Summary
Her præsenterer vi en protokol til påvisning af hydrogensulfidproducerende bakterier med en modificeret protokol, der anvendes til udfældning af bismutsulfid (BS). De vigtigste fordele ved denne metode er, at den er let at evaluere og ikke kræver specialudstyr.
Abstract
Hydrogensulfid (H2S) er en giftig gas produceret af bakterier i proteolyse af svovlholdige aminosyrer og proteiner, der spiller en vigtig rolle i menneskers sundhed. H2S-produktionstesten er en af de vigtige bakterielle biokemiske identifikationstest. De traditionelle metoder er ikke kun kedelige og tidskrævende, men også tilbøjelige til at hæmme bakterievækst på grund af den toksiske virkning af tungmetalsalte i svovlholdigt medium, hvilket ofte fører til negative resultater. Her etablerede vi en enkel og følsom metode til at detektere H2S i bakterier. Denne metode er en modificeret version af bismutsulfid (BS) udfældning, der bruger 96-brønds gennemsigtige mikrotiterplader. Bakteriekultur blev kombineret med vismutopløsning indeholdende L-cystein og dyrket i 20 min, hvorefter der blev observeret et sort bundfald. Den visuelle detektionsgrænse for H 2 S var0,2mM. Baseret på den visuelle farveændring kan den enkle, høje gennemstrømning og hurtige detektion afH2S-producerendebakterier opnås. Sammenfattende kan denne metode bruges til at identificereH2S-produktioni bakterier.
Introduction
Hydrogensulfidproducerende bakterier kan udnytte svovlholdige aminosyrer og proteiner til at producere hydrogensulfid (H2S). Produktionen afH2Sforekommer sædvanligvis i gramnegative Enterobacteriaceae-familiebakterier og også hos medlemmer af Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. og Shewanella spp.1. Disse bakterier har evnen til at reducere sulfat til hydrogensulfid (H2S) for at opnå energi. Hydrogensulfid har været impliceret i udviklingen af bakteriel lægemiddelresistens. H2Sbeskytter bakterier mod toksiciteten af reaktive oxygenarter (ROS) og modvirker således den antibakterielle virkning af antibiotika 2,3. H2Shar også en vigtig fysiologisk virkning ved opretholdelse af homeostase. På suprafysiologiske niveauer har H2S vist sig at være dybt giftigt for kroppen. I menneskekroppen harH2Sen anden rolle som et gassignalmolekyle, der er involveret i en række fysiologiske og patologiske processer. H2Skan regulere hjertets systoliske funktion og spiller en vigtig fysiologisk rolle i afslapning af blodkar, hæmning af vaskulær ombygning og beskyttelse af myokardiet 4,5. H2S spiller også en vigtig rolle i reguleringen af nervesystemet og fordøjelseskanalen 6,7. Det har vist sig, at bakterier, når de udsættes for bakteriedræbende antibiotika, producerer dødelige reaktive iltarter (ROS), der fører til celledød 8,9,10,11.
Som en almindelig biokemisk test i mikrobiologiske laboratoriekurser er hydrogensulfidtesten et vigtigt eksperiment til identifikation af bakterier, især bakterier af familien Enterobacteriaceae. På nuværende tidspunkt udføres hydrogensulfidtesten sædvanligvis på et stort antal svovlholdige aminosyrer og blyacetatmedium inokuleret med de bakterier, der skal testes. Efter en inkubationsperiode (2-3 dage) bedømmes resultaterne ved at observere, om dyrkningsmediet eller blyacetatpapirstrimlen er sorte på grund af blyacetatproduktion11. Disse traditionelle metoder er imidlertid ikke kun kedelige og tidskrævende, men også tilbøjelige til at hæmme bakterievækst på grund af den toksiske virkning af tungmetalsalte i svovlholdigt medium, hvilket ofte fører til negative resultater. Der er fastlagt en bismuth-baseret metode til påvisning af H2S12,13. H2Skan reagere med vismut og danne sort bismutsulfidudfældning. For at gennemføre en reform af denne biokemiske test skal der etableres en enkel og hurtig metode uden bivirkninger på bakterievækst. Her opsatte vi en simpel metode til påvisning af hydrogensulfidproducerende bakterier dyrket i et in vitro-miljø ved hjælp af vismuthsulfid som substrat i et 96-brønds mikrotiterpladeformat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriestammer
BEMÆRK: Til dette eksperiment blev ni standardstammer anvendt, herunder Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris og Klebsiella pneumoniae (tabel 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa, og Proteus vuigaris kan producere H2S, som skitseret i tidligere litteratur1.
- Fremstilling af bakteriekultur
- Overfør en bakteriekoloni af Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 og Klebsiella pneumoniae fra en Luria-Bertani (LB) agarplade til 100 ml LB-medium og kultur ved 37 °C i 12-16 timer, indtil bakteriekoncentrationen er ca. 1 x 109 celler/ml (som angivet ved OD600 = 1).
- En bakteriekoloni af Fusobacterium-nukleatum og Proteus vuigaris overføres fra trypticase sojabouillon (TSB) agarplader til 100 ml TSB-medium og dyrkning ved 37 °C anaerobt i 24 timer, indtil bakteriekoncentrationen er ca. 1 x 109 celler/ml (som angivet med OD600 = 1).
2. H2S detektionsanalyse
- Test af produktion af hydrogensulfid
- 100 μL bakteriekultur blandes med 100 μL nyfremstillet vismutopløsning (pH 8,0; 10 mM vismuth(III)chlorid, 0,4 M triethanolamin-HCl, 20 mM pyridoxal 5-phosphatmonohydrat, 20 mM EDTA og 40 mM L-cystein) i mikrotiterpladerne med 96 brønde og dyrkes i 20 minutter ved 37 °C. For hver bakteriestamme udføres analysen i tre eksemplarer.
- Efter 20 minutter skal du kontrollere, om der er farveændring. Hvis opløsningens farve ændres fra lysegul til sort, indikerer dette, at bakterierne er i stand til at producereH2S. Gentag denne måling 3x.
- Metodens følsomhed
- Bestem følsomheden af metoden ved anvendelse af forskellige koncentrationer af natriumhydrosulfid (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM og 0 mM, blandet med BS-opløsning 14.
- Bestem tilstedeværelsen af HS−/S2− ved at observere dannelsen af et sort BS-bundfald. Bedøm farven på brøndene ved hjælp af en visuel skala fra ingen farveproduktion (-) til mørkeste sorte farveproduktion (++++++).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Påvisning af hydrogensulfidproducerende bakterier
Udførelsen afH2S-testenblev undersøgt ved hjælp af rene kulturer af udvalgte bakteriestammer, som anført i tabel 1. Resultaterne viste, at Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa og Proteus vuigaris kan producereH2Smed sort BS-bundfald, mens Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila og Klebsiella pneumoniae ikke viste noget sort bundfald. Den hurtigsteH2S-produktionblev set for Fusobacterium-nukleatum og nåede maksimal farveproduktion (figur 1).
Metodens følsomhed
Følsomheden blev bestemt ved at blande forskellige koncentrationer af natriumhydrosulfid (NaHS) med BS-opløsning. Visuel inspektion afslørede, at opløsningens farvedybde blev dybere med en stigende ionkoncentration af HS−/S 2− (figur 2). Detektionsgrænsen for H 2 S for metoden er0,2mM.
Figur 1: Påvisning af hydrogensulfidproducerende bakterier. Produktionen afH2Si Fusobacterium-nukleatum blev påvist ved dannelsen af det sorte BS-bundfald . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Følsomhed af bismutsulfid (BS) metoden. BS-metodens følsomhed til påvisning afH2Sblev registreret som ingen farveproduktion (-) over for den mørkeste sorte farveproduktion (+++++). Fra venstre mod højre er NaHS-koncentrationerne 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM og 0 mM. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Art | H2S produktion a | |
| Salmonella paratyphi En | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Staphylococcus aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hydrophila | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Tabel 1: Visuel vurdering afH2S-produktionen. Produktionen af hydrogensulfid (H2S) af forskellige bakteriestammer blev målt ved hjælp af den visuelle metode i en 96-brønds mikrotiterplade. a: Registreres som sort bismutsulfid (BS) udfældning fra ingen farveproduktion (-) til sort farveproduktion (+).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydrogensulfidproduktionstesten er en af de konventionelle fænotypiske tests til identifikation og differentiering af bakteriestammer. Mange bakteriearter kan producere hydrogensulfid i deres naturlige miljø, såsom vandvand. Disse bakteriearter omfatter Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., nogle stammer af Klebsiella sp., Escherichia coli og nogle arter af anaerob Clostridia15,16. Følsomheden af den traditionelle H2S testmetode er imidlertid lav, og metoden er tidskrævende17,18. Det traditionelleH2S-testmediumindeholder PbAc, som har toksiske virkninger på bakterievæksten, og kulturen punkteres til halvfast agar. Iltindholdet i den nederste del af mediet er lavt, så de aerobe bakterier vokser dårligt. Derfor fører det ofte til falsk-negative resultater.
I denne metode brugte vi vismut (III) i stedet for bly eller jernholdige ioner. Når et bakterieisolat, der producererH2S, udsættes for vismut(III)chlorid, finder en substitutionsreaktion sted. I denne reaktion er chloridion- og sulfidiolionbytningspositionerne, der producerer hydrogenchlorsyre og vismut(III)sulfid; dette vismut (III) sulfidprodukt udfældes ud af opløsningen som et sort fast stof. Farvedybden af det sorte bundfald kan til en vis grad anvendes til at bestemme mængden afH2Sproduceret af bakteriestammen. Baseret på BS-udfældningen og den høje reproducerbarhed, pålidelighed og enkelhed blev metoden vist i undersøgelsen etableret som en hydrogensulfidtest til påvisning afH2S-producerendebakterier . Det kritiske trin i denne metode er, at vismutopløsningen skal fremstilles frisk. Sammenlignet med den traditionelle metode er der ingen tungmetalsalttoksicitet i væksten af bakterier, og det kan også spare tid til påvisning af hydrogensulfidproducerende aerobe bakterier.
I dette papir, baseret på reaktionen af vismut (III) chlorid og H2S, som producerede visuelsort BS-udfældning, vises en enkel, følsom, billig og høj gennemstrømningsmetode til påvisning afH2S-producerendebakterier. Denne metode er nyttig til hurtig påvisning af kontaminerede prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) og Teaching Reform Research Project of China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
