Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा फैट बॉडी में भुखमरी-प्रेरित ऑटोफैगी का विश्लेषण

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64282
Automatic Translation
1, 1
1Ministry of Education Key Laboratory of Biosystems Homeostasis and Protection and Innovation Center for Cell Signaling Network, Life Sciences Institute, Zhejiang University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा वसा शरीर में पोषक तत्वों की कमी के माध्यम से ऑटोफैगी के प्रेरण का वर्णन करता है और ट्रांसजेनिक फ्लाई उपभेदों का उपयोग करके ऑटोफैगी में परिवर्तन का विश्लेषण करता है।

Abstract

ऑटोफैगी एक सेलुलर स्व-पाचन प्रक्रिया है। यह भुखमरी सहित विभिन्न तनावों के जवाब में क्षरण के लिए लाइसोसोम को कार्गो पहुंचाता है। ऑटोफैगी की खराबी उम्र बढ़ने और कई मानव रोगों से जुड़ी हुई है। ऑटोफैगी मशीनरी अत्यधिक संरक्षित है- खमीर से मनुष्यों तक।  ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का लार्वा वसा शरीर, कशेरुक यकृत और वसा ऊतक के लिए एक एनालॉग, विवो में ऑटोफैगी की निगरानी के लिए एक अनूठा मॉडल प्रदान करता है। ऑटोफैगी को लार्वा वसा शरीर में पोषक तत्वों की भुखमरी से आसानी से प्रेरित किया जा सकता है। ड्रोसोफिला में अधिकांश ऑटोफैगी से संबंधित जीन संरक्षित होते हैं। टैग किए गए ऑटोफैगी मार्करों को व्यक्त करने वाले कई ट्रांसजेनिक फ्लाई उपभेदों को विकसित किया गया है, जो ऑटोफैगी प्रक्रिया में विभिन्न चरणों की निगरानी की सुविधा प्रदान करता है। क्लोनल विश्लेषण ऊतक के एक ही टुकड़े में विभिन्न जीनोटाइप वाली कोशिकाओं में ऑटोफैगी मार्करों की निकट तुलना को सक्षम बनाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल (1) लार्वा वसा शरीर में दैहिक क्लोन उत्पन्न करने के लिए प्रक्रियाओं का विवरण देता है, (2) एमिनो एसिड भुखमरी के माध्यम से ऑटोफैगी को प्रेरित करता है, और (3) लार्वा वसा शरीर का विच्छेदन करता है, जिसका उद्देश्य ऑटोफैगोसोम मार्कर (जीएफपी-एटीजी 8 ए) और क्लोनल विश्लेषण का उपयोग करके ऑटोफैगी में अंतर का विश्लेषण करने के लिए एक मॉडल बनाना है।

Introduction

ऑटोफैगी एक "स्व-खाने" प्रक्रिया है जो अमीनो एसिड भुखमरीसहित विभिन्न तनावों से प्रेरित है। मैक्रोऑटोफैगी (इसके बाद ऑटोफैगी के रूप में संदर्भित) ऑटोफैगी का सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया गया प्रकार है और सेलुलर होमियोस्टेसिस2 को बनाए रखने में एक अपूरणीय भूमिका निभाता है। ऑटोफैगी की खराबी कईमानव रोगों से जुड़ी है। इसके अलावा, कुछ ऑटोफैगी से संबंधित जीनविभिन्न बीमारियों के इलाज के लिए संभावित लक्ष्य हैं।

ऑटोफैगी को अत्यधिक परिष्कृत तरीके सेविनियमित किया जाता है। भुखमरी पर, अलगाव झिल्ली साइटोप्लाज्मिक सामग्री को डबल-झिल्ली वाले ऑटोफैगोसोम बनाने के लिए अनुक्रमितकरती है। ऑटोफैगोसोम तब एंडोसोम और लाइसोसोम के साथ फ्यूज होकर एम्फीसोम और ऑटोलाइसोसोम बनाते हैं। लाइसोसोमल हाइड्रोलाइटिक एंजाइमों की मदद से, घिरे साइटोप्लाज्मिक सामग्री को नीचा दिखाया जाता है, और पोषक तत्वों को पुनर्नवीनीकरण कियाजाता है।

