Summary
本协议描述了通过营养消耗在黑腹果蝇幼虫脂肪体中诱导自噬，并使用转基因苍蝇菌株分析自噬的变化。
Abstract
自噬是一种细胞自我消化过程。它将货物运送到溶酶体进行降解，以应对各种压力，包括饥饿。自噬功能障碍与衰老和多种人类疾病有关。自噬机制是高度保守的 - 从酵母到人类。 黑腹果蝇的幼虫脂肪体是脊椎动物肝脏和脂肪组织的类似物，为 监测体内自噬提供了独特的模型。幼虫脂肪体中的营养匮乏很容易诱导自噬。大多数自噬相关基因在 果蝇 中是保守的。已经开发出许多表达标记自噬标记的转基因苍蝇菌株，这有助于监测自噬过程中的不同步骤。克隆分析能够密切比较同一块组织中具有不同基因型的细胞中的自噬标志物。目前的协议详细说明了（1）在幼虫脂肪体中产生体细胞克隆，（2）通过氨基酸饥饿 诱导 自噬和（3）解剖幼虫脂肪体的程序，旨在创建一个模型，用于使用自噬体标记（GFP-Atg8a）和克隆分析分析分析自噬差异。
Introduction
自噬是由各种压力引起的“自食”过程，包括氨基酸饥饿1。巨自噬（以下简称自噬）是研究最充分的自噬类型，在维持细胞稳态方面起着不可替代的作用2。自噬功能障碍与几种人类疾病有关3.此外，一些自噬相关基因是治疗各种疾病的潜在靶点4。
自噬以高度复杂的方式受到调节5。饥饿时，分离膜螯合细胞质物质以形成双膜自噬体6。然后自噬体与内体和溶酶体融合形成两亲体和自溶酶体。在溶酶体水解酶的帮助下，吞噬的细胞质内容物被降解，营养物质被回收7。
自噬是一个进化上保守的过程8。 黑腹果蝇 是研究 体内自噬过程的一个很好的模型。氨基酸饥饿容易诱导苍蝇脂肪体组织中的自噬，这是人类肝脏和脂肪组织的类似物9。自噬缺陷会破坏几种自噬相关蛋白的独特点状模式，例如Atg8，Atg9，Atg18，Syx17，Rab7，LAMP1和p62等10。因此，分析这些自噬标志物的模式将有助于辨别自噬缺陷的发生和有缺陷的自噬步骤。例如，泛素样蛋白Atg8是最常用的自噬标志物11。在 黑腹果蝇中，已成功开发出具有绿色荧光蛋白（GFP）标记的Atg8a的转基因菌株12。GFP-Atg8a在喂养细胞的细胞质和细胞核中扩散。饥饿后，GFP-Atg8a被磷脂酰乙醇胺（PE）加工和修饰并形成点状体，其标记分离膜和完全发育的自噬体13，14。通过直接荧光显微镜，可以很容易地观察到自噬诱导为GFP-Atg8点形成的增加15。在存在自噬起始缺陷的情况下，Atg8a 点状体不会响应饥饿而形成。由于GFP-Atg8a可以通过自溶酶体中的低pH值进行淬灭和消化，如果在晚期16期阻断自噬，GFP-Atg8a点的数量可能会增加。
由于自噬对营养可用性高度敏感17，培养条件的微小差异通常会导致表型的变化。因此，克隆分析是一种分析同一组织中突变细胞与野生型对照细胞的方法，在解剖自噬缺陷方面具有主要优势18。利用翻转酶/翻转酶识别靶标（FLP/FRT）介导的同源染色体之间的位点特异性重组，携带镶嵌组织的果蝇很容易制造19，20。突变细胞周围的野生型细胞形成完美的内部对照，以避免个体差异21。
本研究描述了如何通过氨基酸饥饿诱导自噬并产生表达GFP-Atg8a的镶嵌脂肪体组织。这些协议可用于分析突变克隆之间自噬的差异。
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Protocol
1. 果蝇 杂交和产卵
- 将3只雄性（基因型 hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a）和15只雌性（基因型 y' w* Mu FRT19A / FM7，Kr GFP ）成年苍蝇（见 材料表）引入培养瓶（在25°C下用标准玉米面/糖蜜/琼脂 果蝇 培养基）进行交配。
