Summary
在这里，我们提出了一种检测产生硫化氢的细菌的方案，其中包含用于硫化铋（BS）沉淀的改进方案。这种方法的主要优点是易于评估并且不需要专门的设备。
Abstract
硫化氢（H2S）是细菌在含硫氨基酸和蛋白质的蛋白水解过程中产生的有毒气体，对人体健康起着重要作用。H2S生产测试是重要的细菌生化鉴定测试之一。传统方法不仅繁琐耗时，而且由于含硫介质中重金属盐的毒性作用，容易抑制细菌生长，往往导致阴性结果。在这里，我们建立了一种简单灵敏的方法来检测细菌中的H2S。该方法是硫化铋（BS）沉淀的改进版本，使用96孔透明微量滴定板。将细菌培养物与含有L-半胱氨酸的铋溶液合并培养20分钟，最后观察到黑色沉淀。H 2 S的视觉检测限为0.2mM。基于视觉颜色变化，可实现产生H2S的细菌的简单，高通量和快速检测。总之，该方法可用于鉴定细菌中H2S的产生。
Introduction
产生硫化氢的细菌可以利用含硫氨基酸和蛋白质来产生硫化氢（H2S）。H2S 的产生通常发生在革兰氏阴性肠杆菌科细菌中，也发生在柠檬酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华氏菌属和希瓦氏菌属 1 的成员中。这些细菌有能力将硫酸盐还原成硫化氢（H2S）以获得能量。硫化氢与细菌耐药性的发展有关。H2S保护细菌免受活性氧（ROS）的毒性，从而拮抗抗生素的抗菌作用2，3。H2S在维持体内平衡方面也具有重要的生理作用。在超生理水平上，H2S已被证明对身体有深刻的毒性。在人体内，H2S作为气体信号分子具有另一个作用，参与各种生理和病理过程。H2S能调节心脏的收缩功能，在松弛血管、抑制血管重塑、保护心肌方面起重要的生理作用4，5。H2S在调节神经系统和消化道方面也起着重要作用6，7。已经发现，当暴露于杀菌抗生素时，细菌会产生致命的活性氧（ROS），导致细胞死亡8，9，10，11。
硫化氢试验作为微生物实验室课程中常见的生化检验，是鉴定细菌，特别是肠杆菌科细菌的重要实验。目前，硫化氢试验通常是在大量接种待测细菌的含硫氨基酸和醋酸铅培养基上进行的。孵育一段时间后（2-3天），通过观察培养基或醋酸铅纸条是否因醋酸铅产生而变黑来判断结果11。然而，这些传统方法不仅繁琐耗时，而且由于含硫介质中重金属盐的毒性作用，容易抑制细菌生长，往往导致阴性结果。已经建立了一种基于铋的方法用于检测H2S12，13。H2S能与铋反应，形成黑色硫化铋沉淀。为了对这种生化测试进行改革，需要建立一种对细菌生长没有副作用的简单快速的方法。在这里，我们建立了一种简单的方法来检测在 体外 环境中生长的产生硫化氢的细菌，使用硫化铋作为96孔微量滴定板格式的底物。
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Protocol
1. 细菌菌株
注意：对于本实验，使用了九种标准菌株，包括副伤寒沙门氏菌A，副伤寒沙门氏菌B，核梭杆菌，粪肠球菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌PAO1，嗜水气单胞菌YJ-1，变形杆菌和肺炎克雷伯菌（表1）。副伤寒沙门氏菌A、核梭杆菌、铜绿假单胞菌和变形杆菌可产生 H2S，如以前的文献1 所述。
- 细菌培养物的制备
- 将副伤寒沙门氏菌 A、副伤寒沙门氏菌 B、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 PAO1、嗜水气单胞菌 YJ-1 和肺炎克雷伯菌的一个细菌菌落从 Luria-Bertani （LB） 琼脂平板转移到 100 mL LB 培养基中，并在 37 °C 下培养 12-16 小时，直到细菌浓度约为 1 x 109 个细胞/mL（如 OD600 = 1 所示）。
- 将梭杆菌核和变形杆菌的一个细菌菌落从胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）琼脂平板转移到100mL的TSB培养基中，并在37°C厌氧培养24小时，直到细菌浓度约为1 x 109个细胞/ mL（如OD600 = 1所示）。
2. H2S检测试验
- 硫化氢生产试验
- 将 100 μL 细菌培养物与 100 μL 新制备的铋溶液（pH 8.0;10 mM 氯化铋 （III）、0.4 M 三乙醇胺-HCl、20 mM 吡哆醛 5-磷酸一水合物、20 mM EDTA 和 40 mM L-半胱氨酸）在 96 孔微量滴定板中混合，并在 37 °C 下培养 20 分钟。 对于每种细菌菌株，一式三份进行分析。
- 20分钟后，检查颜色变化。如果溶液的颜色从浅黄色变为黑色，则表明细菌能够产生H2S.重复此测量3次。
- 方法的灵敏度
- 使用不同浓度的硫化氢钠（NaHS）确定方法的灵敏度：2 mM，1 mM，0.8 mM，0.6 mM，0.4 mM，0.2 mM，0.1 mM和0 mM，与BS溶液 混合14。
- 通过观察黑色BS沉淀物的形成来确定HS−/S2− 的存在。使用从无颜色产生 （-） 到最深的黑色生成 （++++++） 的视觉量表对孔的颜色进行评分。
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Representative Results
检测产生硫化氢的细菌
使用所选细菌菌株的纯培养物研究H2S测试的性能，如表1所示。结果表明，副伤寒沙门氏菌B、核梭杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌和武氏变形杆菌均能产生黑色BS沉淀的H2S，而副伤寒沙门氏菌A、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和肺炎克雷伯菌未显示任何黑色沉淀。核梭杆菌的H2S产生速度最快，达到最大颜色产生（图1）。
方法的灵敏度
通过将不同浓度的硫化氢钠（NaHS）与BS溶液混合来确定灵敏度。目视检查显示，溶液的颜色深度随着HS−/S2− 离子浓度的增加而加深（图2）。该方法的H 2 S检测限为0.2mM。
图1：产生硫化氢的细菌的检测。 通过黑色BS沉淀形成检测核梭杆菌中H2S的产生。请点击此处查看此图的大图。
图 2：硫化铋 （BS） 方法的灵敏度。 BS法检测H2S的灵敏度记录为无颜色产生（-）到最深的黑色产生（+++++）。从左到右，NaHS浓度为2 mM，1 mM，0.8 mM，0.6 mM，0.4 mM，0.2 mM，0.1 mM和0 mM。 请点击此处查看此图的大图。
| 物种 | H2S 生产 a | |
| 副伤寒沙门氏菌 一个 | _ | |
| 副伤寒沙门氏菌 B | +++ | |
| 核梭杆菌 | ++++ | |
| 粪肠球菌 | + | |
| 金黄色葡萄球菌 | _ | |
| 铜绿假单胞菌 | ++ | |
| 嗜水气单胞菌 | _ | |
| 变形杆菌 | + | |
| 肺炎克雷伯菌 | _ | |
表1：H2S生产的目视评估。 使用目视方法在96孔微量滴定板中测量不同细菌菌株产生的硫化氢（H2S）。a：记录为黑色硫化铋（BS）从无颜色产生（-）到黑色产生（+）的沉淀。
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Discussion
硫化氢生产试验是鉴定和分化细菌菌株的常规表型试验之一。许多细菌物种可以在其自然环境中产生硫化氢，例如水生水。这些细菌种类包括 沙门氏 菌属、 柠檬酸 杆菌属、 变形杆菌 属、 假单胞菌属、一些克 雷伯氏 菌属、 大肠杆菌和一些厌氧梭菌15，16。但传统H2S测试方法灵敏度低，耗时17，18。传统的H2S测试培养基含有PbAc，对细菌的生长具有毒性作用，并将培养物穿刺接种到半固体琼脂中。培养基下部的含氧量低，因此需氧菌生长不良。因此，它通常会导致假阴性结果。
在这种方法中，我们使用铋（III）代替铅或亚铁离子。当产生H2S的细菌分离物暴露于氯化铋（III）时，会发生取代反应。在该反应中，氯离子与硫化物离子交换位置，生成氢氯酸和硫化铋（III）;这种硫化铋（III）产物以黑色固体的形式从溶液中沉淀出来。黑色沉淀物的颜色深度可以在一定程度上确定细菌菌株产生的H2S的数量。基于BS沉淀和高重现性，可靠性和简单性，该研究中显示的方法被建立为用于检测产生H2S的细菌的硫化氢测试。该方法的关键步骤是应新鲜制备铋溶液。与传统方法相比，细菌生长中没有重金属盐毒性，还可以节省检测产生硫化氢的需氧细菌的时间。
本文基于氯化铋（III）与H 2 S反应生成肉黑BS沉淀，展示了一种简单、灵敏、廉价、高通量的H2S产菌检测方法。该方法可用于快速检测受污染的样品。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了江苏省高等学校优先学术项目开发（PAPD）和中国药科大学教学改革研究项目（2019XJYB18）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
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