ऑटोफैगी एक विकासवादी संरक्षितप्रक्रिया है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर विवो में ऑटोफैगी प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक बढ़िया मॉडल है। एमिनो एसिड भुखमरी आसानी से फ्लाई फैट शरीर के ऊतकों में ऑटोफैगी को प्रेरित करती है, जो मानव यकृत और वसा ऊतक का एक एनालॉगहै। ऑटोफैगी में दोष कई ऑटोफैगी से संबंधित प्रोटीनों के अलग-अलग पंक्टा पैटर्न को बाधित करते हैं, जैसे कि एटीजी 8, एटीजी 9, एटीजी 18, साइक्स 17, आरएबी 7, एलएएमपी 1, और पी 62, अन्य10 के बीच। इसलिए, इन ऑटोफैगी मार्करों के पैटर्न का विश्लेषण करने से ऑटोफैगी दोषों और दोषपूर्ण ऑटोफैगी चरण की घटना को समझने में मदद मिलेगी। उदाहरण के लिए, यूबिकिटिन जैसा प्रोटीन एटीजी 8 सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला ऑटोफैगी मार्कर11 है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) -टैग किए गए एटीजी 8 ए के साथ ट्रांसजेनिक उपभेदों को सफलतापूर्वक विकसितकिया गया है। जीएफपी-एटीजी 8 ए को साइटोसोल में फैलाया जाता है और फेड कोशिकाओं में नाभिक होता है। भुखमरी पर, जीएफपी-एटीजी 8 ए को फॉस्फेटिडिलथेनामाइन (पीई) द्वारा संसाधित और संशोधित किया जाता है और पंक्टा बनाता है, जो अलगाव झिल्ली और पूरी तरह से विकसित ऑटोफैगोसोम13,14 को लेबल करता है। प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से, ऑटोफैगी प्रेरण को आसानी से जीएफपी-एटीजी 8 पंक्टा गठन15 में वृद्धि के रूप में देखा जा सकता है। ऑटोफैगी दीक्षा दोष की उपस्थिति में भुखमरी के जवाब में एटीजी 8 ए पंक्टा नहीं बनेगा। चूंकि जीएफपी-एटीजी 8 ए को ऑटोलाइसोसोम में कम पीएच द्वारा बुझाया और पचाया जा सकता है, जीएफपी-एटीजी 8 ए पंक्टा संख्या में वृद्धि कर सकता है यदि ऑटोफैगी16 के अंत में अवरुद्ध हो जाती है।

चूंकि ऑटोफैगीपोषण उपलब्धता के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, संस्कृति की स्थिति में मामूली अंतर अक्सर फेनोटाइप में भिन्नता का कारण बनता है। इसलिए, क्लोनल विश्लेषण, एक विधि जो एक ही ऊतक में उत्परिवर्ती कोशिकाओं बनाम जंगली-प्रकार की नियंत्रण कोशिकाओं का विश्लेषण करती है, ऑटोफैगी दोष18 को विच्छेदित करने में एक बड़ा लाभ है। फ्लिपपेस पहचान लक्ष्य (एफएलपी/एफआरटी)-मध्यस्थ साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन का लाभ उठाते हुए, मोज़ेक ऊतकों को ले जाने वाली मक्खियों को आसानी से19,20 बना दिया जाता है। उत्परिवर्ती कोशिकाओं के आसपास की जंगली प्रकार की कोशिकाएं व्यक्तिगत मतभेदों से बचने के लिए एक आदर्श आंतरिक नियंत्रण बनातीहैं।

वर्तमान अध्ययन में बताया गया है कि अमीनो एसिड भुखमरी से ऑटोफैगी को कैसे प्रेरित किया जाए और जीएफपी-एटीजी 8 ए-व्यक्त मोज़ेक वसा शरीर के ऊतकों को कैसे उत्पन्न किया जाए। इन प्रोटोकॉल का उपयोग उत्परिवर्ती क्लोनों के बीच ऑटोफैगी में अंतर का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ड्रोसोफिला क्रॉसिंग और अंडे देना

