Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل الالتهام الذاتي الناجم عن الجوع في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64282
Automatic Translation
1, 1
1Ministry of Education Key Laboratory of Biosystems Homeostasis and Protection and Innovation Center for Cell Signaling Network, Life Sciences Institute, Zhejiang University

Summary

يصف هذا البروتوكول تحريض الالتهام الذاتي في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة عن طريق استنفاد المغذيات ويحلل التغيرات في الالتهام الذاتي باستخدام سلالات الذباب المعدلة وراثيا.

Abstract

الالتهام الذاتي هو عملية الهضم الذاتي الخلوية. يسلم البضائع إلى الجسيمات الحالة للتحلل استجابة للضغوط المختلفة ، بما في ذلك الجوع. يرتبط خلل الالتهام الذاتي بالشيخوخة والأمراض البشرية المتعددة. يتم الحفاظ على آلية الالتهام الذاتي بشكل كبير - من الخميرة إلى البشر. يوفر الجسم الدهني اليرقي لذبابة الفاكهة ، وهو نظير للكبد الفقاري والأنسجة الدهنية ، نموذجا فريدا لمراقبة الالتهام الذاتي في الجسم الحي. يمكن أن يحدث الالتهام الذاتي بسهولة عن طريق تجويع المغذيات في جسم الدهون اليرقية. يتم حفظ معظم الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي في ذبابة الفاكهة. تم تطوير العديد من سلالات الذباب المعدلة وراثيا التي تعبر عن علامات الالتهام الذاتي الموسومة ، مما يسهل مراقبة الخطوات المختلفة في عملية الالتهام الذاتي. يتيح التحليل النسيلي مقارنة وثيقة لعلامات الالتهام الذاتي في الخلايا ذات الأنماط الجينية المختلفة في نفس قطعة الأنسجة. يفصل البروتوكول الحالي إجراءات (1) توليد استنساخ جسدي في جسم الدهون اليرقية ، (2) تحفيز الالتهام الذاتي عن طريق تجويع الأحماض الأمينية ، و (3) تشريح جسم الدهون اليرقية ، بهدف إنشاء نموذج لتحليل الاختلافات في الالتهام الذاتي باستخدام علامة البلعمة الذاتية (GFP-Atg8a) والتحليل النسيلي.

Introduction

الالتهام الذاتي هو عملية "الأكل الذاتي" التي تسببها ضغوط مختلفة ، بما في ذلك تجويع الأحماض الأمينية1. الالتهام الذاتي الكبير (المشار إليه فيما يلي باسم الالتهام الذاتي) هو أكثر أنواع الالتهام الذاتي المدروسة جيدا ويلعب دورا لا غنى عنه في الحفاظ على التوازن الخلوي2. يرتبط خلل الالتهام الذاتي بالعديد من الأمراض البشرية3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي هي أهداف محتملة لعلاج الأمراض المختلفة4.

يتم تنظيم الالتهام الذاتي بطريقة متطورة للغاية5. عند الجوع ، تقوم أغشية العزل بعزل المواد السيتوبلازمية لتشكيل البلعمة الذاتية مزدوجة الغشاء6. ثم تندمج البلعمة الذاتية مع الإندوسومات والليزوزومات لتكوين البرمائيات والليزوزومات. بمساعدة الإنزيمات المائية الليزوزومية ، تتحلل محتويات السيتوبلازم المبتلع ، ويتم إعادة تدوير العناصر الغذائية7.