注意：必须设置同一杂交的多个培养瓶，以确保有足够的幼虫进行进一步的实验。基因型 为hsFLP ubiRFP FRT19A的雄性苍蝇菌株; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a 在着丝粒（FRT19A）附近的X染色体上携带FRT位点。它还在37°C热冲击时表达FLP。 在X染色体上插入具有普遍RFP表达的转基因。GFP-Atg8a在 cgGal4 的控制下在幼虫脂肪体22中表达。基因型为y' w* Mu FRT19A / FM7，Kr GFP 的雌性苍蝇菌株在X染色体上携带致死突变（Mu）和 FRT19A 。详细的交叉方案如图 1所示。 - 对于产卵，将苍蝇转移到新的培养瓶中。在引入后48小时，点击“交配”小瓶，直到苍蝇被击晕并落在小瓶底部的培养基上。
- 拔下“交配”小瓶的插头，并用带有新鲜培养基（新鲜培养瓶）的拔出的倒置小瓶盖住其嘴。然后，通过翻转和敲击小瓶将苍蝇转移到新鲜培养瓶中。
- 塞上新鲜培养瓶（带有转移的苍蝇）并丢弃旧培养瓶。将此新鲜培养瓶放入25°C培养箱中，以便在新鲜培养基上产卵。
注意：在苍蝇转移过程之前，将新鲜培养瓶预热至25°C15分钟将有助于苍蝇快速适应新环境并加速产卵。
- 产卵6小时后移走苍蝇。如果需要重复实验，请将这些苍蝇转移到另一个培养瓶中（如步骤1.2中所述）。否则，通过将苍蝇倒入含有75%乙醇的烧瓶中来丢弃苍蝇）。
- 将装有胚胎的小瓶在37°C水浴中孵育1小时以诱导FLP表达。随后，将它们放入25°C培养箱中，让胚胎继续发育。
注意：突变克隆的成功形成随后可以通过成像确认。没有RFP信号标志着突变克隆。
- 将装有胚胎的小瓶在37°C水浴中孵育1小时以诱导FLP表达。随后，将它们放入25°C培养箱中，让胚胎继续发育。
2.氨基酸饥饿诱导自噬
- 使用实验室刮刀，在产卵后75小时将含有发育幼虫的培养基舀出到培养皿中。向培养皿中加入 3 mL 的 1x PBS，并使用长镊子轻轻分离培养基和幼虫。选择10至15只早期三龄幼虫。
注意：需要仔细选择早期第三龄幼虫。幼虫的发育阶段对于该协议的成功至关重要。由于产卵时间有限，培养瓶中的大多数幼虫预计在孵化75小时时处于第三龄早期。然而，不同的培养基配方可能导致幼虫发育时间的变化。区分早期三龄幼虫的标准是体长、前后螺旋体的存在以及口腔器的下颌钩23。 - 用1x PBS填充9孔玻璃凹陷点板（见 材料表）的孔。使用长镊子将分离的第三龄幼虫放入孔中，并彻底清洗幼虫以去除所有介质残留物。
- 在空瓶中取5mL 20%蔗糖（在1x PBS中）溶液，并使用长镊子将干净的第三龄幼虫放入该溶液中。将该小瓶在25°C培养箱中孵育6小时，然后收获它们进行解剖。
注意：20%蔗糖（在1x PBS中）溶液用作氨基酸缺乏的饥饿培养基。
3.三龄幼虫解剖和样本组织处理
- 用磨刀石在两侧均匀地磨尖两对#5镊子（见 材料表）。
- 向 9 孔玻璃凹陷点板的每个孔中加入 400 μL 1x PBS，并用长镊子将幼虫转移到孔中。将一只幼虫放入孔中，背侧（气管一侧）朝上。
- 用幼虫躯干中间的两个#5镊子抓住幼虫的角质层，轻轻撕开角质层。暴露的脂肪体以及其他幼虫内部组织仍将附着在幼虫的尸体上。拉力足以尽可能暴露内脏。对所有幼虫重复此步骤。
注意：每个幼虫沿着身体躯干有两大块脂肪体。脂肪体组织是白色、不透明和扁平的单层，在解剖显微镜下可以很容易地区分24。
- 用幼虫躯干中间的两个#5镊子抓住幼虫的角质层，轻轻撕开角质层。暴露的脂肪体以及其他幼虫内部组织仍将附着在幼虫的尸体上。拉力足以尽可能暴露内脏。对所有幼虫重复此步骤。
- 将幼虫尸体转移到含有 500 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 的 1.5 mL 微量离心管中。在25°C下孵育30分钟而不摇动试管。
注意：4%的PFA是有毒的。戴上手套和口罩进行防护。
注意：建议在1x PBS缓冲液中制备4%PFA。PFA粉末不会立即溶解在1x PBS中。因此，混合物必须在65°C的培养箱中孵育过夜或在25°C下间歇摇动45分钟。 - 用 4% PFA 孵育胴体 30 分钟后，移出 PFA 溶液，向管中加入 500 μL 1x PBS，并在平旋转器上轻轻摇动管 10 分钟，然后丢弃 1x PBS 溶液（重复 3 次）。
- 使用长镊子，将固定和洗涤的幼虫尸体转移到装有 1x PBS 的 9 凹陷点板中的孔中。使用#5镊子，去除所有非脂肪身体组织。
- 使用#5镊子将脂肪体的碎片安装在显微镜载玻片上，使用80%甘油作为安装介质，并在顶部放置盖玻片。
注意：在安装之前，请检查80%甘油的pH值（使用pH纸，pH = 7是最佳的）以保护GFP信号。含有80%甘油的DAPI的封片剂（见 材料表）将有助于对脂肪体细胞的细胞核进行成像。这些载玻片在4°C的黑暗中储存时可稳定1周。
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Representative Results
在喂养条件下，GFP标记的泛素样蛋白GFP-Atg8a在细胞内扩散。饥饿时，它会形成绿色点状体并标记自噬体。一旦自噬体与溶酶体融合，GFP在酸性自溶酶体中淬灭，绿色点消失。如果未诱导自噬或自噬体成熟加速，则预计GFP点的数量较低。然而，如果自噬体和溶酶体之间的融合被阻断或自溶酶体的pH值变得碱性，则预计GFP点的数量和/或大小会很高。
在这里介绍的方案中，FLP / FRT系统诱导有丝分裂重组并产生具有野生型和突变细胞的组织。虽然野生型细胞表达RFP，但突变细胞缺乏RFP表达。RFP在所有脂肪体细胞中的表达表明FLP / FRT介导的有丝分裂重组未成功诱导或突变是细胞致命的。在后一种情况下（即，如果突变是细胞致命的），预计幼虫脂肪体将具有比周围细胞具有更高水平RFP信号的细胞。
在图2中，GFP-Atg8a（绿色）在野生型细胞（红色）中形成点状体，这意味着自噬被成功诱导。在突变克隆（RFP阴性）中，GFP-Atg8a点的模式与周围野生型细胞中的模式不同，表明自噬缺陷。在Mu1突变克隆中检测到的GFP-ATG8a点很少（图2B），表明自噬在起始步骤或加速自溶酶体成熟时被阻断。在Mu2突变克隆中，GFP-Atg8a点的数量和大小大大增加（图2C），表明自噬体 - 溶酶体融合或自溶酶体酸化缺陷。需要进一步的实验来区分这些可能性。此外，需要量化点的大小和数量，以确定观察到的差异是否具有统计学意义。
图 1：在携带突变克隆的镶嵌幼虫脂肪体中监测自噬标记 GFP-Atg8a 的实验程序示意图。 显示了在幼虫脂肪体组织中表达GFP-Atg8a并携带突变克隆的苍蝇的杂交方案（X染色体上具有致死点突变[Mu]的菌株就是一个例子）。在37°C热休克1小时激活FLP表达后，在y' w* Mu FRT19A / hsFLP ubiRFP FRT19A中可以生成具有GFP-Atg8a表达的纯合突变细胞 ; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / +幼虫脂肪体。通过将幼虫在20%蔗糖溶液中孵育6小时，在脂肪体中诱导自噬。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：Mu1 和 Mu2 克隆中 GFP-Atg8a 点状动脉的模式与对照克隆中的模式不同。 Mu1和Mu2是X染色体上两个独立的致命突变体。同质化的y' w*，FRT19A苍蝇作为对照。在对照、Mu1或Mu2镶嵌幼虫脂肪体中分析GFP-Atg8a（绿色）模式。突变克隆（或对照克隆）被RFP（红色）标记为负面。（A）在对照克隆（RFP阴性）中，GFP-Atg8a点状细胞的模式与周围RFP阳性细胞中的模式相似。（B）在Mu1突变克隆（RFP阴性）中，GFP-Atg8a点大大减少。（C）在Mu2突变克隆（RFP阴性）中，GFP-Atg8a点的数量和大小增加。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本协议描述了以下方法：（1）在幼虫脂肪体中产生携带突变克隆的苍蝇，（2）通过氨基酸饥饿诱导自噬，以及（3）解剖幼虫脂肪体。为了在幼虫脂肪体中成功生成克隆，需要认真执行以下关键步骤。（1）准确把握热休克的时间至关重要，因为有丝分裂重组仅在组织经历有丝分裂时发生，并且（2）热休克温度和持续时间对于诱导FLP表达至关重要。建议使用标准的37°C水浴进行1小时的热休克。考虑到热休克和饥饿期间胚胎/幼虫死亡的可能性增加，必须设置多个交叉点以产生足够的组织样本进行成像。
此外，考虑到实际培养条件，可能需要修改一些步骤。例如，实验室之间环境和 果蝇 培养基的差异可能会影响幼虫的生长速度。因此，胚胎达到第三龄早期所需的发育时间和幼虫饥饿的持续时间（在20%蔗糖中培养以诱导自噬）可能需要在每个实验室中单独标准化。
GFP-Atg8a是测定自噬最常用的标志物。然而，GFP-Atg8a点状模式的变化无法直接查明确切的自噬缺陷或受影响的步骤。因此，必须分析多个标记物才能准确解释这些数据。这里介绍的方案可以适用于具有各自转基因菌株的其他自噬相关蛋白25。可以同时分析用不同荧光蛋白（例如蓝色荧光蛋白[BFP]）标记的多个标记物，以阐明起始或融合过程。受控自噬修饰，使用化学物质26 或RNA干扰关键基因27，可以与本方法相结合，进一步阐明自噬机制。此外，分析镶嵌组织中自噬的内源性蛋白质标志物（通过使用免疫组织化学）对于确认表型很重要28。
尽管自噬最初被认为是一种随机的、非选择性的过程，但越来越多的证据表明，它可以具有选择性，并选择性地降解细胞质细胞器，如线粒体和内质网等29。此外，这里描述的程序可以应用于探索选择性自噬。例如，可以通过将荧光蛋白（如Keima或GFP-RFP串联标签）连接到线粒体靶向序列30来监测苍蝇脂肪体中的线粒体自噬。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢THFC和BDSC提供苍蝇菌株。童超博士得到了国家自然科学基金（32030027，91754103，92157201）和中央大学基础研究基金的支持。我们感谢生命科学研究所（LSI）的核心设施提供服务。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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