  1. संभोग के लिए 3 नर (जीनोटाइप एचएसएफएलपी यूबीआरएफ एफआरटी 19 ए; सीजीजीएल 4 यूएएस-जीएफपी-एटीजी 8 ए) और 15 महिला (जीनोटाइप वाई डब्ल्यू * एमयू एफआरटी 19 ए / एफएम 7, केआर जीएफपी) वयस्क मक्खियों ( सामग्री की तालिका देखें) को एक संस्कृति शीशी (मानक कॉर्नमील / मोलासेस / एगर ड्रोसोफिला मीडिया के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर) में पेश करें।
    नोट: आगे के प्रयोगों के लिए पर्याप्त लार्वा सुनिश्चित करने के लिए एक ही क्रॉस की कई संस्कृति शीशियों को स्थापित किया जाना चाहिए। जीनोटाइप एचएसएफएलपी यूबीआरएफपी एफआरटी 19 ए के साथ नर फ्लाई स्ट्रेन; सीजीजीएल 4 यूएएस-जीएफपी-एटीजी 8 ए सेंट्रोमियर (एफआरटी 1 9 ए) के पास एक्स क्रोमोसोम पर एक एफआरटी साइट वहन करता है। यह 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के झटके पर एफएलपी भी व्यक्त करता है। एक्स क्रोमोसोम पर सर्वव्यापी आरएफपी अभिव्यक्ति के साथ एक ट्रांसजीन डाला जाता है। जीएफपी-एटीजी 8 ए लार्वा वसा शरीर22 में सीजीजीएएल 4 के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है। एफ.एम.एफ.पी. के. जी.पी. के. जी.पी. में एक्स क्रोमोसोम पर घातक उत्परिवर्तन (एमयू) और एफआरटी19ए होता है। विस्तृत क्रॉसिंग योजना चित्र 1 में दिखाई गई है।
  2. अंडे देने के लिए, मक्खियों को एक नई संस्कृति शीशी में स्थानांतरित करें। परिचय के 48 घंटे बाद, "संभोग" शीशी पर टैप करें जब तक कि मक्खियां स्तब्ध न हो जाएं और शीशी के आधार पर मीडिया पर गिर जाएं।
    1. "संभोग" शीशी को अनप्लग करें और ताजा मीडिया (ताजा संस्कृति शीशी) के साथ एक अनप्लग्ड उल्टे शीशी के साथ अपने मुंह को कवर करें। फिर, शीशियों को पलटकर और टैप करके मक्खियों को ताजा संस्कृति शीशी में स्थानांतरित करें।
    2. ताजा संस्कृति शीशी (स्थानांतरित मक्खियों के साथ) प्लग करें और पुरानी संस्कृति की शीशी को त्याग दें। ताजा मीडिया पर अंडे देने के लिए इस ताजा कल्चर शीशी को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: फ्लाई ट्रांसफर प्रक्रिया से पहले 15 मिनट के लिए ताजा कल्चर शीशियों को 25 डिग्री सेल्सियस तक प्रीप्रार्म करने से मक्खियों को नए वातावरण के अनुकूल होने और अंडे देने में तेजी लाने में मदद मिलेगी।
  3. अंडे देने के 6 घंटे बाद मक्खियों को हटा दें। यदि प्रयोगों को दोहराने की आवश्यकता है, तो इन मक्खियों को किसी अन्य संस्कृति शीशी में स्थानांतरित करें (जैसा कि चरण 1.2 में वर्णित है)। अन्यथा, मक्खियों को 75% इथेनॉल युक्त फ्लास्क में डंप करके छोड़ दें)।
    1. एफएलपी अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में भ्रूण के साथ शीशी को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और भ्रूण को विकसित होने की अनुमति दें।
      नोट: उत्परिवर्ती क्लोन के सफल गठन की पुष्टि बाद में इमेजिंग के माध्यम से की जा सकती है। आरएफपी संकेतों की अनुपस्थिति उत्परिवर्ती क्लोन को चिह्नित करती है।

