Summary
Mevcut protokol, nöronal K-Cl ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı blotlama tekniğinin uygulanmasını vurgulamaktadır. Protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de batı lekelenmesi yoluyla KCC2 fosforilasyonunun araştırılmasını açıklamaktadır. Ayrıca, KCC2 etkinliğini doğrulamak için ek yöntemler bu metinde kısaca vurgulanmıştır.
Abstract
Potasyum klorür kotransporterleri 2 (KCC2), sadece nöronda bulunan katyon-klorür-kotransporterlerin (CCC'ler) çözünen taşıyıcı ailesi 12'nin (SLC12) bir üyesidir ve Cl-homeostazın düzgün çalışması ve sonuç olarak fonksiyonel GABAerjik inhibisyon için gereklidir. KCC2'nin uygun şekilde düzenlenmesindeki başarısızlık zararlıdır ve epilepsi de dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların prevalansı ile ilişkilendirilmiştir. Araştırmacıların işlevlerini ve faaliyetlerini incelemelerini sağlayan tekniklerin geliştirilmesine akredite edilmiş KCC2'nin düzenlenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılması konusunda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir; doğrudan (kinaz düzenleyici bölgelerin fosforilasyonunu değerlendirmek) veya dolaylı (GABA aktivitesini gözlemlemek ve izlemek) araştırmalar yoluyla . Burada protokol, kinaz düzenleyici bölgelerde (Thr906 ve Thr1007) KCC2 fosforilasyonunun batı lekelenme tekniğini kullanarak nasıl araştırılacağını vurgulamaktadır. Rubidyum iyonu ve talyum iyonu alım testi gibi KCC2 aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanılan başka klasik yöntemler de vardır. GABA aktivitesini ölçmek için yama-kelepçe-elektrofizyoloji gibi diğer teknikler kullanılır; Bu nedenle, hücre içi klorür iyonu homeostazının değerlendirilmesi ile bilgilendirildiği gibi dolaylı olarak aktif ve / veya inaktive edilmiş KCC2'yi yansıtmaktadır. Bu ek tekniklerden birkaçı bu makalede kısaca tartışılacaktır.
Introduction
Potasyum klorür kotransporterleri 2 (KCC2), sadece nöronda bulunan katyon-klorür-kotransporterlerin (CCC'ler) çözünen taşıyıcı ailesi 12'nin (SLC12) bir üyesidir ve Cl-homeostazın düzgün çalışması ve sonuç olarak fonksiyonel GABAerjik inhibisyon 1,2,3,4 için gereklidir. KCC2 ile 4-6 mM'de düşük intranöronal Cl-konsantrasyonunun ([Cl-]i) korunması, beyin ve omurilikte γ-aminobütirik asit (GABA) / glisin hiperpolarizasyonunu ve sinaptik inhibisyonunu kolaylaştırır5. KCC2'nin uygun şekilde düzenlenmesindeki başarısızlık, epilepsi4 de dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların prevalansı ile ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, azalmış KCC2 aracılı Cl− ekstrüzyon ve bozulmuş hiperpolarize edici GABAA ve / veya glisin reseptörü aracılı akımlar epilepsi, nöropatik ağrı ve spastisite 6,7 ile ilişkilendirilmiştir. Nöronal KCC2, C-terminali hücre içi etki alanındaki anahtar düzenleyici kalıntıların, lizinsiz (WNK)-STE20 / SPS1 ile ilişkili prolin / alanin bakımından zengin (SPAK) / Oksidatif strese duyarlı (OSR) kinaz sinyal kompleksi1 tarafından fosforilasyonu yoluyla negatif olarak modüle edilir ve bu da olgunlaşmamış nöronlarda depolarize GABA aktivitesinin korunmasını kolaylaştırır 2,8,9 . WNK-SPAK / OSR1, treonin kalıntıları 906 ve 1007'yi (Thr906 / Thr1007) fosforile eder ve daha sonra KCC2'nin mRNA gen ekspresyonunu aşağı regüle eder ve bunun sonucunda fizyolojik fonksiyonundabozulmaya yol açar 8,10. Bununla birlikte, daha da önemlisi, WNK-SPAK / OSR1 kinaz kompleksinin KCC2 ekspresyonu 1,2,4,11,12'yi fosforile ettiği ve inhibe ettiği ve Thr906 / Thr1007'yi fosforile etmek için kinaz kompleksi sinyal yollarının inhibisyonunun KCC2 mRNA geninin artan ekspresyonu ile bağlantılı olduğu zaten bir gerçektir13,14,15 . Nöronal KCC2 ve Na+-K+-2Cl- kotransporters 1 (NKCC1) ekspresyonunun protein fosforilasyonu yoluyla düzenlenmesinin eşzamanlı ve ters paternlerde1,4,16 olarak çalıştığını belirtmek önemlidir.
Araştırmacıların işlevlerini ve faaliyetlerini incelemelerini sağlayan tekniklerin geliştirilmesine akredite edilmiş KCC2'nin düzenlenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılması konusunda tutarlı ve önemli ilerlemeler kaydedilmiştir; doğrudan (kinaz düzenleyici bölgelerin fosforilasyonunu değerlendirmek) veya dolaylı (GABA aktivitesini gözlemlemek ve izlemek) araştırmalar yoluyla . Burada sunulan protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de kotransporterin fosforilasyonunu araştırarak nöronal K + -Cl - ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı lekeleme tekniklerinin uygulanmasını vurgulamaktadır.
Western blot, bir doku veya hücre örneğinden ilgilenilen spesifik proteinleri tespit etmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem önce proteinleri elektroforez yoluyla boyutlarına göre ayırır. Proteinler daha sonra, hedef protein spesifik bir antikor kullanılarak işaretlenmeden önce elektroforetik olarak katı bir desteğe (genellikle bir zar) aktarılır. Antikorlar, kolorimetrik, kemilüminesans veya floresan yöntemleri kullanılarak tespit edilen farklı etiketlere veya florofor konjuge antikorlara konjuge edilir. Bu, belirli bir hedef proteinin bir protein karışımından tespit edilmesini sağlar. Bu teknik, KCCs1'in fosfospesifik bölgelerini karakterize etmek için kullanılmıştır ve KCC3 Thr991 / Thr1048 fosforilasyon17'yi inhibe eden kinaz inhibitörlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bu protokolü izleyerek, hücre / doku lizatlarından toplam ve fosforile KCC2'yi spesifik olarak tespit edebilirsiniz. Prensip olarak, protein konjuge antikorların bu teknikle tespiti, fizyolojik düzenlemelerinde yer alan moleküler mekanizmalara ışık tutan KCC2'nin fosfo-bölgelerindeki işbirlikçi faaliyetlerin anlaşılmasını geliştirmeye yardımcı olduğu için oldukça etkilidir. Toplam protein ekspresyonunun kantitatif analizi, KCC2'nin işlevini ve aktivitesini temsil eder. Rubidyum iyonu ve talyum iyonu alım testi gibi KCC2 aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanılan başka klasik yöntemler de vardır. GABA aktivitesini ölçmek için yama-kelepçe-elektrofizyoloji gibi diğer teknikler kullanılır; Bu nedenle, hücre içi klorür iyonu homeostazının değerlendirilmesi ile bilgilendirildiği gibi dolaylı olarak aktif ve / veya inaktive edilmiş KCC2'yi yansıtmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Protokol, ilgilenilen spesifik proteinleri tespit etmek için batı lekeleme yöntemini açıklar.
1. Hücre kültürü ve transfeksiyon
- Hücre kültürü prosedüründen önce boncuk banyosundaki (37 ° C) tüm reaktifleri ısıtın. % 10 fetal sığır serumu,% 1 2mM L-glutamin, 100x esansiyel olmayan amino asit, 100 mM sodyum piruvat ve 100 birim / mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş kültür ortamı olan Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) hazırlayın.
- Çözülebilir transfekte sıçan KCC2b insan embriyonik böbrek 293 hücre (HEK293rnKCC2b)18 tamamen boncuk banyosunda (37 ° C). Hücreleri kriyoviyal tüpten 5 mL taze ortam içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreyi 3-5 dakika boyunca 1200 ×g'de döndürün.
- Süpernatantı aspire etmek için bir aspiratör pipeti (vakum pompasına sabitlenmiş) kullanın ve hücreleri yeniden askıya almak için 10 mL taze ortam ekleyin. Hücre süspansiyonunu 10 cm'lik bir çanak tabağa aktarın.
- Çanağı inkübatöre yerleştirin ve nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 48 saat büyümesine izin verin. Sağlıklı hücre büyümesini sağlamak için kuluçka süresini izleyin. Ayrıca, kuluçka döneminden sonra% 90'ın üzerinde birleşme elde ettiklerinde hücreleri bölün.
- Eski ortamı hücre çanağından aspire edin ve hücreleri 2 mL fosfat tampon salin (PBS) ile nazikçe durulayın. 2 mL tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık 1-2 dakika kuluçkaya yatırın.
- Tripsinize hücreleri tabakta nazikçe yıkamak için 2 mL komple ortam kullanın. Yeni yemeklere 9 mL taze medya ekleyin ve eski yemekten yenilerinin her birine 1 mL çözelti ekleyin. Bölünmüş hücre kaplarını% 90'lık ≥ akıcılık elde etmek için 48 saat boyunca inkübatöre geri aktarın.
- Hücreleri lizis tamponunda toplamadan önce hücreleri kontrol olarak dimetil sülfoksit (DMSO), 8 μM staurosporin veya 0.5 mM N-etilmaleimid (NEM) ile 15 dakika boyunca tedavi edin.
2. Hücre lizatlarının hazırlanması ve numunelerin yüklenmesi
- Kültür çanağındaki medyayı aspire edin (transfeksiyon prosedürlerinden). Hücre kültürünü buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
- PBS'yi aspire edin, ardından 50 mM tris-HCl (pH 7.5), 1 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N,N,N′,N′-tetraasetik asit (EGTA), 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 50 mM sodyum florür, 5 mM sodyum pirofosfat, 10 mM sodyum-β-gliserofosfat, 1 mM sodyum ortovanadat,% 1 (w/v) Triton X-100, 0.27 M sakkaroz, içeren 1.0 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin, Yemeğe 1 mM benzamin,% 0.1 (v / v) 2-merkaptoetanol ve 2 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF).
NOT: Hücre hasadı sırasında lizis tamponunun hacmi, çanak boyutlarına göre değişir, örneğin, 1 x 107 hücre/100 mm çanak/150 cm2 şişe başına 1 mL lizis tamponu uygunken, 5 x 10 6 hücre/60 mm çanak/75cm2 şişe başına 0,5 mL uygundur. - Hücreleri kabın altından kazımak için soğuk bir plastik hücre kazıyıcı kullanın, ardından hücre süspansiyonunu zaten buz üzerinde bulunan bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için yavaşça bir pipet kullanın. Tüpü 4 ° C'de 30 dakika boyunca sürekli çalkalayın.
- Hücre lizatlarını 20 dakika boyunca 16.000 x g'da soğuk bir santrifüjde (4 ° C) döndürün, tüpü santrifüjden yavaşça çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı önceden soğutulmuş taze bir tüpe toplayın ve peleti atın.
NOT: Hücre tipine bağlı olarak santrifüjleme kuvvetini ve süresini değiştirmek gerekebilir. Bununla birlikte, genel kurallar 20 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjlemeyi teşvik eder. Ancak, bu her deney için belirlenmelidir. Örneğin, lökositler gibi hassas hücrelerin çok hafif bir santrifüj hızına ihtiyacı vardır.