الالتهام الذاتي هو عملية محفوظة تطوريا8. ذبابة الفاكهة الميلانية هي نموذج رائع لدراسة عملية الالتهام الذاتي في الجسم الحي. يؤدي تجويع الأحماض الأمينية بسهولة إلى الالتهام الذاتي في أنسجة الجسم الدهنية الذبابة ، وهو نظير للكبد البشري والأنسجة الدهنية9. تؤدي العيوب في الالتهام الذاتي إلى تعطيل أنماط النقاط المميزة للعديد من البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي ، مثل Atg8 و Atg9 و Atg18 و Syx17 و Rab7 و LAMP1 و p62 ، من بين أمور أخرى10. لذلك ، فإن تحليل أنماط علامات الالتهام الذاتي هذه سيساعد في تمييز حدوث عيوب الالتهام الذاتي وخطوة الالتهام الذاتي المعيبة. على سبيل المثال ، البروتين الشبيه باليوبيكويتين Atg8 هو علامة الالتهام الذاتي الأكثر استخداما11. في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، تم تطوير سلالات معدلة وراثيا مع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم Atg8a بنجاح12. ينتشر GFP-Atg8a في السيتوسول والنوى في الخلايا المغذية. عند الجوع ، تتم معالجة GFP-Atg8a وتعديلها بواسطة فوسفاتيديل إيثانولامين (PE) وتشكل نقطة ، والتي تسمي أغشية العزل والبلعمة الذاتية المطورةبالكامل 13,14. من خلال الفحص المجهري الفلوري المباشر ، يمكن ملاحظة تحريض الالتهام الذاتي بسهولة كزيادة في تكوين النقاط GFP-Atg815. لن تتشكل Atg8a puncta استجابة للمجاعة في وجود عيب في بدء الالتهام الذاتي. نظرا لأنه يمكن إخماد GFP-Atg8a وهضمه بواسطة انخفاض درجة الحموضة في الجسيمات الذاتية ، فقد تزداد أرقام GFP-Atg8a puncta إذا تم حظر الالتهام الذاتي في المراحلالمتأخرة 16.

نظرا لأن الالتهام الذاتي حساس للغاية لتوافر التغذية17 ، فإن الاختلافات الطفيفة في ظروف الثقافة غالبا ما تؤدي إلى اختلافات في الأنماط الظاهرية. لذلك ، فإن التحليل النسيلي ، وهو طريقة تحلل الخلايا الطافرة مقابل خلايا التحكم من النوع البري في نفس النسيج ، له ميزة كبيرة في تشريح عيوب الالتهام الذاتي18. من خلال الاستفادة من هدف التعرف على flippase / flippase (FLP / FRT) بوساطة إعادة التركيب الخاصة بالموقع بين الكروموسومات المتماثلة ، يتم تصنيع الذباب الذي يحمل أنسجة الفسيفساء بسهولة19,20. تشكل الخلايا البرية المحيطة بالخلايا الطافرة تحكما داخليا مثاليا لتجنب الاختلافات الفردية21.

تصف الدراسة الحالية كيفية تحفيز الالتهام الذاتي عن طريق تجويع الأحماض الأمينية وتوليد أنسجة الجسم الدهنية الفسيفسائية التي تعبر عن GFP-Atg8a. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتحليل الاختلافات في الالتهام الذاتي بين الحيوانات المستنسخة الطافرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عبور ذبابة الفاكهة ووضع البيض

  1. إدخال 3 ذكور (النمط الجيني hsFLP ubiRFP FRT19A ؛ cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) و 15 أنثى (النمط الجيني y 'w * Mu FRT19A / FM7 ، Kr GFP ) ذباب بالغ (انظر جدول المواد) في قنينة استزراع (مع دقيق الذرة القياسي / دبس السكر / أجار ذبابة الفاكهة الوسطى عند 25 درجة مئوية) للتزاوج.
    ملاحظة: يجب إعداد قوارير استزراع متعددة من نفس التهجين لضمان وجود يرقات كافية لمزيد من التجارب. سلالة الذبابة الذكور مع النمط الجيني hsFLP ubiRFP FRT19A ؛ cgGal4 UAS-GFP-Atg8a يحمل موقع FRT في كروموسوم X بالقرب من السنترومير (FRT19A). كما أنه يعبر عن FLP عند صدمة الحرارة عند 37 درجة مئوية. يتم إدخال جين محوري مع تعبير RFP في كل مكان على الكروموسوم X. يتم التعبير عن GFP-Atg8a تحت سيطرة cgGal4 في جسم الدهون اليرقية22. سلالة الذبابة الأنثوية مع النمط الجيني y 'w * Mu FRT19A / FM7 ، Kr GFP تحمل طفرة قاتلة (Mu) و FRT19A على كروموسوم X. يظهر مخطط العبور التفصيلي في الشكل 1.
  2. لوضع البيض ، نقل الذباب إلى قارورة ثقافة جديدة. في 48 ساعة بعد المقدمة ، اضغط على قارورة "التزاوج" حتى يذهل الذباب وينزل على الوسائط في قاعدة القارورة.
    1. افصل قارورة "التزاوج" وقم بتغطية فمها بقارورة مقلوبة غير موصولة بوسائط جديدة (قارورة ثقافة جديدة). بعد ذلك ، انقل الذباب إلى قارورة الثقافة الطازجة عن طريق قلب القوارير والنقر عليها.
    2. قم بتوصيل قارورة الثقافة الطازجة (مع الذباب المنقول) وتخلص من قارورة الثقافة القديمة. ضع قارورة الاستزراع الطازجة هذه في حاضنة 25 درجة مئوية لوضع البيض على الوسائط الطازجة.
      ملاحظة: التسخين المسبق لقوارير الاستزراع الطازجة إلى 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل عملية نقل الذباب سيساعد الذباب على التكيف مع البيئة الجديدة بسرعة وتسريع وضع البيض.
  3. إزالة الذباب بعد 6 ساعات من وضع البيض. إذا كانت هناك حاجة إلى تكرار التجارب ، فقم بنقل هذه الذباب إلى قارورة استزراع أخرى (كما هو موضح في الخطوة 1.2). خلاف ذلك ، تخلص من الذباب عن طريق إلقائه في قارورة تحتوي على 75 ٪ من الإيثانول).
    1. احتضان القارورة مع الأجنة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للحث على شفط FLP. بعد ذلك ، ضعها في حاضنة 25 درجة مئوية واسمح للأجنة بالاستمرار في النمو.
      ملاحظة: يمكن تأكيد التكوين الناجح للمستنسخات الطافرة لاحقا من خلال التصوير. يشير غياب إشارات RFP إلى الحيوانات المستنسخة المتحولة.