2. एमिनो एसिड भुखमरी ऑटोफैगी को प्रेरित करती है

  1. एक प्रयोगशाला स्पैटुला का उपयोग करके, अंडे देने के 75 घंटे बाद पेट्री डिश में विकासशील लार्वा वाले मीडिया को बाहर निकालें। डिश में 1x PBS के 3 एमएल जोड़ें और धीरे से कल्चर मीडिया और लार्वा को लंबे बल का उपयोग करके अलग करें। 10 से 15 शुरुआती तीसरे इनस्टार लार्वा का चयन करें।
    नोट: प्रारंभिक तीसरे इनस्टार लार्वा को सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए। लार्वा का विकास चरण इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। अंडे देने की सीमित अवधि के कारण, कल्चर शीशी में अधिकांश लार्वा इनक्यूबेशन के 75 घंटे तक शुरुआती तीसरे इनस्टार चरण में होने की उम्मीद है। हालांकि, विभिन्न संस्कृति मीडिया व्यंजनों से लार्वा के विकास के समय में भिन्नता हो सकती है। शुरुआती तीसरे इनस्टार लार्वा को अलग करने के लिए मानदंड शरीर की लंबाई, पूर्ववर्ती और पीछे के स्पाइराकल की उपस्थिति, साथ ही मुंह तंत्र के मैंडिबुलर हुकहैं।
  2. 1x PBS के साथ 9-वेल ग्लास डिप्रेशन स्पॉट प्लेट ( सामग्री की तालिका देखें) के कुओं को भरें। अलग किए गए तीसरे इनस्टार लार्वा को लंबे बल का उपयोग करके कुओं में रखें और सभी मीडिया अवशेषों को हटाने के लिए लार्वा को अच्छी तरह से धो लें।
  3. एक खाली शीशी में 20% सुक्रोज (1x PBS में) घोल का 5 एमएल लें और लंबे बल का उपयोग करके इस घोल में साफ तीसरे इनस्टार लार्वा रखें। विच्छेदन के लिए कटाई करने से पहले इस शीशी को 6 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: 20% सुक्रोज (1x PBS में) समाधान अमीनो एसिड की कमी वाले भुखमरी माध्यम के रूप में कार्य करता है।

3. तीसरा इनस्टार लार्वा विच्छेदन और नमूना ऊतक प्रसंस्करण

  1. # 5 बलों के दो जोड़े को तेज करें ( सामग्री की तालिका देखें) दोनों तरफ समान रूप से एक धारदार पत्थर के साथ।
  2. 9-वेल ग्लास डिप्रेशन स्पॉट प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1x PBS का 400 μL जोड़ें और लार्वा को लंबे बल के साथ कुओं में स्थानांतरित करें। एक लार्वा को एक कुएं में रखें, जिसमें पृष्ठीय पक्ष (श्वासनली वाला पक्ष) ऊपर की ओर हो।
    1. लार्वा ट्रंक के बीच में दो # 5 बल के साथ लार्वा के छल्ली को पकड़ें और धीरे से छल्ली को खोलें। अन्य लार्वा आंतरिक ऊतकों के साथ उजागर वसा शरीर, अभी भी लार्वा के शव से जुड़े होंगे। आंतरिक अंगों को जितना संभव हो उतना उजागर करने के लिए पर्याप्त खींचें। सभी लार्वा के लिए इस चरण को दोहराएं।
      नोट: प्रत्येक लार्वा में शरीर के ट्रंक के साथ वसा शरीर के दो बड़े टुकड़े होते हैं। वसा शरीर ऊतक एक सफेद, अपारदर्शी और सपाट मोनोलेयर है जिसे विच्छेदन माइक्रोस्कोप24 के तहत आसानी से पहचाना जा सकता है।
  3. लार्वा शव को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का 500 μL होता है। ट्यूबों को हिलाए बिना 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    चेतावनी: 4% पीएफए विषाक्त है। सुरक्षा के लिए दस्ताने और मास्क पहनें।
    नोट: 1x PBS बफर में 4% PFA तैयार करने की सिफारिश की जाती है। पीएफए पाउडर 1x PBS में तुरंत नहीं घुलता है। इसलिए, मिश्रण को रात भर इनक्यूबेटर में 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाना चाहिए या 25 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए रुक-रुक कर हिलाया जाना चाहिए।
  4. 4% पीएफए के साथ शव के 30 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, पीएफए समाधान को बाहर निकालें, ट्यूब में 1x PBS के 500 μL जोड़ें, और 1x PBS समाधान को छोड़ने से पहले 10 मिनट के लिए एक सपाट घूर्णन पर ट्यूब को धीरे से हिलाएं (3x दोहराएं)।
  5. लंबे बल का उपयोग करके, निश्चित और धुले हुए लार्वा शव को 1x PBS से भरे 9-डिप्रेशन स्पॉट प्लेट में एक कुएं में स्थानांतरित करें। # 5 बल का उपयोग करके, सभी गैर-वसा वाले शरीर के ऊतकों को हटा दें।
  6. बढ़ते माध्यम के रूप में 80% ग्लिसरॉल का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वसा शरीर के टुकड़ों को माउंट करने के लिए # 5 फोर्सप्स का उपयोग करें और शीर्ष पर एक कवरस्लिप बिछाएं।
    नोट: माउंट करने से पहले, जीएफपी सिग्नल की रक्षा के लिए 80% ग्लिसरॉल (पीएच पेपर का उपयोग करके, पीएच = 7 इष्टतम है) के पीएच की जांच करें। 80% ग्लिसरॉल में DAPI के साथ माउंटिंग मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें) वसा शरीर कोशिकाओं के नाभिक की इमेजिंग में मदद करेगा। ये स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत होने पर 1 सप्ताह के लिए स्थिर होती हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

खिलाए गए परिस्थितियों में, जीएफपी-टैग किए गए यूबिकिटिन जैसे प्रोटीन, जीएफपी-एटीजी 8 ए, कोशिकाओं के अंदर फैल जाता है। भुखमरी पर, यह हरे रंग का पंक्टा बनाता है और ऑटोफैगोसोम को लेबल करता है। एक बार जब ऑटोफैगोसोम लाइसोसोम के साथ फ्यूज हो जाते हैं, तो जीएफपी अम्लीय ऑटोलाइसोसोम में बुझ जाता है, और हरा पंक्टा गायब हो जाता है। यदि ऑटोफैगी प्रेरित नहीं होती है या ऑटोफैगोसोम परिपक्वता तेज हो जाती है, तो जीएफपी पंक्टा की संख्या कम होने की उम्मीद है। हालांकि, यदि ऑटोफैगोसोम और लाइसोसोम के बीच संलयन अवरुद्ध हो जाता है या ऑटोलिसोसोम का पीएच बुनियादी हो जाता है, तो जीएफपी पंक्टा की संख्या और / या आकार अधिक होने की उम्मीद है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, एफएलपी / एफआरटी प्रणाली माइटोटिक पुनर्संयोजन को प्रेरित करती है और जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती कोशिकाओं दोनों के साथ ऊतक उत्पन्न करती है। जबकि जंगली प्रकार की कोशिकाएं आरएफपी को व्यक्त करती हैं, उत्परिवर्ती कोशिकाओं में आरएफपी अभिव्यक्ति की कमी होती है। सभी वसा शरीर कोशिकाओं में आरएफपी की अभिव्यक्ति से संकेत मिलेगा कि एफएलपी / एफआरटी-मध्यस्थता माइटोटिक पुनर्संयोजन सफलतापूर्वक प्रेरित नहीं था या उत्परिवर्तन सेल-घातक है। बाद के मामले में (यानी, यदि उत्परिवर्तन सेल-घातक है), लार्वा वसा शरीर में आसपास की कोशिकाओं की तुलना में उच्च स्तर के आरएफपी संकेतों के साथ कुछ कोशिकाएं होने की उम्मीद है।

चित्रा 2 में, जीएफपी-एटीजी 8 ए (हरा) ने जंगली प्रकार की कोशिकाओं (लाल) में पंक्टा का गठन किया, जिसका अर्थ है कि ऑटोफैगी को सफलतापूर्वक प्रेरित किया गया था। उत्परिवर्ती क्लोन (आरएफपी नकारात्मक) में, जीएफपी-एटीजी 8 ए पंक्टा का पैटर्न आसपास के जंगली प्रकार की कोशिकाओं से अलग था, जो ऑटोफैगी दोषों का सुझाव देता है। म्यू 1 उत्परिवर्ती क्लोन (चित्रा 2 बी) में बहुत कम जीएफपी-एटीजी 8 ए पंक्टा का पता लगाया गया था, यह दर्शाता है कि ऑटोफैगी को दीक्षा चरणों में अवरुद्ध किया गया था या ऑटोलिसोसोम परिपक्वता को तेज किया गया था। जीएफपी-एटीजी 8 ए पंक्टा की संख्या और आकार एमयू 2 उत्परिवर्ती क्लोन (चित्रा 2 सी) में बहुत बढ़ गया था, जो ऑटोफैगोसोम-लाइसोसोम संलयन या ऑटोलिसोसोम अम्लीकरण दोषों का सुझाव देता है। इन संभावनाओं को अलग करने के लिए आगे के प्रयोगों की आवश्यकता है। इसके अलावा, यह निर्धारित करने के लिए पंक्टा के आकार और संख्या को निर्धारित करने की आवश्यकता है कि क्या देखे गए अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं।

Figure 1
चित्रा 1: उत्परिवर्ती क्लोन ले जाने वाले मोज़ेक लार्वा वसा शरीर में ऑटोफैगी मार्कर जीएफपी-एटीजी 8 ए की निगरानी के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। लार्वा वसा शरीर के ऊतकों में जीएफपी-एटीजी 8 ए को व्यक्त करने और उत्परिवर्ती क्लोन ले जाने वाली मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए क्रॉसिंग योजना दिखाई गई है (एक्स-क्रोमोसोम पर एक घातक बिंदु उत्परिवर्तन [एमयू] के साथ एक तनाव एक उदाहरण के रूप में कार्य करता है)। एफएलपी अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के झटके के बाद, जीएफपी-एटीजी 8 ए अभिव्यक्ति के साथ होमोजीगस उत्परिवर्ती कोशिकाओं को वाई डब्ल्यू * एमयू एफआरटी 19 ए / एचएसएफएलपी यूबीआरएफ एफआरटी 19 ए; सीजीजीएल 4 यूएएस-जीएफपी-एटीजी 8 ए / + लार्वा वसा शरीर में उत्पन्न किया जा सकता है। ऑटोफैगी 6 घंटे के लिए 20% सुक्रोज समाधान में लार्वा को इंजेक्ट करके वसा शरीर में प्रेरित होता है।

Figure 2
चित्रा 2: म्यू 1 और म्यू 2 क्लोन में जीएफपी-एटीजी 8 ए पंक्टा के पैटर्न नियंत्रण क्लोन में उन लोगों से भिन्न थे। म्यू 1 और म्यू 2 एक्स क्रोमोसोम पर दो स्वतंत्र घातक उत्परिवर्ती हैं। आइसोजेनाइज्ड वाई 'डब्ल्यू *, एफआरटी 19 ए मक्खियां एक नियंत्रण के रूप में काम करती हैं। जीएफपी-एटीजी 8 ए (हरे) पैटर्न का विश्लेषण नियंत्रण, एमयू 1, या म्यू 2 मोज़ेक लार्वा वसा निकायों में किया गया था। उत्परिवर्ती क्लोन (या नियंत्रण क्लोन) को आरएफपी (लाल) द्वारा नकारात्मक रूप से चिह्नित किया गया था। (ए) नियंत्रण क्लोन (आरएफपी नकारात्मक) में, जीएफपी-एटीजी 8 ए पंक्टा के पैटर्न आसपास के आरएफपी सकारात्मक कोशिकाओं के समान थे। (बी) म्यू 1 उत्परिवर्ती क्लोन (आरएफपी नकारात्मक) में, जीएफपी-एटीजी 8 ए पंक्टा बहुत कम हो गया था। (सी) म्यू 2 उत्परिवर्ती क्लोन (आरएफपी नकारात्मक) में, जीएफपी-एटीजी 8 ए पंक्टा की संख्या और आकार में वृद्धि हुई थी। स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल (1) लार्वा वसा निकायों में उत्परिवर्ती क्लोन ले जाने वाली मक्खियों को उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करता है, (2) अमीनो एसिड भुखमरी के माध्यम से ऑटोफैगी को प्रेरित करता है, और (3) लार्वा वसा निकायों का विच्छेदन करता है। लार्वा वसा निकायों में सफलतापूर्वक क्लोन उत्पन्न करने के लिए, निम्नलिखित महत्वपूर्ण चरणों को लगन से किया जाना चाहिए। (1) हीट शॉक का सही समय महत्वपूर्ण है क्योंकि माइटोटिक पुनर्संयोजन केवल तब होता है जब ऊतक माइटोसिस से गुजर रहा होता है, और (2) एफएलपी अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए गर्मी के झटके का तापमान और अवधि दोनों महत्वपूर्ण हैं। 1 घंटे के गर्मी के झटके के लिए एक मानक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान की सिफारिश की जाती है। गर्मी के झटके और भुखमरी के दौरान भ्रूण / लार्वा मृत्यु की बढ़ती संभावना को ध्यान में रखते हुए, इमेजिंग के लिए पर्याप्त ऊतक नमूना उत्पादन के लिए कई क्रॉसिंग स्थापित किए जाने चाहिए।

इसके अलावा, वास्तविक संवर्धन स्थितियों को देखते हुए कुछ चरणों को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, प्रयोगशालाओं के बीच पर्यावरण और ड्रोसोफिला संस्कृति मीडिया में अंतर लार्वा की वृद्धि दर को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, भ्रूण को शुरुआती तीसरे इंस्टार चरण तक पहुंचने के लिए आवश्यक विकास ता्मक समय और लार्वा भुखमरी की अवधि (ऑटोफैगी को प्रेरित करने के लिए 20% सुक्रोज में संवर्धन) को प्रत्येक प्रयोगशाला में अलग से मानकीकृत करने की आवश्यकता हो सकती है।

ऑटोफैगी का निर्धारण करने के लिए जीएफपी-एटीजी 8 ए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मार्कर है। हालांकि, जीएफपी-एटीजी 8 ए पंक्टा पैटर्न में परिवर्तन सटीक ऑटोफैगी दोष या प्रभावित कदम को सीधे इंगित करने में विफल रहते हैं। इसलिए, ऐसे डेटा की सटीक व्याख्या करने के लिए कई मार्करों का विश्लेषण किया जाना चाहिए। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को अन्य ऑटोफैगी से संबंधित प्रोटीनों के लिए उनके संबंधित ट्रांसजेनिकउपभेदों 25 के साथ अनुकूलित किया जा सकता है। विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे ब्लू फ्लोरेसेंस प्रोटीन [बीएफपी]) के साथ लेबल किए गए कई मार्करों का विश्लेषण दीक्षा या संलयन प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए एक साथ किया जा सकता है। नियंत्रित ऑटोफैगी संशोधन, रसायन26 या महत्वपूर्ण जीन27 के आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग करके, ऑटोफैगी तंत्र को और स्पष्ट करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, मोज़ेक ऊतकों में ऑटोफैगी (इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके) के अंतर्जात प्रोटीन मार्करों का विश्लेषण करना फेनोटाइप28 की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है।

यद्यपि ऑटोफैगी को मूल रूप से एक यादृच्छिक, अचयनात्मक प्रक्रिया के रूप में मान्यता दी गई थी, बढ़ते सबूत इंगित करते हैं कि यह चयनात्मक हो सकता है और चुनिंदा रूप से साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल जैसे माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम को नीचा दिखाताहै। इसके अलावा, यहां वर्णित प्रक्रिया को चयनात्मक ऑटोफैगी का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल लक्ष्यीकरण अनुक्रम30 में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे कीमा या जीएफपी-आरएफपी टेंडम टैग) को संलग्न करके फ्लाई फैट बॉडी में माइटोफैगी की निगरानी की जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम फ्लाई स्ट्रेन प्रदान करने के लिए टीएचएफसी और बीडीएससी के आभारी हैं। टोंग चाओ को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32030027, 91754103, 92157201) और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि द्वारा समर्थित किया गया है। हम सेवाएं प्रदान करने के लिए लाइफ साइंसेज इंस्टीट्यूट (एलएसआई) में मुख्य सुविधा का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C
#5 Forceps Dumont RS-5015
9 Dressions Spot plate PYREX 7220-85
Fluorescence Microscope Nikon SMZ1500
Glycerol Sangon Biotech A100854-0100
KCl Sangon Biotech A610440-0500 Composition of 1x PBS solution
KH2PO4 Sangon Biotech A600445-0500 Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula Fisher 14-375-10
Long forceps R' DEER RST-14
Microscope cover glass CITOTEST 80340-1130
Microscope slides CITOTEST 80302-2104
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 Composition of 1x PBS solution
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Petri dish Corning 430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food Tong Lab-made
Stereo microscope Nikon SMZ745
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vectorlabratory H-1200-10 Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a Tong Lab's fly stocks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
  23. Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).

Tags

इस महीने JoVE में अंक 186
<em>ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> लार्वा फैट बॉडी में भुखमरी-प्रेरित ऑटोफैगी का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, K., Tong, C. Analyzing… More

Shi, K., Tong, C. Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body. J. Vis. Exp. (186), e64282, doi:10.3791/64282 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter