1 fosforila os resíduos de treonina 906 e 1007 (Thr906/Thr1007) e, posteriormente, regula negativamente a expressão gênica de RNAm do KCC2, levando a uma consequente deterioração de sua função fisiológica 8,10. Mais importante, no entanto, já é um fato que o complexo quinase WNK-SPAK/OSR1 é conhecido por fosforilar e inibir a expressão de KCC2 1,2,4,11,12, e que a inibição das vias de sinalização do complexo quinase para o fosforilato Thr906/Thr1007 tem sido associada ao aumento da expressão do gene mRNA KCC2 13,14,15 . É importante ressaltar que a regulação da expressão neuronal de KCC2 e Na+-K+-2Cl-cotransportadores 1 (NKCC1) via fosforilação proteica funciona concomitantemente e em padrões inversos 1,4,16.
Houve avanços consistentes e consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). O protocolo aqui apresentado destaca a aplicação de técnicas de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K+-Cl- KCC2, investigando a fosforilação do cotransportador em sítios reguladores de quinase Thr906/1007.
Western blot é um método usado para detectar proteínas específicas de interesse de uma amostra de tecido ou célula. Este método primeiro separa as proteínas por tamanho através de eletroforese. As proteínas são então transferidas eletroforeticamente para um suporte sólido (geralmente uma membrana) antes que a proteína-alvo seja marcada usando um anticorpo específico. Os anticorpos são conjugados a diferentes tags ou anticorpos conjugados com fluoróforos que são detectados usando métodos colorimétricos, quimioluminescência ou fluorescência. Isso permite que uma proteína-alvo específica seja detectada a partir de uma mistura de proteínas. Essa técnica tem sido utilizada para caracterizar sítios fosfoespecíficos de KCCs1 e tem sido utilizada para identificar inibidores de quinase que inibem a fosforilação de KCC3 Thr991/Thr104817. Seguindo este protocolo, pode-se detectar especificamente KCC2 total e fosforilado a partir de lisatos celulares / teciduais. Em princípio, a detecção de anticorpos conjugados com proteínas por esta técnica é altamente instrumental, pois ajuda a melhorar a compreensão das atividades cooperativas nos fosfo-locais do KCC2, o que lança luz sobre os mecanismos moleculares envolvidos em suas regulações fisiológicas. A análise quantitativa da expressão proteica total é representativa da função e atividade do KCC2. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto.
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Protocol
NOTA: O protocolo descreve o método de western blotting para detectar proteínas específicas de interesse.
1. Cultura celular e transfecção
- Aquecer todos os reagentes no banho de grânulos (37 °C) antes do procedimento de cultura celular. Preparar o meio de cultura, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% cada de 2mM de L-glutamina, 100x aminoácido não essencial, piruvato de sódio 100 mM e 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina.
- Descongelar as células 293 do rim embrionário humano do rato KCC2b transfectado de forma estável (HEK293 rnKCC2b)18 completamente no banho de grânulos (37 °C). Transfira as células do tubo criovial para um tubo de centrífuga contendo 5 mL de meio fresco. Gire a célula a 1200 ×g por 3-5 min.
- Use uma pipeta aspiradora (fixada a uma bomba de vácuo) para aspirar o sobrenadante e adicione 10 mL de meio fresco para ressuspender as células. Transfira a suspensão da célula para uma placa de prato de 10 cm.
- Coloque o prato na incubadora e deixe-o crescer por 48 h a 37 ° С em uma atmosfera umidificada a 5% de CO2 . Monitore o período de incubação para garantir o crescimento celular saudável. Dividimos ainda mais as células quando elas atingiram mais de 90% de confluência após o período de incubação.
- Aspirar o meio antigo para fora do prato de células e enxaguar suavemente as células com 2 mL de solução salina tampão fosfato (PBS). Adicione 2 mL de tripsina e incube por cerca de 1-2 min à temperatura ambiente.
- Use 2 mL de meio completo para lavar suavemente as células tripsinizadas no prato. Adicione 9 mL de mídia fresca a novos pratos e adicione 1 mL de solução do prato antigo a cada um dos novos. Transfira os pratos de células divididas de volta para a incubadora por 48 h para atingir ≥ de 90% de confluência.
- Trate as células com dimetilsulfóxido (DMSO) como controle, estaurosporina 8 μM ou N-etilmaleimida (NEM) 0,5 mM por 15 minutos antes de colher as células em tampão de lise.
2. Preparação de lisados celulares e carregamento de amostras
- Aspirar a mídia no prato de cultura (a partir de procedimentos de transfecção). Coloque a cultura celular no gelo e lave as células com PBS gelado.
- Aspirar o PBS e, em seguida, adicionar 1,0 ml de tampão de lise gelado contendo 50 mM de ácido tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de etilenoglicol-bis(éter β-aminoetílico)-N,N,N,N′,N′-tetraacético (EGTA), 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 50 mM de fluoreto de sódio, 5 mM de pirofosfato de sódio, 10 mM de sódio-β-glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sódio, 1% (p/v) de Tritão X-100, 0,27 M de sacarose, 1 mM de benzamina, 0,1% (v/v) de 2-mercaptoetanol e 2 mM de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) para o prato.
NOTA: O volume de tampão de lise durante a colheita celular varia com o tamanho do prato, por exemplo, 1 mL de tampão de lise é adequado por 1 x 107 células/prato de 100 mm/frasco de 150 cm 2, enquanto 0,5 mL é adequado por frasco de 5 x 106 células/60 mm/balão de 75 cm2. - Use um raspador de células de plástico frio para raspar as células do fundo do prato e, em seguida, use suavemente uma pipeta para transferir a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga já no gelo. Agite constantemente o tubo durante 30 minutos a 4 °C.
- Gire a célula lisada em uma centrífuga fria (4 °C) a 16.000 x g por 20 min, remova o tubo suavemente da centrífuga e coloque-o no gelo. Recolha o sobrenadante num tubo fresco pré-arrefecido e descarte o pellet.
NOTA: Pode ser necessário variar a força de centrifugação e o tempo, dependendo do tipo de célula. No entanto, as diretrizes gerais incentivam a centrifugação a 16.000 x g por 20 min. No entanto, isso deve ser determinado para cada experimento. Por exemplo, células delicadas como leucócitos precisam de uma velocidade de centrifugação muito leve.
3. Preparação de imunoprecipitantes a partir de lisados celulares
- Pipetar 300 μL de proteína-G-sefarose para um tubo de microcentrífuga. Gire a solução a 500 x g durante 2 min e elimine o sobrenadante.
- Adicione 500 μL de PBS e vortex a solução bem. Gire a solução a 500 x g durante 2 min e elimine o sobrenadante. Repita esta etapa.
- Misture 1 mg de anticorpos anti-KCC2 Thr906 e anti-KCC2 Thr1007 com 200 μL de esferas de proteína G-sefarose e compense o volume até 500 μL com PBS. Agitar sobre uma plataforma vibratória ou roda rotativa durante 2 h a 4 °C. Lave 2x com PBS.
- Realizar a quantificação de proteínas em todos os lisados celulares e adicionar 1 mg do lisado celular às contas lavadas. Incubar suavemente num rotador de ponta a ponta durante 2 h a 4 °C. Gire as contas e lave-as 3x com PBS contendo cloreto de sódio (NaCl) a 150 mM.
- Lavar os imunoprecipitantes (miçangas) 3x com 200 μL de PBS. Ressuscite o pellet final em 100 μL de 1x tampão de amostra de dodecil sulfato de lítio (LDS).
- Agitar os tubos num agitador de rotor à temperatura ambiente durante 5 minutos e incubá-los num bloco de aquecimento a 75 °C durante 10 minutos. Centrifugar a amostra de carga a 11.000 x g durante 2 min e utilizar o sobrenadante para o carregamento do gel.
4. Realizando o western blot
- Montar o aparelho de fundição e deitar o gel de separação a 8% preparado na hora (ver Tabela 1 para a receita/preparação) para fundir o gel que permita cerca de 2 cm de espaço a partir da parte superior do vidro de fundição. Adicione 200 μL de isopropanol absoluto à configuração e deixe-a repousar à temperatura ambiente durante 60 minutos.
NOTA: A receita em gel de poliacrilamida para eletroforese em gel de dodecilamida sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) depende do tamanho da proteína de interesse (Tabela 2). Portanto, anote o tamanho da proteína antes de determinar a porcentagem de gel desejada. - Use uma pipeta para remover o isopropanol e lave cuidadosamente o gel com cerca de 200 μL de água destilada. Adicionar gel de empilhamento a 6% preparado na hora (ver Tabela 1 para receita/preparação) para preencher o espaço de aproximadamente 2 cm na configuração de fundição. Encaixe suavemente no pente do poço e deixe repousar à temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Fixe o gel fundido no tanque de eletroforese.
- Dissolva 30,3 g de base Tris, 144,1 g de glicina e 10 g de SDS em 1000 mL de água destilada para preparar 10x tampão de transferência. Prepare 1x tampão de corrida adicionando 10 mL de SDS de 10% e 100 mL de tampão de transferência de 10x a 890 mL de água destilada.
- Despeje 1x buffer de corrida no tanque. Carregar 5 μL de marcador de peso molecular no primeiro poço e uma quantidade igual de proteína em cada poço do gel SDS-PAGE (entre 18-30 μL, dependendo do tamanho do pente utilizado). Encha os poços vazios com 1x LDS e execute o gel por cerca de 90-120 min a 120 V.
- Dissolver 58,2 g de base Tris e 29,3 g de glicina em 1000 mL de água destilada para preparar 10x tampão de transferência. Ative a membrana de nitrocelulose com 1x tampão de transferência contendo 20% de metanol. Lave o gel e a membrana com o tampão de transferência e espalhe-os suavemente na pilha de preparação.
NOTA: Não há necessidade de ajustar o pH dos tampões de corrida e transferência, pois eles devem estar no pH ideal necessário. Além disso, é aconselhável preparar esses buffers e armazená-los à temperatura ambiente antes do experimento para economizar tempo. - Organize o sanduíche a ser transferido nesta ordem: eletrodo negativo (moldura preta / extremidade) - espuma de sanduíche - papel de filtro - gel SDS-PAGE enxaguado - membrana de nitrocelulose enxaguada - papel de filtro - espuma de sanduíche - eletrodo positivo (quadro vermelho). Empilhe o sanduíche montado no tanque de transferência e corra a 90 V por 90 min ou 30 V por 360 min.
5. Coloração de anticorpos e desenvolvimento de imagem
- Retire a membrana e deixe secar. Bloqueie a membrana por 1 h à temperatura ambiente usando um tampão de bloqueio feito de 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
- Incubar as membranas com diluições adequadas do anticorpo primário 8,15,19 e da beta-actina (controlo de carga) em tampão de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Lave a membrana em três lavagens de 1x TBS-T por 5 min cada.
NOTA: A incubação da membrana separada com controles de carga, como beta-actina, alfa-tubulina ou anticorpos gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase é para normalizar os outros resultados de western blotting durante a quantificação subsequente. A diluição recomendada para cada anticorpo primário está disponível no manual do fabricante. - Incubar a membrana lavada com anticorpo secundário diluído 5000 vezes em tampão de bloqueio durante 60 min à temperatura ambiente. Novamente, lave a membrana 3x em 1x TBS-T por 5 min cada.
NOTA: É altamente recomendável que o anticorpo secundário seja levantado contra a espécie em que o anticorpo primário é levantado. Por exemplo, se o anticorpo primário do KCC2 total for anti-KCC2 do rato, então o anticorpo secundário para o anti-rato deve ser utilizado. - Coloque a membrana lavada na placa de imagem. Misture volumes iguais de cada reagente de quimioluminescência (ECL) aprimorado e espalhe suavemente a solução mista na membrana para desenvolver sinais.
6. Aquisição de imagens utilizando um sistema de imagem e quantificação de dados
- Transfira a placa de imagem para o compartimento apropriado no sistema de imagem para geração de imagens. Abra o software de imagem no computador para processamento de imagem.
- Na barra de ferramentas, clique em Novo Protocolo e escolha Canal Único. Clique em Selecionar na caixa de diálogo de imagem/aplicativo em gel, role até Blot e selecione Chemi Hi Sensitivity ou Chemi Hi Resolution. Em seguida, clique em Configuração de acumulação de sinal para definir a duração e o número de imagens a serem adquiridas.
- Clique em Position Gel na configuração do protocolo e ajuste o gel no sistema de imagem, se necessário. Clique em Executar protocolo para adquirir as imagens.
- Clique com o botão direito do mouse em uma das imagens adquiridas sob a caixa do catálogo de imagens para salvar as imagens no computador. Navegue até a imagem desejada e clique em Selecionar imagem e continuar na caixa de diálogo Executar.
- Clique no ícone Transformação de imagem para ajustar o contraste e a saturação de pixels da imagem. Clique no ícone Captura de tela na barra de ferramentas geral para salvar a imagem no computador, dependendo do formato de imagem desejado.
- Meça as densidades de banda usando o software ImageJ e analise usando ferramentas estatísticas apropriadas.
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Representative Results
Aqui, o resultado representativo apresentado na Figura 1 investigou o impacto da estaurosporina e do NEM na fosforilação mediada por WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 e NKCC1 em linhagens celulares de HEK293 expressando de forma estável KCC2b (HEKrnKCC2b)18 utilizando a técnica de western blotting. Detalhes abrangentes sobre os resultados representativos são discutidos em Zhang et al.15. Semelhante ao NEM, a estaurosporina é um inibidor amplo da quinase que pode aumentar a atividade de transporte da KCC2 e inibir a atividade da NKCC115,20. O tratamento de células HEK293 com estaurosporina e NEM causou diminuição da fosforilação nos locais-alvo do SPAK - Thr233 situados no domínio da quinase T-loop e no sítio de fosforilação S-loop Ser373 do hsSPAK. Assim, ambos os compostos abreviaram os níveis de fosforilação dos fosfo-sítios SPAK acima mencionados. Além disso, a estaurosporina reduziu a fosforilação de Ser940 em HEKrnKCC2b, mas NEM aumentou significativamente sua fosforilação. Além disso, a estaurosporina diminui a fosforilação no local Thr505, enquanto o NEM causou um ligeiro, mas insignificante aumento na fosforilação no mesmo local. Os efeitos diferenciais de ambos os compostos na fosforilação da proteína quinase C (PKC) no sítio Thr505 e KCC2b no sítio Ser940 correlacionam-se bem. O resultado representativo também mostrou que ambos os agentes alteraram a expressão do rnKCC2b total, hsNKCC1 ou hsSPAK. O NEM (mas não o tratamento com estaurosporina) causou um aumento significativo na expressão da quantidade total de KCC2, enquanto a expressão de NKCC1 total e SPAK não foram significativamente alteradas quando tratadas com ambos os compostos. Além disso, os dois compostos causaram uma diminuição da fosforilação do SPAK nos sítios Thr233 e Ser373, e isso se correlacionou com a fosforilação abreviada dos sítios Thr906/Thr1007 e Thr203/207/212 nos sítios rnKCC2b e hsNKCC1, respectivamente. Além disso, estaurosporina e NEM reduziram e aumentaram a fosforilação da PKC no sítio Ser940 em rnKCC2b, respectivamente, o que se correlacionou com a redução e incremento na fosforilação de PKC-δ no sítio Thr505 no tratamento com estaurosporina e NEM, respectivamente (Figura 1).
Figura 1: Análises quantitativas dos fosfosítios rn KCC2b e hsNKCC1 no tratamento com estaurosporina e NEM em células HEK rn KCC2b. (A) Células HEKrnKCC2b transfectadas de forma estável foram tratadas com DMSO (controle), estaurosporina 8 μM ou NEM 0,5 mM por 15 min. Os lisados celulares foram colhidos e submetidos à imunoprecipitação (IP) e immunoblot (IB) com anticorpos indicados. Abreviaturas: D = dimérico KCC2; M = KCC2 monomérico. (B) Quantificação de imunoblot de células HEKrnKCC2b transfectadas de forma estável. As intensidades de banda foram quantificadas com o software ImageJ. p < 0,001; **p < 0,01; Teste de Wilcoxon-Mann Whitney (n = 6). Esse número foi modificado a partir de Zhang et al.15. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 8 mL de Gel Separador a 8% | 5 mL de Gel de Empilhamento a 6% | ||
| Materiais necessários | Volume (μL) | Materiais necessários | Volume (μL) |
| Destilado H2O | 4200 | Destilado H2O | 2900 |
| 40% Acrilamida | 1600 | 40% Acrilamida | 750 |
| 1,5 M Tris pH 8,8 | 2000 | 0,5 M Tris pH 6,8 | 1250 |
| 10% SDS | 80 | 10% SDS | 50 |
| 10% APS | 80 | 10% APS | 50 |
| TEMED | 8 | TEMED | 5 |
| Fazendo o gel de separação: | |
| 1) | Comece com 4,2 mL de ddH2O |
| 2) | Adicionar 1,6 ml de solução de acrilamida/bis-acrilamida a 40% |
| 3) | Adicionar 2 mL de 1,5 M Tris pH 8,8 e misturar |
| 4) | Misture em 80 μL de 10% SDS |
| 5) | Quando estiver pronto a utilizar, adicionar 8 μL de TEMED e misturar |
| 6) | Adicionar 80 μL de 10% de APS* e misturar |
| Fazendo o gel de empilhamento: | |
| 1) | Comece com 2,9 mL de ddH2O |
| 2) | Adicionar 0,75 ml de solução de acrilamida/bis-acrilamida a 40% |
| 3) | Adicionar 1,25 mL de 0,5 M Tris pH 6,8 e misturar |
| 4) | Misture em 50 μL de 10% SDS |
| 5) | Quando estiver pronto a utilizar, adicionar 5 μL de TEMED e misturar |
| 6) | Adicionar 50 μL de 10% de APS* e misturar |
| SDS = Dodecil Sulfato de Sódio | |
| APS = Amônio por sulfato | |
| TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-tetrametiletilenodiamina | |
| *Após a adição de APS, a solução deve ser imediatamente despejada no aparelho de fundição, pois a solução polimeriza em poucos minutos. Por isso, é aconselhável preparar as soluções de gel de separação e empilhamento apenas quando as soluções são necessárias. | |
Tabela 1: Receita para fazer mistura de gel de poliacrilamida (soluções de gel de separação e empilhamento).
| Porcentagem de Gel (%) | Tamanho da proteína (kDa) |
| Até 20 | 4 a 40 anos |
| 15 | 12 a 45 anos |
| 12.5 | 10 a 70 anos |
| 10 | 15 a 100 |
| 8 | 50 a 200 |
| 4 a 6 anos | > 200 |
Tabela 2: Porcentagem recomendada de gel SDS-PAGE para diferentes tamanhos de proteínas
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Discussion
Muitos métodos têm sido utilizados para medir as atividades do SLC12 de CCCs que são expressos nos neurônios, incluindo o KCC2. Muitas dessas técnicas provaram aprimorar o conhecimento científico sobre a análise da relevância funcional desses transportadores e seus padrões de estrutura-função em diferentes mutações relacionadas à doença. Criticamente, há vantagens e ressalvas para os vários métodos21. No entanto, o protocolo explicado acima, delineou como avaliar a fosforilação do KCC2 em locais reguladores de quinase, Thr906 e Thr1007, usando western blot, o que pode ser útil no estudo das funções e atividades do KCC2.
A regulação do KCC2 ocorre através da fosforilação e desfosforilação em resíduos chave de serina/treonina1. Western blotting é uma técnica eficiente que pode ser usada para investigar a fosforilação de KCC2 em locais reguladores de quinase em Thr906 e Thr1007. Em princípio, alterações na fosforilação de KCC2 são detectadas usando anticorpos fosfo-específicos dirigidos contra fosfopeptídeos das amostras/proteínas de imunoblot de interesse. Western blot é um método usado para detectar a proteína específica de interesse de uma amostra de tecido ou célula. Este método primeiro separa as proteínas por tamanho através de eletroforese. As proteínas são então transferidas eletroforeticamente para um suporte sólido (geralmente uma membrana) antes que a proteína-alvo seja marcada usando um anticorpo específico. Os anticorpos são conjugados a diferentes tags ou anticorpos conjugados com fluoróforos que são detectados usando métodos colorimétricos, quimioluminescência ou fluorescência. Isso permite que uma proteína-alvo específica seja detectada a partir de uma mistura de proteínas. Essa técnica tem sido utilizada para caracterizar sítios fosfoespecíficos de KCC2 2,8 e tem sido utilizada para identificar inibidores de KCC2 que antagonizam a fosforilação KCC2 Thr906/Thr100715. As linhas HEK293 têm sido usadas para vários experimentos devido à sua vantagem em experimentos de biologia molecular. São de rápida reprodução, de fácil manutenção e altamente eficientes para transfecção e produção de proteínas22. No entanto, algumas opiniões sustentam que pode não ser o candidato mais adequado para a realização de experimentos de neurobiologia porque não é uma célula proveniente do cérebro e, portanto, sua especificidade fisiológica pode ser questionável na pesquisa em neurociência. No entanto, trabalhos anteriores mostraram que resultados semelhantes são observados na expressão de KCC2 em células HEK293 e tecidos/células neuronais reais15,23. Assim, a relevância do HEK293 na pesquisa em neurociência pode não ser descartada completamente.
Em estudos que envolvam a análise da expressão proteica pela técnica de western blotting, atenção especial deve ser dada à escolha da composição do tampão de lise, à natureza (tipo e concentração) do detergente a ser utilizado24 e aos inibidores de protease. A composição do tampão deve ser otimizada para se adequar à proteína-alvo, facilitando seus processos de solubilização e extração, e para permitir sua fácil detecção por western blot25. O detergente neutro em baixa concentração é geralmente necessário para proteínas solúveis, enquanto as proteínas de membrana podem exigir condições de detergente mais fortes. No entanto, detergentes fortes podem interromper as interações e complexos podem ser perdidos. Ambos os tipos e concentrações dos detergentes podem afetar a natureza e a atividade da proteína, portanto, há uma necessidade de manter a faixa restrita / tolerada de concentrações para esses detergentes. A adição de inibidor de protease evitará que a proteína-alvo seja degradada por proteínas endógenas, e a temperatura de trabalho recomendada ideal é de 4 °C para diminuir efetivamente as taxas proteolíticas. Às vezes, em uma tentativa de alcançar sinais de imunoblot de alta qualidade para anticorpos que dão sinais de immunoblot pobres, a imunoprecipitação (IP) é realizada como um experimento a montante para western blotting. Essa técnica é vantajosa, pois facilita a interação entre antígenos e seus respectivos anticorpos em sua conformação nativa precedendo sua consequente separação e quantificação26. Assim, a PI pode melhorar a qualidade das saídas dos procedimentos de western blotting. Antes da aplicação da técnica de PI, é importante avaliar a presença e a eficiência da expressão das proteínas parceiras co-imunoprecipitadas no lisado analisando o lisado de células inteiras ou as frações de entrada por western blotting. Além disso, o conhecimento prévio do peso molecular da proteína a ser investigada é necessário antes de preparar as soluções de gel percentual desejadas para eletroforese SDS-PAGE, pois o tamanho da proteína afeta o efeito de peneiramento da matriz de gel.
No entanto, a detecção de anticorpos conjugados com proteínas por esta técnica é altamente instrumental, pois ajuda a melhorar a compreensão das atividades cooperativas nos fosfo-locais do KCC2, que podem fornecer informações sobre a fosforilação do cotransportador e a integridade da via de sinalização que pode regular os cotransportadores, para uma previsão confiável da atividade do cotransportador. No entanto, é importante notar que a técnica de western blot só é capaz de produzir dados semiquantitativos, o que significa que a técnica apenas destaca a avaliação relativa das expressões proteicas, mas não a quantificação absoluta. Isso é creditado a discrepâncias nas taxas de carregamento e transferência de amostras em faixas separadas, que são diferentes em manchas individuais. O sinal detectado gerado também não é linear e não reflete a faixa de concentração das amostras27. Além disso, o estado de fosforilação pode não ser um fator confiável para relatar a atividade proteica, pois intervenções como inibidores, mutações e interações proteicas com seu ambiente podem influenciar diretamente a atividade proteica sem alterar seu nível de fosforilação28,29,30. Assim, pode ser mais benéfico usar anticorpos fosfo-específicos para complementar outros métodos bioquímicos.
Como mencionado anteriormente, existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2. A avaliação do KCC2 através da medição do fluxo radioativo de 86Rb+ através da membrana de preparações celulares homogêneas é uma abordagem popular. Este método usa radioisótopos ativos como traçadores, passando-os através de canais iônicos. Resumidamente, as células de interesse são incubadas em soluções livres de cátions para inibir o KCC2 endógeno, seguido de incubação com inibidores específicos, como a ouabaína, e depois com meio de captação contendo o inibidor e 86Rb+. Contadores de cintilação líquida são usados para medir/rastrear atividades sequelas da lise celular. No entanto, este método é robusto, altamente sensível e seletivo e é menos propenso a distúrbios. No entanto, suas aplicações não se estendem a tecidos com vários tipos de células, como culturas cerebrais ou de neurônios. Além disso, esta técnica restringe as mudanças na resolução da concentração de íons no nível subcelular. Além disso, existem questões de segurança quanto à toxicidade potencial e ao risco à saúde de trabalhar com radioisótopos de meia-vida curta (18,65 dias) caracterizados com alta emissão de energia (max 1,77 MeV; max 1,08 MeV)31. Isso poderia sugerir maciçamente uma inadequação para estudos de células neuronais, onde um alto número de células geralmente é necessário. Essas questões levaram ao desenvolvimento do ensaio de efluxo não radioativo de 85Rb+ por Terstappen 1999, como uma alternativa ao 86Rb+ radioativo para determinação de fluxos de íons. A abordagem não radioativa exilou grandemente os ensaios radioativos de 86Rb+ para a análise de canais de cátions K+ e não seletivos na indústria farmacêutica31. O ensaio de efluxo não radioativo de 85Rb+ envolve dois processos principais, o primeiro é a cultura e manipulação celular e o segundo é a determinação do rubídio traçador por espectroscopia de absorção atômica (AAS). Este método é fácil de usar, no entanto, requer uma série de experimentos de validação de ensaio e sofre de baixa resolução temporal32. No entanto, o ensaio de efluxo não radioativo de 85Rb+ tem se mostrado progressivamente uma técnica confiável para a avaliação de KCCs e NKCCs33.
O ensaio de fluxo de tálio (TI+) usa TI+ como um íon substituto para K+ devido à sua alta afinidade de ligação ao site K+ em KCC2 e NKCC2. O influxo de TI+ nas células pode ser detectado usando um corante fluorescente sensível ao tálio, como benzotiazol cumarina e fluozina-2. Uma vez transportado pelo canal, o TI+ pode se associar ao corante BTC/fluozina-2, causando uma alteração fluorescente que pode ser detectada pelo leitor de placas de imagem fluorométrica31. Os corantes indicadores TI+ entram nas células como ésteres acetoximetílicos, que são então clivados por esterases citoplasmáticas para liberar as formas fluorogênicas ativas. Para ativar os KCCs, as células são estimuladas com uma mistura de K+ e Tl+ na presença ou ausência de compostos de teste (por exemplo, inibidores de KCC2). O tálio entra e se liga ao corante de fluorescência. O aumento do sinal fluorescente é proporcional ao influxo de Tl+ na célula especificamente através do cotransportador e, portanto, representa uma medida funcional da atividade do cotransportador. Este método também tem sido bem aplicado na medição da atividade de KCC2 e NKCC2 em vários tipos de culturas celulares, por exemplo, estudos sobre a linhagem celular HEK293 expressando de forma estável KCC2 humana34. Em um fim de demérito, há uma variedade de potenciais linhas de vias fora do alvo que poderiam interferir no influxo de TI+, por exemplo, Na+/K+ ATPase em células HEK293 poderia causar uma maior taxa de acerto falso-positivo ou falso-negativo35. Além disso, como acontece com outros ensaios de fluxo, a implementação de tal abordagem em células neuronais permanece limitada devido à baixa sobrevivência das células neuronais após várias etapas de lavagem. A expressão neuronal de múltiplos canais K+ e transportador também pode impedir a avaliação precisa dos fluxos K+ específicos do KCC2. Esta técnica apresenta limitações para o estudo de canais em pequenos compartimentos neuronais, como dendritos e espinhos dendríticos, e os axônios devidos à falta de resolução espacial aliada à baixa resolução temporal.
Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto. Geralmente, as medições eletrofisiológicas da função SLC12 dependem do princípio de queos receptores GABA A (GABAAR) são permeáveis ao cloreto36. KCC2 é fundamental na modulação da inibição GABAérgica. Particularmente, a atividade de extrusão [Cl-]i do KCC2 está subjacente à hiperpolarização do GABAAR6. Registros intracelulares fornecem insights cruciais através da extrapolação da capacidade de extrusão de cloreto de KCC2 a partir da reversão no potencial de correntes mediadas por R DEGAABA (EGABA). Um EGABA hiperpolarizado indica menor [Cl-]i e, portanto, um aumento na atividade do KCC2. A técnica de grampo de grampo de grampo de grampo em eletrofisiologia é uma abordagem padrão-ouro para medir a atividade do GABA. Alguns estudos publicados anteriormente empregaram o registro de gramicidina patch-clamp para investigar as funções e atividades do KCC2 para avaliar/monitorar a homeostase [Cl-]i de fato se mostraram bem-sucedidas 8,9,37,38,39,40 . Durante uma gravação de gramicidina patch-clamp, uma vedação apertada na superfície da célula / tecido é criada usando um eletrodo de vidro com um remendo relativo para registrar a atividade intracelular dos canais iônicos em referência a outro eletrodo em um banho ao redor da célula / tecido. Esta técnica pode ser realizada medindo a quantidade de corrente que atravessa a membrana de uma célula a uma tensão fixa no modo tensão-clamp ou registrando a quantidade de tensão que se move através da membrana a uma corrente fixa no modo de clamp de corrente36. Várias variações da técnica básica podem ser aplicadas, o que depende em grande parte da questão de pesquisa. A técnica não cria um registro de remendo de células inteiras semelhante a poros relativamente grande, mas o antibiótico formador de poros (gramicidina) contido na solução do eletrodo é usado para formar pequenos poros na membrana36. Particularmente, a adição de gramicidina cria poros seletivos de cátions na membrana, que exibem permeabilidade insignificante ao ânion. Os protocolos de rampa de tensão são uma alternativa eficaz e confiável para registrar a corrente em uma tensão constante. As relações corrente/tensão obtidas com protocolos de rampa de tensão parecem proporcionar um melhor registro das correntes de membrana mediadas por GABAAR. Neste protocolo, uma tensão em constante mudança, mas monitorada (a uma taxa constante) é aplicada e a corrente é constantemente medida simultaneamente36,41. Durante este protocolo, a aplicação de pulsos de tensão (geralmente na direção hiperpolarizadora) é usada para ativar a corrente de vazamento como resultado de respostas ôhmicas. Tipicamente, as correntes de membrana mediadas por GABAAR são calculadas a partir da corrente de vazamento (ou seja, os potenciais de reversão das correntes agonistas subtraídas por vazamento)36. As associações corrente-tensão obtidas a partir deste protocolo ajudam a fornecer uma melhor compreensão de onde as mudanças estão ocorrendo nas concentrações de íons durante um cenário experimental envolvendocanais receptores GABA A. Yelhekar et al.41 utilizaram um modelo computacional para mostrar que as conclusões sobre concentrações estáveis de íons do método de interpolação podem não ser justificáveis, pois o potencial de reversão estimado do método pode estar incorreto.
A resistência média usada para a maioria das gravações é de 5 MΩ. Pipetas com menor resistência de 3-4 MΩ podem resultar em menor resistência em série, o que é preferível para gravações de tensão-braçadeira. No entanto, a ponta da pipeta será comparativamente mais larga para pipetas de maior resistência e, como consequência, representa um desafio na forma de dificuldade na formação de vedação e estabilidade36,42. Assim, é necessário monitorar a formação de GΩ para obter registros com uma redução considerável no nível de dados ruidosos gerados. A robustez desta técnica para estudar a função e as atividades do KCC2 como julgado por sua adequação e confiabilidade na medição da atividade do GABA foi confirmada por vários estudos. Estudos anteriores mostraram que [Cl-]i permanecem estáveis usando esta técnica, medindo as respostas do GABAARs (que são capazes de portar a condutância de cloreto) aos seus respectivos agonistas. Por implicação, o acesso elétrico contínuo vem com pouca ou nenhuma modificação da concentração intracelular de cloreto43,44. Além disso, essa técnica facilita a evasão de alterações artificiais no potencial de membrana e no E GABA durante a ativação doGABA AR (que abre a condutância de cloreto e bicarbonato)45. O acima mencionado fornece a esta técnica uma vantagem à frente de outros tipos de gravações de eletrofisiologia. No entanto, as limitações desta técnica incluem o seguinte: (1) ruído de gravação frequente pode ocorrer devido à ponta do eletrodo ocupando parte da membrana, o que pode reduzir a resolução da corrente, e (2) a perfuração da membrana com gramicidina geralmente leva um período de tempo relativamente maior.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094), e uma Commonwealth Ph.D. Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
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