Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين مع بروتوكول معدل يستخدم لترسيب كبريتيد البزموت (BS). المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها سهلة التقييم ولا تتطلب معدات متخصصة.
Abstract
كبريتيد الهيدروجين (H2S) هو غاز سام تنتجه البكتيريا في التحلل البروتيني للأحماض الأمينية والبروتينات المحتوية على الكبريت والتي تلعب دورا مهما في صحة الإنسان. يعد اختبار إنتاج H2S أحد اختبارات تحديد الهوية الكيميائية الحيوية البكتيرية المهمة. الطرق التقليدية ليست فقط مملة وتستغرق وقتا طويلا ولكنها أيضا عرضة لتثبيط نمو البكتيريا بسبب التأثير السام لأملاح المعادن الثقيلة في الوسط المحتوي على الكبريت ، مما يؤدي غالبا إلى نتائج سلبية. هنا ، أنشأنا طريقة بسيطة وحساسة للكشف عن H2S في البكتيريا. هذه الطريقة هي نسخة معدلة من ترسيب كبريتيد البزموت (BS) الذي يستخدم 96 لوحة معايرة شفافة جيدا. تم دمج الثقافة البكتيرية مع محلول البزموت الذي يحتوي على L-cysteine وزراعته لمدة 20 دقيقة ، وفي النهاية لوحظ راسب أسود. كان حد الكشف البصري ل H 2 S0.2mM. بناء على تغير اللون المرئي ، يمكن تحقيق الكشف البسيط وعالي الإنتاجية والسريع للبكتيريا المنتجة ل H2S. باختصار ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد إنتاج H2S في البكتيريا.
Introduction
يمكن للبكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين استخدام الأحماض الأمينية والبروتينات المحتوية على الكبريت لإنتاج كبريتيد الهيدروجين (H2S). يحدث إنتاج H2S عادة في بكتيريا عائلة Enterobacteriaceae سالبة الجرام وأيضا في أعضاء Citrobacter spp. و Proteus spp. و Edwardsiella spp. و Shewanella spp.1. هذه البكتيريا لديها القدرة على تقليل الكبريتات إلى كبريتيد الهيدروجين (H2S) من أجل الحصول على الطاقة. وقد تورط كبريتيد الهيدروجين في تطوير مقاومة البكتيريا للأدوية. يحمي H 2 S البكتيريا من سمية أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وبالتالي يعادي التأثير المضاد للبكتيرياللمضادات الحيوية 2,3. H2S له أيضا تأثير فسيولوجي مهم في الحفاظ على الاتزان الداخلي. على المستويات فوق الفسيولوجية ، ثبت أن H2S سام للغاية للجسم. في جسم الإنسان ، يلعب H2S دورا آخر كجزيء إشارات غاز يشارك في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية. يمكن ل H2S تنظيم الوظيفة الانقباضية للقلب ويلعب دورا فسيولوجيا مهما في استرخاء الأوعية الدموية ، وتثبيط إعادة تشكيل الأوعية الدموية ، وحماية عضلة القلب 4,5. يلعب H2S أيضا دورا مهما في تنظيم الجهاز العصبي والجهاز الهضمي 6,7. لقد وجد أنه عند تعرضها للمضادات الحيوية المبيدة للجراثيم ، تنتج البكتيريا أنواع الأكسجين التفاعلية القاتلة (ROS) مما يؤدي إلى موت الخلايا8،9،10،11.
كاختبار كيميائي حيوي شائع في دورات المختبرات الميكروبيولوجية ، يعد اختبار كبريتيد الهيدروجين تجربة مهمة في تحديد البكتيريا ، وخاصة بكتيريا عائلة Enterobacteriaceae. في الوقت الحاضر ، يتم إجراء اختبار كبريتيد الهيدروجين عادة على عدد كبير من الأحماض الأمينية المحتوية على الكبريت ووسط أسيتات الرصاص الملقح بالبكتيريا المراد اختبارها. بعد فترة من الحضانة (2-3 أيام) ، يتم الحكم على النتائج من خلال ملاحظة ما إذا كان وسط الاستزراع أو شريط ورق أسيتات الرصاص أسود بسبب إنتاج أسيتات الرصاص11. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق التقليدية ليست مملة وتستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل إنها أيضا عرضة لتثبيط نمو البكتيريا بسبب التأثير السام لأملاح المعادن الثقيلة في الوسط المحتوي على الكبريت ، مما يؤدي غالبا إلى نتائج سلبية. تم إنشاء طريقة قائمة على البزموت للكشف عن H2S12,13. يمكن أن يتفاعل H2S مع البزموت ، مكونا هطول كبريتيد البزموت الأسود. من أجل إجراء إصلاح لهذا الاختبار الكيميائي الحيوي ، يجب إنشاء طريقة بسيطة وسريعة بدون آثار جانبية على نمو البكتيريا. هنا ، أنشأنا طريقة بسيطة للكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين التي تنمو في بيئة في المختبر باستخدام كبريتيد البزموت كركيزة في شكل لوحة عيار ميكرو 96 بئرا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. السلالات البكتيرية
ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام تسع سلالات قياسية ، بما في ذلك السالمونيلا نظيرة التيفية A ، والسالمونيلا نظيرة التيفية B ، و Fusobacterium nucleatum ، والمكورات المعوية البرازية ، والمكورات العنقودية الذهبية ، و Pseudomonas aeruginosa PAO1 ، و Aeromonas hydrophila YJ-1 ، و Proteus vuigaris ، و Klebsiella pneumoniae (الجدول 1). السالمونيلا نظيرة التيفية يمكن أن تنتج A و Fusobacterium nucleatum و Pseudomonas aeruginosa و Proteus vuigaris H2S ، كما هو موضح في الأدبيات السابقة1.
- تحضير الثقافة البكتيرية
- نقل مستعمرة بكتيرية واحدة من السالمونيلا نظيرة التيفية A ، السالمونيلا نظيرة التيفية B ، المكورات المعوية البرازية ، المكورات العنقودية الذهبية ، Pseudomonas aeruginosa PAO1 ، Aeromonas hydrophila YJ-1 ، و Klebsiella pneumoniae من صفيحة أجار لوريا بيرتاني (LB) إلى 100 مل من وسط LB وزراعتها عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة حتى يصبح تركيز البكتيريا حوالي 1 × 109 خلايا / مل (كما هو موضح بواسطة OD600 = 1).
- نقل مستعمرة بكتيرية واحدة من Fusobacterium nucleatum و Proteus vuigaris من ألواح أجار مرق الصويا (TSB) إلى 100 مل من وسط TSB وزراعتها عند 37 درجة مئوية لاهوائيا لمدة 24 ساعة حتى يصبح تركيز البكتيريا حوالي 1 × 109 خلايا / مل (كما هو موضح في OD600 = 1).
2. فحص الكشف H2S
- اختبار إنتاج كبريتيد الهيدروجين
- امزج 100 ميكرولتر من المستنبتة البكتيرية مع 100 ميكرولتر من محلول البزموت المحضر حديثا (الرقم الهيدروجيني 8.0 ؛ 10 مللي مول كلوريد البزموت (III) ، 0.4 M ثلاثي إيثانولامين حمض الهيدروكلوريك ، 20 mM بيريدوكسال 5-فوسفات أحادي الهيدرات ، 20 mM EDTA ، و 40 mM L-cysteine) في 96 بئرا من ألواح العيار الدقيق والمزرعة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لكل سلالة بكتيرية ، قم بإجراء التحليل في ثلاث نسخ.
- بعد 20 دقيقة ، تحقق من تغيير اللون. إذا تغير لون المحلول من الأصفر الفاتح إلى الأسود ، فهذا يشير إلى أن البكتيريا قادرة على إنتاج H2S. كرر هذا القياس 3x.
- حساسية الطريقة
- حدد حساسية الطريقة باستخدام تركيزات مختلفة من هيدرو كبريتيد الصوديوم (NaHS): 2 mM ، 1 mM ، 0.8 mM ، 0.6 mM ، 0.4 mM ، 0.2 mM ، 0.1 mM ، و 0 mM ، ممزوجة بمحلول BS 14.
- أوجد وجود HS−/S2− من خلال ملاحظة تكوين راسب BS أسود. سجل لون الآبار باستخدام مقياس مرئي من عدم إنتاج اللون (-) إلى إنتاج اللون الأسود الداكن (++++++).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين
تم التحقيق في أداء اختبار H2 S باستخدام مزارع نقية من سلالات بكتيرية مختارة ، كما هو موضح في الجدول 1. أشارت النتائج إلى أن السالمونيلا نظيرة التيفية B ، و Fusobacterium nucleatum ، والمكورات المعوية البرازية ، و Pseudomonas aeruginosa ، و Proteus vuigaris يمكن أنتنتج H2 S مع راسب BS الأسود ، في حين أن السالمونيلا نظيرة التيفية A ، والمكورات العنقودية الذهبية ، و Aeromonas hydrophila ، و Klebsiella pneumoniae فشلت في إظهار أي راسب أسود. شوهد أسرع إنتاج H2S ل Fusobacterium nucleatum ، حيث وصل إلى أقصى إنتاج للألوان (الشكل 1).
حساسية الطريقة
تم تحديد الحساسية عن طريق خلط تركيزات مختلفة من هيدرو كبريتيد الصوديوم (NaHS) مع محلول BS. كشف الفحص البصري أن عمق لون المحلول تعمق مع زيادة تركيز الأيونات من HS− / S 2− (الشكل 2). حد الكشف عن H 2 S للطريقة هو0.2مللي مول.