3. İmmünopreçökitanların hücre lizatlarından hazırlanması
- Pipet 300 μL protein-G-sefaroz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir. Çözeltiyi 2 dakika boyunca 500 x g'da döndürün ve süpernatanı atın.
- 500 μL PBS ekleyin ve çözeltiyi iyice vorteksleyin. Çözeltiyi 2 dakika boyunca 500 x g'da döndürün ve süpernatanı atın. Bu adımı tekrarlayın.
- 1 mg anti-KCC2 Thr906 ve anti-KCC2 Thr1007 antikorlarını 200 μL protein G-sefaroz boncukları ile karıştırın ve PBS ile 500 μL'ye kadar olan hacmi oluşturun. Titreşimli bir platformda veya dönen tekerlekte 4 °C'de 2 saat boyunca çalkalayın. PBS ile 2 kat yıkayın.
- Tüm hücre lizatları üzerinde protein miktarı ölçümü yapın ve yıkanmış boncuklara 1 mg hücre lizatı ekleyin. Uçtan uca bir rotatörde 4 °C'de 2 saat boyunca nazikçe inkübe edin. Boncukları döndürün ve 150 mM sodyum klorür (NaCl) içeren PBS ile 3 kat yıkayın.
- İmmünopreseptitanları (boncukları) 200 μL PBS ile 3 kat yıkayın. Son peleti 100 μL 1x lityum dodesil sülfat (LDS) numune tamponunda yeniden askıya alın.
- Tüpleri oda sıcaklığında bir rotor çalkalayıcıda 5 dakika çalkalayın ve 10 dakika boyunca 75 ° C'de bir ısıtma bloğunda inkübe edin. Yükleme numunesini 2 dakika boyunca 11.000 x g'de santrifüj edin ve jel yükleme için süpernatantı kullanın.
4. Batı lekesini gerçekleştirmek
- Döküm aparatını monte edin ve taze hazırlanmış% 8 ayırma jeli dökün (tarif/hazırlık için Tablo 1'e bakınız), jeli döküm camının üstünden yaklaşık 2 cm alana izin verecek şekilde dökün. Kuruluma 200 μL mutlak izopropanol ekleyin ve 60 dakika boyunca oda sıcaklığında durmasına izin verin.
NOT: Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için poliakrilamid jel tarifi, ilgilenilen proteinin boyutuna bağlıdır (Tablo 2). Bu nedenle, istenen jel yüzdesini belirlemeden önce protein boyutunu not edin. - İzopropanolü çıkarmak için bir pipet kullanın ve jeli yaklaşık 200 μL damıtılmış su ile dikkatlice durulayın. Döküm kurulumundaki yaklaşık 2 cm'lik alanı doldurmak için taze hazırlanmış% 6 istifleme jeli ekleyin (tarif/hazırlık için Tablo 1'e bakınız). Kuyu tarağına yavaşça oturtun ve 30 dakika oda sıcaklığında bekletin.
- Döküm jeli elektroforez tankına sabitleyin.
- 10x transfer tamponu hazırlamak için 30.3 g Tris bazı, 144.1 g glisin ve 10 g SDS'yi 1000 mL damıtılmış suda çözün. 890 mL damıtılmış suya 10 mL %10 SDS ve 100 mL 10x transfer tamponu ekleyerek 1x çalışan tampon hazırlayın.
- Tankın içine 1x çalışan tampon dökün. İlk kuyucuğa 5 μL moleküler ağırlık işaretleyicisi ve SDS-PAGE jelinin her bir kuyucuğuna eşit miktarda protein yükleyin (kullanılan tarak boyutuna bağlı olarak 18-30 μL arasında). Boş kuyucukları 1x LDS ile doldurun ve jeli 120 V'ta yaklaşık 90-120 dakika çalıştırın.
- 10x transfer tamponu hazırlamak için 58.2 g Tris baz ve 29.3 g glisini 1000 mL damıtılmış suda çözün. Nitroselüloz membranı% 20 metanol içeren 1x transfer tamponu ile aktive edin. Jeli ve membranı transfer tamponu ile durulayın ve bunları hazırlama yığınına yavaşça yayın.
NOT: Çalışan tamponların pH'ını ayarlamaya gerek yoktur, çünkü gereken optimum pH'ta olmaları gerekir. Ayrıca, zamandan tasarruf etmek için bu tamponların hazırlanması ve deneyden önce oda sıcaklığında saklanması önerilir. - Aktarılacak sandviçi şu sırayla düzenleyin: negatif elektrot (siyah çerçeve / uç) - sandviç köpüğü - filtre kağıdı - durulanmış SDS-PAGE jel - durulanmış nitroselüloz membran - filtre kağıdı - sandviç köpüğü - pozitif elektrot (kırmızı çerçeve). Birleştirilmiş sandviçi transfer tankına istifleyin ve 90 dakika boyunca 90 V'ta veya 360 dakika boyunca 30 V'ta çalıştırın.
5. Antikor boyama ve görüntü geliştirme
- Membranı çıkarın ve kurumasını bekleyin. %0,1 1x Tween 20 (1x TBS-T) içeren Tris tamponlu salin içinde %5 yağsız sütten yapılmış bir blokaj tamponu kullanarak membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edin.
- Membranları, oda sıcaklığında 1 saat boyunca veya 4 °C'de gece boyunca bloke edici tamponda uygun primer antikor 8,15,19 ve beta-aktin (yükleme kontrolü) seyreltilmeleri ile inkübe edin. Membranı, her biri 5 dakika boyunca 1x TBS-T'lik üç yıkamada yıkayın.
NOT: Ayrı membranın beta-aktin, alfa-tübülin veya gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz antikorları gibi yükleme kontrolleri ile inkübasyonu, sonraki niceleme sırasında diğer batı lekelenme sonuçlarını normalleştirmektir. Her birincil antikor için önerilen seyreltme, üreticinin el kitabında mevcuttur. - Yıkanmış membranı, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bloke edici tamponda 5000 kat seyreltilmiş sekonder antikor ile inkübe edin. Yine, membranı her biri 5 dakika boyunca 1x TBS-T'de 3x yıkayın.
NOT: Sekonder antikorun, primer antikorun yükseldiği türlere karşı yükseltilmesi şiddetle tavsiye edilir. Örneğin, toplam KCC2'nin birincil antikoru fare anti-KCC2 ise, anti-fare için ikincil antikor kullanılmalıdır. - Yıkanmış zarı görüntüleme kartına yerleştirin. Her bir gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifinin eşit hacimlerini karıştırın ve sinyaller geliştirmek için karışık çözeltiyi membran üzerine yavaşça yayın.
6. Bir görüntüleme sistemi kullanarak görüntü toplama ve veri ölçümü
- Görüntüleme kartını, görüntüleme için görüntüleme sistemindeki uygun bölmeye aktarın. Görüntü işleme için bilgisayardaki görüntüleme yazılımını açın.
- Araç çubuğunda, Yeni Protokol'ü tıklatın ve Tek Kanal'ı seçin. Jel görüntüleme/uygulama iletişim kutusu altında Seç'i tıklatın, Leke'ye gidin ve Chemi Hi Sensitivity veya Chemi Hi Resolution seçeneklerinden birini seçin. Ardından, elde edilecek görüntülerin süresini ve sayısını ayarlamak için Sinyal Biriktirme Kurulumu'na tıklayın.
- Protokol kurulumu altında Konum Jeli'ne tıklayın ve gerekirse jeli görüntüleme sisteminde ayarlayın. Görüntüleri almak için Protokolü Çalıştır'ı tıklatın.
- Görüntüleri bilgisayara kaydetmek için görüntüleme kataloğu kutusunun altındaki alınan görüntülerden birine sağ tıklayın. İstediğiniz görüntüye gidin ve Çalıştır iletişim kutusunun altındaki Görüntü Seç ve Devam Et'e tıklayın.
- Görüntünün kontrastını ve piksel doygunluğunu ayarlamak için Görüntü Dönüştürme simgesine tıklayın. İstediğiniz görüntü formatına bağlı olarak görüntüyü bilgisayara kaydetmek için genel araç çubuğundaki Ekran Görüntüsü simgesine tıklayın.
- ImageJ yazılımını kullanarak bant yoğunluklarını ölçün ve uygun istatistiksel araçları kullanarak analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, Şekil 1'de sunulan temsili sonuç, batı lekeleme tekniğini kullanarak KCC2b'yi (HEK rnKCC2b)18 kararlı bir şekilde eksprese eden HEK293 hücre hatlarında KCC2 veNKCC1'in WNK-SPAK / OSR1 aracılı fosforilasyonu üzerine staurosporin ve NEM'in etkisini araştırmıştır. Temsili sonuçlarla ilgili kapsamlı ayrıntılar Zhang ve ark.15'te tartışılmaktadır. NEM'e benzer şekilde, staurosporin, KCC2 taşıma aktivitesini artırabilen ve NKCC1 aktivitesiniinhibe edebilen geniş bir kinaz inhibitörüdür 15,20. HEK293 hücrelerinin staurosporin ve NEM ile tedavisi, SPAK hedef bölgelerinde fosforilasyonun azalmasına neden oldu - T-döngü kinaz alanında bulunan Thr233 ve hsSPAK'ın S-döngü fosforilasyon bölgesi Ser373. Böylece, her iki bileşik de yukarıda belirtilen SPAK fosfo bölgelerinin fosforilasyon seviyelerini kısaltmıştır. Ayrıca, staurosporin, HEKrnKCC2b'de Ser940'ın fosforilasyonunu azalttı, ancak NEM fosforilasyonunu önemli ölçüde arttırdı. Ayrıca, staurosporin, Thr505 bölgesinde fosforilasyonu azaltırken, NEM aynı bölgede fosforilasyonda hafif ama önemsiz bir artışa neden olmuştur. Her iki bileşiğin Thr505 bölgesinde protein kinaz C (PKC) fosforilasyonu üzerindeki diferansiyel etkileri ve Ser940 bölgesindeki KCC2b iyi ilişkilidir. Temsili sonuç ayrıca her iki ajanın da toplam rnKCC2b, hsNKCC1 veya hsSPAK ekspresyonunu değiştirdiğini göstermiştir. NEM (ancak staurosporin tedavisi değil), toplam KCC2 miktarının ekspresyonunda önemli bir artışa neden olurken, toplam NKCC1 ve SPAK ekspresyonu, her iki bileşikle de tedavi edildiğinde anlamlı olarak değişmemiştir. Ayrıca, iki bileşik Thr233 ve Ser373 bölgelerinde SPAK'ın fosforilasyonunun azalmasına neden oldu ve bu, sırasıyla rnKCC2b ve hsNKCC1'deki Thr906 / Thr1007 ve Thr203/207/212 bölgelerinin kısaltılmış fosforilasyonu ile ilişkiliydi. Ek olarak, staurosporin ve NEM, sırasıyla rnKCC2b'deki Ser940 bölgesinde PKC'nin fosforilasyonunu azalttı ve arttırdı, bu da sırasıyla staurosporin ve NEM tedavisi üzerine Thr505 bölgesinde PKC-δ fosforilasyonundaki azalma ve artış ile ilişkili oldu (Şekil 1).
Şekil 1: HEK rn KCC2b hücrelerinde staurosporin ve NEM tedavisi üzerinern KCC2b ve hsNKCC1 fosfo-bölgelerinin kantitatif analizleri. (A) Stably-transfekte edilmiş HEK rnKCC2b hücrelerine 15 dakika boyunca DMSO (kontrol), 8 μM staurosporin veya 0.5 mM NEM ile muamele edildi. Hücre lizatları toplandı ve endike antikorlarla immünopresipitasyon (IP) ve immünoblot (IB) yöntemine tabi tutuldu. Kısaltmalar: D = dimerik KCC2; M = monomerik KCC2. (B) Staz transfekte HEKrnKCC2b hücrelerinin immünoblot miktarının belirlenmesi. Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü. p < 0,001; **p < 0,01; Wilcoxon-Mann Whitney testi (n = 6). Bu rakam Zhang ve ark.15'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 8 mL% 8 Ayırma Jeli | 5 mL %6 İstifleme Jeli | ||
| Gerekli malzemeler | Ses seviyesi (μL) | Gerekli malzemeler | Ses seviyesi (μL) |
| Damıtılmış H2O | 4200 | Damıtılmış H2O | 2900 |
| % 40 Akrilamid | 1600 | % 40 Akrilamid | 750 |
| 1,5 M Tris pH 8,8 | 2000 | 0,5 M Tris pH 6,8 | 1250 |
| %10 SDS | 80 | %10 SDS | 50 |
| %10 APS | 80 | %10 APS | 50 |
| TEMED | 8 | TEMED | 5 |
| Ayırma jelinin yapılması: | |
| 1) | 4,2 mL ddH2O ile başlayın |
| 2) | 1.6 mL% 40 akrilamid / bis-akrilamid çözeltisi ekleyin |
| 3) | 2 mL 1,5 M Tris pH 8,8 ekleyin ve karıştırın |
| 4) | 80 μL %10 SDS karıştırın |
| 5) | Kullanıma hazır olduğunda, 8 μL TEMED ekleyin ve karıştırın |
| 6) | 80 μL %10 APS* ekleyin ve karıştırın |
| İstifleme jelinin yapımı: | |
| 1) | 2,9 mL ddH2O ile başlayın |
| 2) | 0.75 mL% 40 akrilamid / bis-akrilamid çözeltisi ekleyin |
| 3) | 1,25 mL'lik 0,5 M Tris pH 6,8 ekleyin ve karıştırın |
| 4) | 50 μL %10 SDS karıştırın |
| 5) | Kullanıma hazır olduğunda, 5 μL TEMED ekleyin ve karıştırın |
| 6) | 50 μL %10 APS* ekleyin ve karıştırın |
| SDS = Sodyum Dodesil Sülfat | |
| APS = Sülfat Başına Amonyum | |
| TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-tetrametilenidiamin | |
| * APS eklendikten sonra, çözelti derhal döküm aparatına dökülmelidir, çünkü çözelti birkaç dakika içinde polimerize olur. Bu nedenle, ayırma ve istifleme jeli çözeltilerinin, çözeltilere ihtiyaç duyulduğunda hazırlanması tavsiye edilir. | |
Tablo 1: Poliakrilamid jel karışımı yapmak için reçete (jel çözeltilerinin ayrılması ve istiflenmesi).
| Jel Yüzdesi (%) | Protein Boyutu (kDa) |
| 20'ye kadar | 4 ila 40 |
| 15 | 12 karşı 45 |
| 12.5 | 10 ila 70 |
| 10 | 15 ila 100 |
| 8 | 50 ila 200 |
| 4 ila 6 | > 200 |
Tablo 2: Farklı protein boyutları için önerilen SDS-PAGE jel yüzdesi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KCC2 de dahil olmak üzere nöronlarda eksprese edilen CCC'lerin SLC12 aktivitelerini ölçmek için birçok yöntem kullanılmıştır. Bu tekniklerin birçoğunun, bu taşıyıcıların fonksiyonel ilgisinin analizi ve hastalıkla ilgili farklı mutasyonlardaki yapı-fonksiyon paternleri hakkında bilimsel bilgiyi arttırdığı kanıtlanmıştır. Kritik olarak, çeşitli yöntemlerin avantajları ve uyarıları vardır21. Bununla birlikte, yukarıda açıklanan protokol, KCC2'nin işlevlerini ve faaliyetlerini incelemede yardımcı olabilecek batı lekesini kullanarak, kinaz düzenleyici bölgelerinde, Thr906 ve Thr1007'de KCC2 fosforilasyonunun nasıl değerlendirileceğini özetlemiştir.
KCC2'nin regülasyonu, anahtar serin / treonin kalıntılarında fosforilasyon ve defosforilasyon yoluyla gerçekleşir1. Batı lekelemesi, Thr906 ve Thr1007'deki kinaz düzenleyici bölgelerinde KCC2 fosforilasyonunu araştırmak için kullanılabilecek etkili bir tekniktir. Prensip olarak, KCC2'nin fosforilasyonundaki değişiklikler, ilgili immünoblot örneklerinin / proteinlerinin fosfo-peptitlerine karşı yönlendirilen fosfo-spesifik antikorlar kullanılarak tespit edilir. Western blot, bir doku veya hücre örneğinden ilgilenilen spesifik proteini tespit etmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem önce proteinleri elektroforez yoluyla boyutlarına göre ayırır. Proteinler daha sonra, hedef protein spesifik bir antikor kullanılarak işaretlenmeden önce elektroforetik olarak katı bir desteğe (genellikle bir zar) aktarılır. Antikorlar, kolorimetrik, kemilüminesans veya floresan yöntemleri kullanılarak tespit edilen farklı etiketlere veya florofor konjuge antikorlara konjuge edilir. Bu, belirli bir hedef proteinin bir protein karışımından tespit edilmesini sağlar. Bu teknik, KCC2 2,8'in fosfospesifik bölgelerini karakterize etmek için kullanılmış ve KCC2 Thr906 / Thr1007 fosforilasyon15'i antagonize eden KCC2 inhibitörlerini tanımlamak için kullanılmıştır. HEK293 hatları, moleküler biyoloji deneylerindeki avantajları nedeniyle çeşitli deneylerde kullanılmaktadır. Üremesi hızlı, bakımı kolay ve transfeksiyon ve protein üretimi için oldukça verimlidir22. Bununla birlikte, bazı görüşler, nörobiyoloji deneylerini yürütmek için en uygun aday olmayabileceğini, çünkü beyinden kaynaklanan bir hücre olmadığını ve dolayısıyla fizyolojik özgüllüğünün sinirbilim araştırmalarında sorgulanabilir olabileceğini savunmaktadır. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, HEK293 hücrelerinde KCC2 ekspresyonunda ve gerçek nöronal dokularda / hücrelerde 15,23'te benzer sonuçların gözlendiğini göstermiştir. Bu nedenle, HEK293'ün sinirbilim araştırmalarındaki ilgisi tamamen göz ardı edilemez.
Western blotting tekniği ile protein ekspresyonunun analizini içeren çalışmalarda, lizis tamponu bileşiminin seçimine, kullanılacak deterjanın doğasına (tipi ve konsantrasyonu)24 ve proteaz inhibitörlerine özel dikkat gösterilmelidir. Tamponun bileşimi, çözündürme ve ekstraksiyon işlemlerini kolaylaştırmak ve batı lekesi25 tarafından kolayca algılanmasını sağlamak için hedef proteine uyacak şekilde optimize edilmelidir. Çözünür proteinler için genellikle düşük konsantrasyonda hafif deterjan gerekirken, membran proteinleri daha güçlü deterjan koşulları gerektirebilir. Bununla birlikte, güçlü deterjanlar etkileşimleri bozabilir ve kompleksler kaybolabilir. Deterjanların hem tipleri hem de konsantrasyonları proteinin doğasını ve aktivitesini etkileyebilir, bu nedenle bu deterjanlar için kısıtlanmış / tolere edilmiş konsantrasyon aralığına bağlı kalmaya ihtiyaç vardır. Proteaz inhibitörünün eklenmesi, hedef proteinin endojen proteinler tarafından parçalanmasını önleyecektir ve proteolitik oranları etkili bir şekilde azaltmak için önerilen en uygun çalışma sıcaklığı 4 ° C'dir. Bazen, zayıf immünoblot sinyalleri veren antikorlar için yüksek kaliteli immünoblot sinyalleri elde etmek amacıyla, immünopresipitasyon (IP), batı lekelenmesi için yukarı akış deneyi olarak gerçekleştirilir. Bu teknik avantajlıdır, çünkü antijenler ve ilgili antikorları arasındaki etkileşimi, sonuçta ayrılma ve nicelleştirmeden önceki doğal konformasyonlarında kolaylaştırır26. Bu nedenle, IP, batı blotlama prosedürlerinden elde edilen çıktıların kalitesini artırabilir. IP tekniğinin uygulanmasından önce, lizattaki ko-immünoçökeltilmiş partner proteinlerin ekspresyonunun varlığını ve etkinliğini, batı lekelenmesi ile tüm hücre lizatını veya giriş fraksiyonlarını analiz ederek değerlendirmek önemlidir. Ayrıca, SDS-PAGE elektroforezi için istenen yüzde jel çözeltilerini hazırlamadan önce, araştırılacak proteinin moleküler ağırlığının önceden bilinmesi gerekir, çünkü proteinin boyutu jel matrisinin eleme etkisini etkiler.
Bununla birlikte, bu teknikle protein konjuge antikorların tespiti, KCC2'nin fosfo-bölgelerindeki işbirlikçi faaliyetlerin anlaşılmasını geliştirmeye yardımcı olduğu için oldukça etkilidir, bu da kotransporter fosforilasyonu ve kotransporterleri düzenleyebilecek sinyal yolunun bütünlüğü hakkında bilgi sağlayabilir. Bununla birlikte, batı leke tekniğinin yalnızca yarı nicel veriler üretebildiğini belirtmek önemlidir; bu, tekniğin yalnızca protein ifadelerinin göreceli değerlendirmesini vurguladığı, ancak mutlak nicelleştirmeyi vurgulamadığı anlamına gelir. Bu, bireysel lekelerde farklı olan ayrı şeritlerde numune yükleme ve aktarma oranlarındaki tutarsızlıklara akredite edilmiştir. Üretilen algılanan sinyal de doğrusal değildir ve numunelerin konsantrasyon aralığını yansıtmaz27. Ayrıca, fosforilasyon durumu, protein aktivitesini raporlamak için güvenilir bir faktör olmayabilir, çünkü inhibitörler, mutasyonlar ve çevresiyle protein etkileşimleri gibi müdahaleler, fosforilasyon seviyesini değiştirmeden protein aktivitesini doğrudan etkileyebilir28,29,30. Bu nedenle, diğer biyokimyasal yöntemleri desteklemek için fosfo-spesifik antikorların kullanılması daha faydalı olabilir.
Daha önce de belirtildiği gibi, KCC2 aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanılan başka klasik yöntemler de vardır. KCC2'nin, homojen hücre preparatlarının zarından radyoaktif 86Rb + akısının ölçülmesiyle değerlendirilmesi popüler bir yaklaşımdır. Bu yöntem, aktif radyoizotopları iyonik kanallardan geçirerek izleyici olarak kullanır. Kısaca, ilgilenilen hücreler endojen KCC2'yi inhibe etmek için katyon içermeyen çözeltilerde inkübe edilir, ardından ouabain gibi spesifik inhibitörlerle inkübasyon ve daha sonra inhibitör ve 86Rb + içeren alım ortamı ile inkübe edilir. Sıvı sintilasyon sayaçları, hücre lizisine devam eden aktiviteleri ölçmek/izlemek için kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntem sağlam, oldukça hassas ve seçicidir ve rahatsızlıklara daha az eğilimlidir. Bununla birlikte, uygulamaları beyin veya nöron kültürleri gibi çoklu hücre tiplerine sahip dokulara yayılmaz. Dahası, bu teknik hücre altı seviyede iyon konsantrasyonunun çözünürlüğündeki değişiklikleri kısıtlar. Ayrıca, yüksek enerji emisyonu (max 1.77 MeV; max 1.08 MeV)31 ile karakterize kısa yarı ömürlü (18.65 gün) radyoizotoplarla çalışmanın potansiyel toksisitesi ve sağlık tehlikesi ile ilgili güvenlik sorunları vardır. Bu, genellikle çok sayıda hücrenin gerekli olduğu nöronal hücre çalışmaları için uygun olmadığını büyük ölçüde düşündürebilir. Bu sorunlar, iyon akılarının belirlenmesi için radyoaktif 86Rb + 'ya alternatif olarak Terstappen 1999 tarafından radyoaktif olmayan 85Rb + efflux testinin geliştirilmesine yol açmıştır. Radyoaktif olmayan yaklaşım, ilaç endüstrisinde K + ve seçici olmayan katyon kanallarının analizi için radyoaktif 86Rb + testlerini büyük ölçüde sürgün etmiştir31. Radyoaktif olmayan 85Rb + efflux testi iki ana işlemi içerir, birincisi hücre kültürü ve manipülasyonu ve ikincisi izleyici rubidyumun atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS) ile belirlenmesidir. Bu yöntemin kullanımı kolaydır, ancak bir dizi tahlil doğrulama deneyi gerektirir ve zayıf zamansal çözünürlükten muzdariptir32. Bununla birlikte, radyoaktif olmayan 85Rb + efflux testi, KCC'lerin ve NKCC'lerin33'ünün değerlendirilmesi için güvenilir bir teknik olduğunu giderek kanıtlamıştır.
Talyum (TI +) akı testi, KCC2 ve NKCC2'deki K + bölgesine yüksek bağlanma afinitesi nedeniyle K + için bir vekil iyon olarak TI + kullanır. Hücrelere TI + akışı, benzotiazol kumarin ve fluozin-2 gibi talyuma duyarlı bir floresan boya kullanılarak tespit edilebilir. Kanal tarafından taşındıktan sonra, TI +, BTC / fluozin-2 boyası ile ilişkilendirilebilir ve florometrik görüntüleme plakası okuyucusu 31 tarafından tespit edilebilen bir floresandeğişikliğine neden olabilir. TI + indikatör boyaları, hücrelere asetoksimetil esterler olarak girer ve daha sonra aktif florojenik formları serbest bırakmak için sitoplazmik esterler tarafından bölünür. KCC'leri aktive etmek için, hücreler test bileşiklerinin varlığında veya yokluğunda (örneğin, KCC2 inhibitörleri) bir K + ve Tl + karışımı ile uyarılır. Talyum floresan boyaya girer ve bağlanır. Floresan sinyalindeki artış, özellikle kotransporter aracılığıyla hücreye Tl + 'nın akışı ile orantılıdır ve bu nedenle kotransporter aktivitesinin fonksiyonel bir ölçümünü temsil eder. Bu yöntem aynı zamanda çeşitli hücre kültürlerinde KCC2 ve NKCC2 aktivitesinin ölçülmesinde de iyi uygulanmıştır, örneğin, insan KCC234'ü istikrarlı bir şekilde ifade eden HEK293 hücre hattı üzerine yapılan çalışmalar. Onur kırıcı bir uçta, TI + akışına müdahale edebilecek çeşitli potansiyel hedef dışı yol çizgileri vardır, örneğin, HEK293 hücrelerindeki Na + / K + ATPaz, daha yüksek bir yanlış pozitif veya yanlış negatif isabet oranına neden olabilir35. Dahası, diğer akı tahlillerinde olduğu gibi, nöronal hücrelerde bu tür bir yaklaşımın uygulanması, çoklu yıkama adımlarından sonra nöronal hücrelerin zayıf hayatta kalması nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Birden fazla K + kanalının ve taşıyıcının nöronal ekspresyonu, KCC2 spesifik K + akılarının doğru bir şekilde değerlendirilmesini de engelleyebilir. Bu teknik, dendritler ve dendritik dikenler gibi küçük nöronal bölmedeki kanalların incelenmesi için sınırlamalar sunar ve düşük zamansal çözünürlükle birleştiğinde uzamsal çözünürlük eksikliğinden kaynaklanan aksonlar borçludur.
GABA aktivitesini ölçmek için yama-kelepçe-elektrofizyoloji gibi diğer teknikler kullanılır; Bu nedenle, hücre içi klorür iyonu homeostazının değerlendirilmesi ile bilgilendirildiği gibi dolaylı olarak aktif ve / veya inaktive edilmiş KCC2'yi yansıtmaktadır. Genel olarak, SLC12 fonksiyonunun elektrofizyolojik ölçümleri, GABAA reseptörlerinin (GABAAR) klorür36'ya geçirgen olduğu ilkesine dayanır. KCC2, GABAerjik inhibisyonun modülasyonunda anahtardır. Özellikle, KCC2'nin [Cl-]i ekstrüzyon aktivitesi, GABAA R6'nın hiperpolarizasyonunun altında yatmaktadır. Hücre içi kayıtlar, KCC2'nin klorür ekstrüzyon kapasitesinin, GABAA R-aracılıakımların (EGABA) potansiyelindeki tersine çevrilmesinden ekstrapolasyonu yoluyla çok önemli bilgiler sağlar. Hiperpolarize bir EGABA, daha düşük [Cl-]i ve dolayısıyla KCC2'nin aktivitesinde bir artış olduğunu gösterir. Elektrofizyolojide gramicidin yama-kelepçe tekniği, GABA aktivitesini ölçmek için altın standart bir yaklaşımdır. Daha önce yayınlanmış bazı çalışmalar, [Cl-]i homeostazını değerlendirmek / izlemek için KCC2'nin işlevlerini ve aktivitelerini araştırmak için gramicidin yama-kelepçe kaydını kullanmıştır ve gerçekten başarılı olduğunu kanıtlamıştır 8,9,37,38,39,40 . Bir gramicidin yama-kelepçe kaydı sırasında, hücre / doku yüzeyinde, hücre / dokuyu çevreleyen bir banyodaki başka bir elektroda atıfta bulunarak iyon kanallarının hücre içi aktivitesini kaydetmek için göreceli bir yamaya sahip bir cam elektrot kullanılarak sıkı bir sızdırmazlık oluşturulur. Bu teknik, voltaj kelepçesi modunda sabit bir voltajda bir hücrenin zarını geçen akım miktarını ölçerek veya akım kelepçesi modu36'da sabit bir akımda membran boyunca hareket eden voltaj miktarını kaydederek gerçekleştirilebilir. Temel tekniğin büyük ölçüde araştırma sorusuna bağlı olan çeşitli varyasyonları uygulanabilir. Bu teknik, nispeten büyük bir gözenek benzeri tüm hücre yama kaydı oluşturmaz, ancak elektrot çözeltisinde bulunan gözenek oluşturan antibiyotik (gramicidin), membran36'da küçük gözenekler oluşturmak için kullanılır. Özellikle, gramicidin ilavesi, membranda önemsiz anyon geçirgenliği sergileyen katyon seçici gözenekler oluşturur. Voltaj rampası protokolleri, akımı sabit bir voltajda kaydetmek için etkili ve güvenilir bir alternatiftir. Gerilim rampası protokolleri ile elde edilen akım/gerilim ilişkileri, GABAA R-aracılımembran akımlarının daha iyi kaydedilmesini sağlıyor gibi görünmektedir. Bu protokolde, sürekli değişen ancak izlenen bir voltaj (sabit bir oranda) uygulanır ve akım sürekli olarak aynı andaölçülür 36,41. Bu protokol sırasında, voltaj darbelerinin uygulanması (genellikle hiperpolarize yönde), ohmik tepkilerin bir sonucu olarak kaçak akımı aktive etmek için kullanılır. Tipik olarak, GABAA Raracılı membran akımları, kaçak akımdan (yani, sızıntı çıkarılan agonist akımlarının tersine çevirme potansiyelleri) hesaplanır36. Bu protokolden elde edilen akım-gerilim ilişkileri, GABAA reseptör kanallarını içeren deneysel bir senaryo sırasında iyon konsantrasyonlarında değişikliklerin nerede meydana geldiğinin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olur. Yelhekar ve ark.41, interpolasyon yönteminden kararlı iyon konsantrasyonları hakkındaki sonuçların haklı olmayabileceğini göstermek için hesaplamalı bir model kullanmışlardır, çünkü yöntemden tahmini tersine çevirme potansiyeli yanlış olabilir.
Çoğu kayıt için kullanılan ortalama direnç 5 MΩ'dur. 3-4 MΩ daha düşük dirence sahip pipetler, voltaj kelepçeli kayıtlar için tercih edilen daha düşük seri direncine neden olabilir. Bununla birlikte, pipetin ucu daha yüksek dirençli pipetler için nispeten daha geniş olacaktır ve sonuç olarak, conta oluşumunda zorluk ve stabilite36,42 şeklinde bir zorluk teşkil eder. Bu nedenle, üretilen gürültülü veri seviyesinde önemli bir azalma ile kayıtlar elde etmek için GΩ oluşumunu izlemek gerekir. KCC2'nin işlevini ve faaliyetlerini incelemek için bu tekniğin sağlamlığı, GABA aktivitesinin ölçümündeki uygunluğu ve güvenilirliği ile değerlendirildiği gibi çeşitli çalışmalarla doğrulanmıştır. Önceki çalışmalar, GABAA R'lerin(klorür iletkenliğini geçitleyebilen) kendi agonistlerine tepkilerini ölçerek [Cl-]i'nin bu tekniği kullanarak kararlı kaldığını göstermiştir. Sonuç olarak, sürekli elektrik erişimi, hücre içi klorür konsantrasyonu43,44'ün çok az veya hiç modifikasyonu olmadan gelir. Ayrıca, bu teknik, GABA A R aktivasyonu sırasında membran potansiyelindeki veEGABA'daki yapay değişikliklerin atlatılmasını kolaylaştırır (klorür ve bikarbonat iletkenliğini açar)45. Yukarıda belirtilenler, bu tekniğe diğer elektrofizyoloji kayıt türlerinin önünde bir avantaj sağlar. Bununla birlikte, bu tekniğin sınırlamaları aşağıdakileri içerir: (1) elektrotun ucunun membranın bir kısmını işgal etmesi nedeniyle akım çözünürlüğünü azaltabilecek sık sık kayıt gürültüsü oluşabilir ve (2) membranın gramicidin ile delinmesi genellikle nispeten daha uzun sürer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma The Royal Society UK (Hibe no. IEC\NSFC\201094) ve Commonwealth Ph.D. Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
References
- de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
- Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
- Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
- Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
- Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
- Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
- Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
- Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
- Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
- Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
- Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
- AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
- Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
- Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
- Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
- Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
- Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
- Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
- Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
- Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
- Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
- Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
- Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
- Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
- Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
- Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
- Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
- Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
- Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
- Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
- Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
- Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
- Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
- Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
- Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
- Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
- Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
- Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
- Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).