2. تجويع الأحماض الأمينية يحفز الالتهام الذاتي

  1. باستخدام ملعقة مختبرية ، استخرج الوسائط التي تحتوي على اليرقات النامية في طبق بتري بعد 75 ساعة من وضع البيض. أضف 3 مل من 1x PBS إلى الطبق وافصل برفق وسائط الاستزراع واليرقات باستخدام ملقط طويل. حدد 10 إلى 15 يرقة ثالثة مبكرة.
    ملاحظة: يجب اختيار اليرقات الثالثة المبكرة بعناية. مرحلة تطور اليرقات أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول. نظرا لتقييد مدة وضع البيض ، من المتوقع أن تكون معظم اليرقات في قارورة الاستزراع في المرحلة الثالثة المبكرة بحلول 75 ساعة من الحضانة. ومع ذلك ، قد تؤدي وصفات وسائط الاستزراع المختلفة إلى اختلافات في توقيت نمو اليرقات. معايير التمييز بين اليرقات الثالثة المبكرة هي طول الجسم ، ووجود spiracles الأمامي والخلفي ، وكذلك خطافات الفك السفلي لجهاز الفم23.
  2. املأ آبار لوحة بقعة منخفضة زجاجية ذات 9 آبار (انظر جدول المواد) ب 1x PBS. ضع اليرقات الثالثة المنفصلة في الآبار باستخدام ملقط طويل واغسل اليرقات جيدا لإزالة جميع بقايا الوسائط.
  3. خذ 5 مل من محلول السكروز 20٪ (في 1x PBS) في قنينة فارغة وضع اليرقات الثالثة النظيفة في هذا المحلول باستخدام ملقط طويل. احتضان هذه القارورة في حاضنة 25 درجة مئوية لمدة 6 ساعات قبل حصادها للتشريح.
    ملاحظة: يعمل محلول السكروز 20٪ (في 1x PBS) كوسط تجويع يعاني من نقص الأحماض الأمينية.