الشكل 1: الكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين. تم الكشف عن إنتاج H2S في Fusobacterium nucleatum بواسطة تكوين راسب BS الأسود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حساسية طريقة كبريتيد البزموت (BS). تم تسجيل حساسية طريقة BS للكشف عن H2S على أنها لا تنتج اللون (-) إلى أغمق إنتاج للون الأسود (+++++). من اليسار إلى اليمين ، تركيزات NaHS هي 2 mM و 1 mM و 0.8 mM و 0.6 mM و 0.4 mM و 0.2 mM و 0.1 mM و 0 mM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| جنس | إنتاج H2S أ | |
| السالمونيلا نظيرة التيفية A | _ | |
| السالمونيلا نظيرة التيفية B | +++ | |
| فيوسوباكتريوم نيوكلياتوم | ++++ | |
| المكورات المعوية البرازية | + | |
| المكورات العنقودية الذهبية | _ | |
| الزائفة الزنجارية | ++ | |
| ايروموناس هيدروفيلا | _ | |
| بروتيوس فويجاريس | + | |
| الكلبسيلة الرئوية | _ | |
الجدول 1: التقييم البصري لإنتاج H2S. تم قياس إنتاج كبريتيد الهيدروجين (H2S) بواسطة سلالات بكتيرية مختلفة باستخدام الطريقة البصرية في لوحة عيار ميكرو 96 بئرا. أ: مسجل كبريتيد البزموت الأسود (BS) هطول الأمطار من عدم إنتاج اللون (-) إلى إنتاج اللون الأسود (+).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اختبار إنتاج كبريتيد الهيدروجين هو أحد اختبارات النمط الظاهري التقليدية لتحديد وتمايز السلالات البكتيرية. يمكن للعديد من الأنواع البكتيرية إنتاج كبريتيد الهيدروجين في بيئتها الطبيعية ، مثل المياه المائية. تشمل هذه الأنواع البكتيرية السالمونيلا sp. ، Citrobacter sp. ، Proteus sp. ، Pseudomonas sp. ، بعض سلالات Klebsiella sp. ، الإشريكية القولونية ، وبعض أنواع Clostridia اللاهوائية15،16. ومع ذلك ، فإن حساسية طريقة اختبار H2S التقليدية منخفضة ، وتستغرق الطريقةوقتا طويلا 17,18. يحتوي وسيط اختبار H2 S التقليدي على PbAc ، والذي له تأثيرات سامة على نمو البكتيريا ، ويتم تلقيح الثقافة في أجار شبه صلب. محتوى الأكسجين في الجزء السفلي من الوسط منخفض ، لذلك تنمو البكتيريا الهوائية بشكل سيء. لذلك ، غالبا ما يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة.
في هذه الطريقة، استخدمنا البزموت (III) بدلا من الرصاص أو الأيونات الحديدية. عندما تتعرض عزلة بكتيرية تنتج H2S لكلوريد البزموت (III) ، يحدث تفاعل استبدال. في هذا التفاعل ، مواضع التبادل الأيوني لأيون الكلوريد والكبريتيد ، مما ينتج حمض كلوريك الهيدروجين وكبريتيد البزموت (III) ؛ يترسب ناتج كبريتيد البزموت الثلاثي هذا من المحلول في صورة مادة صلبة سوداء. يمكن استخدام عمق لون الراسب الأسود إلى حد ما لتحديد كمية H2S التي تنتجها السلالة البكتيرية. استنادا إلى ترسيب BS وقابلية التكاثر العالية والموثوقية والبساطة ، تم إنشاء الطريقة الموضحة في الدراسة كاختبار كبريتيد الهيدروجين للكشف عن البكتيريا المنتجة ل H2S. الخطوة الحاسمة لهذه الطريقة هي أنه يجب تحضير محلول البزموت طازجا. بالمقارنة مع الطريقة التقليدية ، لا توجد سمية ملح المعادن الثقيلة في نمو البكتيريا ، ويمكن أن توفر أيضا الوقت للكشف عن كبريتيد الهيدروجين الذي ينتج البكتيريا الهوائية.
في هذا البحث ، استنادا إلى تفاعل كلوريد البزموت (III) و H 2 S ،الذي أنتج ترسيب BS المرئي ، يتم عرض طريقة بسيطة وحساسة وغير مكلفة وعالية الإنتاجية للكشف عن البكتيريا المنتجة ل H2S. هذه الطريقة مفيدة للكشف السريع عن العينات الملوثة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD) ومشروع أبحاث إصلاح التدريس بجامعة الصين الصيدلانية (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