3. تشريح اليرقات الداخلية الثالثة ومعالجة عينات الأنسجة

  1. شحذ زوجين من ملقط # 5 (انظر جدول المواد) بالتساوي على كلا الجانبين بحجر شحذ.
  2. أضف 400 ميكرولتر من 1x PBS في كل بئر من لوحة بقعة الاكتئاب الزجاجية ذات 9 آبار وانقل اليرقات إلى الآبار باستخدام ملقط طويل. ضع يرقة واحدة في بئر مع توجيه الجانب الظهري (الجانب مع القصبة الهوائية) لأعلى.
    1. امسك بشرة اليرقة بملقطين # 5 في منتصف جذع اليرقات وافتح البشرة برفق. ستظل الأجسام الدهنية المكشوفة ، إلى جانب الأنسجة الداخلية لليرقات الأخرى ، متصلة بجثة اليرقة. سحب ما يكفي لفضح الأعضاء الداخلية قدر الإمكان. كرر هذه الخطوة لجميع اليرقات.
      ملاحظة: تحتوي كل يرقة على قطعتين كبيرتين من الجسم الدهني على طول جذع الجسم. أنسجة الجسم الدهنية عبارة عن طبقة أحادية بيضاء وغير شفافة ومسطحة يمكن تمييزها بسهولة تحت مجهر التشريح24.
  3. نقل جثة اليرقات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). احتضان لمدة 30 دقيقة على 25 درجة مئوية دون رج الأنابيب.
    تحذير: 4٪ PFA سام. ارتداء القفازات والأقنعة للحماية.
    ملاحظة: يوصى بإعداد 4٪ PFA في 1x PBS buffer. مسحوق PFA لا يذوب في 1x PBS على الفور. ومن ثم ، يجب تحضين الخليط عند 65 درجة مئوية في حاضنة طوال الليل أو رجه بشكل متقطع لمدة 45 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  4. بعد 30 دقيقة من حضانة الذبيحة بنسبة 4٪ PFA ، قم بإخراج محلول PFA ، وأضف 500 ميكرولتر من 1x PBS في الأنبوب ، وهز الأنبوب برفق على دوار مسطح لمدة 10 دقائق قبل التخلص من محلول 1x PBS (كرر 3x).
  5. باستخدام ملقط طويل ، انقل جثة اليرقات الثابتة والمغسولة إلى بئر في لوحة بقعة 9 منخفضة مملوءة ب 1x PBS. باستخدام # 5 ملقط ، قم بإزالة جميع أنسجة الجسم غير الدهنية.
  6. استخدم # 5 ملقط لتركيب قطع الجسم الدهني على شريحة مجهرية باستخدام 80٪ من الجلسرين كوسيط تثبيت ووضع غطاء في الأعلى.
    ملاحظة: قبل التركيب ، تحقق من الرقم الهيدروجيني للجلسرين بنسبة 80٪ (باستخدام أوراق الأس الهيدروجيني ، الرقم الهيدروجيني = 7 هو الأمثل) لحماية إشارة GFP. تساعد وسائط التركيب (انظر جدول المواد) مع DAPI في 80٪ من الجلسرين في تصوير نوى خلايا الجسم الدهنية. هذه الشرائح مستقرة لمدة 1 أسبوع عند تخزينها في الظلام عند 4 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في ظل ظروف التغذية ، ينتشر البروتين الشبيه باليوبيكويتين الموسوم ب GFP ، GFP-Atg8a ، داخل الخلايا. عند الجوع ، فإنه يشكل puncta الأخضر وتسمية البلعمة الذاتية. بمجرد اندماج البلعمة الذاتية مع الليزوزومات ، يتم إخماد GFP في الليزوزومات الذاتية الحمضية ، وتختفي النقط الخضراء. إذا لم يتم تحفيز الالتهام الذاتي أو تسريع نضوج البلعمة الذاتية ، فمن المتوقع أن يكون عدد نقاط GFP منخفضا. ومع ذلك ، إذا تم حظر الاندماج بين البلعمة الذاتية والليزوزومات أو أصبح الرقم الهيدروجيني للجسيم الذاتي أساسيا ، فمن المتوقع أن يكون عدد و / أو حجم GFP puncta مرتفعا.

في البروتوكول المقدم هنا ، يحفز نظام FLP / FRT إعادة التركيب الانقسامي ويولد أنسجة مع كل من الخلايا البرية والمتحولة. بينما تعبر الخلايا من النوع البري عن RFP ، تفتقر الخلايا الطافرة إلى تعبير RFP. يشير التعبير عن RFP في جميع خلايا الجسم الدهنية إلى أن إعادة التركيب الانقسامي بوساطة FLP / FRT لم يتم تحريضها بنجاح أو أن الطفرة قاتلة للخلية. في الحالة الأخيرة (أي إذا كانت الطفرة قاتلة للخلية) ، فمن المتوقع أن يحتوي جسم الدهون اليرقية على عدد قليل من الخلايا ذات إشارات RFP ذات المستوى الأعلى من الخلايا المحيطة.

في الشكل 2 ، شكل GFP-Atg8a (أخضر) نقطة في خلايا من النوع البري (أحمر) ، مما يعني أن الالتهام الذاتي قد تم تحريضه بنجاح. في الحيوانات المستنسخة الطافرة (RFP سلبية) ، كان نمط GFP-Atg8a puncta مختلفا عن ذلك الموجود في الخلايا البرية المحيطة ، مما يشير إلى عيوب الالتهام الذاتي. تم اكتشاف عدد قليل جدا من نقاط GFP-ATG8a في الحيوانات المستنسخة الطافرة Mu1 (الشكل 2B) ، مما يشير إلى أن الالتهام الذاتي قد تم حظره في خطوات البدء أو النضج الذاتي المتسارع. تم زيادة أعداد وحجم نقاط GFP-Atg8a بشكل كبير في الحيوانات المستنسخة الطافرة Mu2 (الشكل 2C) ، مما يشير إلى اندماج البلعمة الذاتية أو عيوب تحمض الليزوزوم الذاتي. هناك حاجة إلى مزيد من التجارب لتمييز هذه الاحتمالات. علاوة على ذلك ، يجب تحديد أحجام وعدد النقاط لتحديد ما إذا كانت الاختلافات المرصودة ذات دلالة إحصائية.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للإجراءات التجريبية لمراقبة علامة الالتهام الذاتي GFP-Atg8a في جسم دهني يرقي فسيفسائي يحمل مستنسخات متحولة. يظهر مخطط العبور لتوليد الذباب الذي يعبر عن GFP-Atg8a في أنسجة الجسم الدهنية اليرقية ويحمل مستنسخات متحولة (سلالة ذات طفرة نقطة قاتلة [Mu] على الكروموسوم X بمثابة مثال). بعد الصدمة الحرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتنشيط تعبير FLP ، يمكن إنشاء الخلايا الطافرة متماثلة الزيجوت مع تعبير GFP-Atg8a في y 'w * Mu FRT19A / hsFLP ubiRFP FRT19A ؛ cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / + جسم دهني لليرقات. يتم تحفيز الالتهام الذاتي في الجسم الدهني عن طريق احتضان اليرقات في محلول السكروز بنسبة 20٪ لمدة 6 ساعات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: اختلفت أنماط GFP-Atg8a puncta في مستنسخات Mu1 و Mu2 عن تلك الموجودة في مستنسخات التحكم. Mu1 و Mu2 هما قاتلان مستقلان على كروموسوم X. Isogenized y 'w * ، يعمل ذباب FRT19A كعنصر تحكم. تم تحليل أنماط GFP-Atg8a (الخضراء) في الأجسام الدهنية الضابطة ، Mu1 ، أو Mu2 من الفسيفساء. تم تمييز الحيوانات المستنسخة المتحولة (أو الحيوانات المستنسخة الضابطة) سلبا بواسطة RFP (أحمر). (أ) في الحيوانات المستنسخة الضابطة (RFP سلبية) ، كانت أنماط GFP-Atg8a puncta مماثلة لتلك الموجودة في الخلايا الإيجابية RFP المحيطة. (ب) في الحيوانات المستنسخة الطافرة Mu1 (RFP سلبية) ، تم تقليل نقاط GFP-Atg8a بشكل كبير. (C) في الحيوانات المستنسخة الطافرة Mu2 (RFP سلبية) ، تمت زيادة أعداد وحجم GFP-Atg8a puncta. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طرق (1) توليد الذباب الذي يحمل مستنسخات متحولة في أجسام الدهون اليرقية ، (2) تحفيز الالتهام الذاتي من خلال تجويع الأحماض الأمينية ، و (3) تشريح أجسام الدهون اليرقية. من أجل توليد الحيوانات المستنسخة بنجاح في أجسام الدهون اليرقات ، يجب تنفيذ الخطوات الحاسمة التالية بجد. (1) يعد توقيت الصدمة الحرارية بدقة أمرا بالغ الأهمية لأن إعادة التركيب الانقسامي تحدث فقط عندما يخضع النسيج للانقسام ، و (2) كل من درجة حرارة الصدمة الحرارية ومدتها ضرورية لإحداث تعبير FLP. يوصى باستخدام حمام مائي قياسي 37 درجة مئوية لصدمة حرارية لمدة 1 ساعة. بالنظر إلى زيادة احتمال موت الجنين / اليرقات أثناء الصدمة الحرارية والمجاعة ، يجب إنشاء معابر متعددة لتوليد عينات أنسجة كافية للتصوير.

بالإضافة إلى ذلك ، قد تحتاج بعض الخطوات إلى التعديل مع مراعاة ظروف الاستزراع الفعلية. على سبيل المثال ، قد تؤثر الاختلافات في البيئة ووسائط استزراع ذبابة الفاكهة بين المختبرات على معدلات نمو اليرقات. لذلك ، قد يلزم توحيد وقت النمو اللازم للأجنة للوصول إلى المرحلة الثالثة المبكرة ومدة تجويع اليرقات (زراعة السكروز بنسبة 20٪ للحث على الالتهام الذاتي) في كل مختبر على حدة.

GFP-Atg8a هي العلامة الأكثر استخداما لتحديد الالتهام الذاتي. ومع ذلك ، فإن التغييرات في نمط النقاط GFP-Atg8a تفشل في تحديد عيب الالتهام الذاتي الدقيق أو الخطوة المتأثرة مباشرة. لذلك ، يجب تحليل علامات متعددة لتفسير هذه البيانات بدقة. يمكن تكييف البروتوكول المقدم هنا مع البروتينات الأخرى المرتبطة بالالتهام الذاتي مع سلالاتها المعدلة وراثيا25. يمكن تحليل علامات متعددة موسومة ببروتينات فلورية مختلفة (مثل بروتين التألق الأزرق [BFP]) في وقت واحد لتوضيح عمليات البدء أو الاندماج. يمكن دمج تعديل الالتهام الذاتي الخاضع للرقابة ، باستخدام المواد الكيميائية26 أو تداخل الحمض النووي الريبي للجينات الحرجة27 ، مع النهج الحالي لتوضيح آليات الالتهام الذاتي بشكل أكبر. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تحليل علامات البروتين الداخلية للالتهام الذاتي (باستخدام الكيمياء المناعية) في أنسجة الفسيفساء أمرا مهما لتأكيد الأنماط الظاهرية28.

على الرغم من أن الالتهام الذاتي تم التعرف عليه في الأصل كعملية عشوائية غير انتقائية ، إلا أن الأدلة المتزايدة تشير إلى أنه يمكن أن يكون انتقائيا ويتحلل بشكل انتقائي العضيات السيتوبلازمية مثل الميتوكوندريا والشبكة الإندوبلازمية ، من بين أمور أخرى29. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق الإجراء الموضح هنا لاستكشاف الالتهام الذاتي الانتقائي. على سبيل المثال ، يمكن مراقبة الميتوفاجي في أجسام الدهون الذبابة عن طريق ربط البروتينات الفلورية (مثل علامات Keima أو GFP-RFP الترادفية) بتسلسل استهداف الميتوكوندريا30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن ممتنون ل THFC و BDSC لتوفير سلالات الذباب. يتم دعم الدكتور تونغ تشاو من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32030027 ، 91754103 ، 92157201) وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية. نشكر المرفق الأساسي في معهد علوم الحياة (LSI) على تقديم الخدمات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C
#5 Forceps Dumont RS-5015
9 Dressions Spot plate PYREX 7220-85
Fluorescence Microscope Nikon SMZ1500
Glycerol Sangon Biotech A100854-0100
KCl Sangon Biotech A610440-0500 Composition of 1x PBS solution
KH2PO4 Sangon Biotech A600445-0500 Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula Fisher 14-375-10
Long forceps R' DEER RST-14
Microscope cover glass CITOTEST 80340-1130
Microscope slides CITOTEST 80302-2104
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 Composition of 1x PBS solution
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Petri dish Corning 430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food Tong Lab-made
Stereo microscope Nikon SMZ745
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vectorlabratory H-1200-10 Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a Tong Lab's fly stocks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
  23. Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 186 ،
تحليل الالتهام الذاتي الناجم عن الجوع في الجسم الدهني <em>ليرقات ذبابة الفاكهة</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, K., Tong, C. Analyzing… More

Shi, K., Tong, C. Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body. J. Vis. Exp. (186), e64282, doi:10.3791/64282 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter