Summary
本プロトコルは、マウス甲状腺全体を視覚化し、未分化甲状腺癌の成長を監視するための高周波超音波検査を記載しています。
Abstract
未分化甲状腺癌(ATC)は予後不良と生存期間の中央値が短いことと関連しているが、アウトカムを有意に改善する効果的な治療法はない。ATCの進行を模倣する遺伝子操作されたマウスモデルは、研究者がこの病気の治療法を研究するのに役立つ可能性があります。マウスの3つの異なる遺伝子型、 TPO-cre / ERT2を交配します。ブラフCA/重量;Trp53 Δex2-10/Δex2-10トランスジェニックATCモデルを開発した。ATCマウスモデルは、タモキシフェンの腹腔内注射により、BrafV600E の過剰発現とTrp53の欠失により誘導され、約1か月以内に腫瘍が発生しました。高解像度超音波を適用して腫瘍の開始と進行を調べ、腫瘍のサイズを測定することにより動的成長曲線を取得しました。磁気共鳴画像法(MRI)やコンピューター断層撮影スキャンと比較して、超音波はATCマウスモデルを観察する上で、非侵襲的、ポータブル、リアルタイムで、放射線被曝がないなどの利点があります。高分解能超音波は、動的および複数の測定に適しています。ただし、マウスの甲状腺の超音波検査には、関連する解剖学的知識と経験が必要です。この記事では、高分解能超音波を利用してトランスジェニックATCモデルの腫瘍をスキャンするための詳細な手順を説明します。一方、超音波パラメータ調整、超音波スキャンスキル、動物の麻酔と回復、およびプロセス中に注意が必要なその他の要素がリストされています。
Introduction
未分化甲状腺癌(ATC)は甲状腺癌の2%未満を占めていますが、毎年甲状腺癌関連の死亡の50%以上を引き起こします。ATCと診断された後の生存期間の中央値はわずか約6か月であり、生存率を大幅に改善する治療法はありません1,2。
ATCの希少性は、病気がどのように始まり、積極的に進行するかを研究する研究を妨げてきました。この病気を模倣する遺伝子操作されたマウスモデルが最近利用可能になり、病気と可能な治療法に対するその反応についての洞察を提供します3,4,5。このような研究では、測定とモニタリングのための正確な腫瘍イメージングが必要であり、これは通常、磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影、または高解像度超音波検査を使用して実行されます6,7。超音波検査はマウスの臓器で広く使用されています。これは、リアルタイムで実行でき、被験者を放射線にさらさないため、磁気共鳴画像法やコンピューター断層撮影よりも利点があり、必要な機器は持ち運びできるほど小さいです8,9。ただし、超音波を使用してATCの成長を継続的に監視する研究はまれです。したがって、この研究は、この文脈における超音波の有用性を探ります。
ここでは、高解像度超音波検査を使用して、ATCのマウスモデルで腫瘍を正確にスキャン、監視、および測定するためのプロトコルが提示されています。
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Protocol
本研究は、四川大学の動物管理および使用委員会の承認を得て実施されました。 TPO-cre/ERT2;ブラフCA/重量;Trp53 Δex2-10/Δex2-10 トランスジェニックマウス10 を本研究に用いた( 資料表参照)。プロトコルステップは、必要に応じて異なる動物種に合わせて変更することができる。ここでは、平均年齢93日の6匹の雌と6頭の雄を含む12匹のマウスを使用しました。
1. 実験準備
- 超音波検査システムの電源を入れ( 材料の表を参照)、画像をキャプチャしてデータを収集するための新しいフォルダーを作成します。40 MHzラインプローブを選択し、表在 組織パターンをクリックして、表在 組織トランスデューサをアクティブにします。甲状腺イメージングには「Bモード」を使用します(図1A)。
注意: Bモードは基本的な超音波イメージングモードです。超音波画像の出現は、音と体内の組織との物理的相互作用に依存しています。Bモード画像は、グレー画像11、12として生成される。 - マウスを特定のケージに入れて、餌と水を自由に利用できるようにします。温度調節を確実にするために、ケージを補助加熱装置( 材料表を参照)に置きます。
- 気化器内の十分なイソフルランとタンク内のO2 を確保してください。供給が不十分な場合は、タンクを新しいものと交換してください。
- 動物イメージングプラットフォームを滅菌生理食塩水で洗浄し、加熱ボタンをオンにします。動物をプラットフォームに置く前に、温度が38〜40°Cであることを確認してください(図1C)。
2.イメージングのための動物の準備
- イソフルラン気化器のスイッチを入れます。マウスをケージから麻酔ボックスに移します。
- 気化器からの1%〜2%のイソフルランと0.8 L / minで流れる酸素の混合物を使用して動物を麻酔します。.
- 胸から首に脱毛クリームを塗り、30秒待ってから、クリームと毛皮を完全に拭き取ります。その領域と周囲の毛皮を温かい滅菌生理食塩水で十分にすすいでください。
- 麻酔をかけた動物を加熱されたプラットフォームに置きます。麻酔出口に接続されたノーズコーンで鼻を覆います(図2A、B)。
注意: マウスは1〜2分以内に完全に鎮静する必要があります。動物がまだ活動している場合は、動物がペダル離脱反射を示さなくなるまで、長時間のイソフルラン誘導を実行します。.動物が安定して呼吸していることを確認してください。 - イメージング中は、加熱されたプラットフォームを介してマウスの心拍数を監視します。
注意: 超音波画像システムには心拍数モニターが装備されています。 - 粘着テープを使用して、動物を仰臥位にして、マウスの手足を加熱されたプラットフォームに固定します。ノーズコーンが一定の麻酔ガス流量(1.5 L / min)で安定して配置されていることを確認します。
- 眼科用軟膏を塗って目を保護します。
3.腫瘍イメージング
- イメージングシステムを調整して解像度を最適化します。次のパラメータを設定します:2次元ゲイン、25〜30 dB。画像の深さ、10 mm;焦点ゾーンの数、3;そして中心、3-6 mm。
注:本研究では、40MHzプローブを使用しました。データ取得用にBモードが指定されました。 - 素肌の領域に超音波ジェル( 材料の表を参照)を自由に塗布します。
- プローブを持って胸部の超音波ゲルに接触させ、胸部から首に向かってスキャンして甲状腺を見つけます(図2C)。
注意: スキャン中は静かに圧力をかけます。動物の首に過度の圧力がかかると、あえぎや無呼吸を引き起こす可能性があります。このプロトコルはハンドヘルドスキャンに基づいて開発されましたが、機械化されたスキャンは、x軸とy軸に沿って移動する動物イメージングプラットフォームなど、プローブをガイドする機械を使用して実行することもできます。 - 上下にスキャンして腫瘍の境界を特定し、そのサイズと形状を評価します。
注:健康な甲状腺は通常、気管の前に低エコー性の均質な構造として現れます。未分化腫瘍は甲状腺をはるかに大きく見せますが、これは首のスキャンによって簡単に識別できます(図3)。 - 解剖学的位置と超音波エコーに応じて、気管とストラップの筋肉からATC腫瘍を特定します。
注意: ストラップの筋肉は、甲状腺と気管の前、および甲状腺の後ろにあります。ストラップ筋肉の超音波エコーはATCの超音波エコーよりも高く見えますが、気管13の後ろに減衰が存在します。- 腫瘍全体の印象に基づいて、左から右に最大の腫瘍直径を持つ画像セクションを確認します。 フリーズ ボタンを押し、超音波ノギスを使用して前後および左から右の腫瘍直径を測定します。
注:前後の直径は、左から右への腫瘍の直径に対して垂直に測定する必要があります(図4)。ATCの腫瘍サイズは、前後直径に左から右への腫瘍直径14を乗じて計算した。左右の腫瘍の大きさに一貫性がなかったため、腫瘍の両側を別々に計算した。腫瘍の総サイズは、両側性腫瘍を加えることによって得られた。サイズは、ATCの成長曲線を観察するために記録されました。
- 腫瘍全体の印象に基づいて、左から右に最大の腫瘍直径を持つ画像セクションを確認します。 フリーズ ボタンを押し、超音波ノギスを使用して前後および左から右の腫瘍直径を測定します。
- 記録をシネループとして保存すると、選択した画像のレビューが容易になります。
4.動物の回復
- スキャン後、超音波ゲルを拭き、動物の手足から拘束テープをはがします。
- 補助加熱装置の上にマウスを置きます(ステップ1.2)。動物を横に置きます(図2D)。
- マウスが回復したら(~5分)、ケージに戻します。
- 超音波検査システム、プローブ、およびプラットフォームを、柔らかい布とイソプロピルアルコールまたはグルタルアルデヒドワイプを使用して清掃します。
- イメージングシステムの電源を切ります。
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Representative Results
研究開始時の右ATCの平均サイズは4.867 mm 2であり、平均左ATCサイズは5.189 mm2でした。4回目の測定では、右ATCの平均サイズは11.844 mm 2に拡大し、左葉の腫瘍サイズは9.280 mm2に拡大しました。ATC の合計サイズが 10.057 mm 2 から 15.843 mm2 に増加しました。研究の後期段階で、ATCは急速に成長しました。「P92」と標識されたマウス(表1)に関しては、4回目の測定で腫瘍のサイズは、最初の測定のサイズのほぼ4倍に拡大していました。4匹のマウスの代表的な測定値および成長曲線を図5に示す。
高周波超音波検査は、ヒトの甲状腺を検査するために最も頻繁に使用される画像診断法であり、この技術はマウスにも適しているようです。マウスの甲状腺全体と甲状腺病変の成長の詳細を視覚化できます。高周波超音波検査の方法を適用するこのプロトコルは、ATCの遺伝子操作されたマウスモデルで腫瘍を正確にスキャン、監視、および測定するために使用できます。
図1:本研究で用いた機器 。 (A)高周波超音波検査システム。(B)実験用品:(1)電気加熱ブランケット。(2)ペーパータオル。(3)超音波ゲル。(4)イソフルラン気化器。(5)脱毛クリーム。(6)綿棒。(7)はさみ。(8)粘着テープ。(9)医療用手袋。(10)麻酔導入のためのチャンバー。(11)麻酔システム。(C)超音波イメージング用の機械化されたスキャンシステム。完全に鎮静されたマウスを加熱されたプラットフォーム(緑色で表示)に置き、走査プローブを精密可動アームに取り付けた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスの準備と超音波スキャン 。 (A)麻酔導入。(B)動物を加熱されたプラットフォームに固定し、麻酔を維持します。(C)フリーハンド方式による超音波スキャン。(D)電気加熱ブランケット上での動物の回収。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:同所性ATC腫瘍マウスモデルの超音波画像。 緑の線は気管を区切る、赤い線はATC腫瘍を区切る、黄色の線はストラップの筋肉を区切る。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:腫瘍サイズの計算。 腫瘍サイズは、前後直径(オレンジ色の線)に左から右の腫瘍直径(白線)を乗じて計算した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マウスモデルにおける同所性ATC増殖の縦断的分析 。 (A)右甲状腺葉。(B)左甲状腺葉。(C)甲状腺全体。各曲線は、4回測定された1匹の動物に対応する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 日付 | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| ラベル | 場所 | 腫瘍サイズ(mm2) | |||
| P71 | 右 | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| 左 | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| トータル | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| P85 | 右 | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| 左 | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| トータル | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| P89 | 右 | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| 左 | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| トータル | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| P92 | 右 | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| 左 | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| トータル | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
表1:腫瘍サイズ測定に関するデータ。 「P71」、「P85」、「P89」、および「P92」はマウスの標識を表す。右:右側の腫瘍サイズ。左:左側の腫瘍サイズ。合計:両側性腫瘍を追加することによる総腫瘍サイズ。最初の行には、腫瘍のサイズ(mm2:平方ミリメートル)と測定日が含まれています。
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Discussion
このプロトコルは、高解像度超音波検査を使用して、遺伝子操作されたマウスモデルで同所性ATC腫瘍を分析します。遺伝子型が TPO-cre/ERT2のトランスジェニックモデル。 ブラフCA/重量;Trp53 Δex2-10/Δex2-10は当研究室で開発されました。動物はブラフV600E を過剰発現し、Trp53を欠いています。動物にタモキシフェンを腹腔内注射すると、約1ヶ月後に腫瘍が増殖します10。腫瘍は急速に成長し、50日以内に測定可能なサイズに達します。このプロトコルは、腫瘍の成長を4か月間モニターするために使用されました。
超音波検査は、肝臓、甲状腺、胎児など、人間の組織と同様の体の位置を占める組織をイメージングするためにマウスで信頼性があることが証明されています9。ヒトと同様に、マウス甲状腺は甲状腺軟骨および気管13の両側に位置する。提示されたプロトコルは、甲状腺のATC腫瘍の分析を可能にし、腫瘍の開始、進行、および治療への反応の研究を可能にします。マウスモデルの甲状腺腫瘍は非常に大きく成長し、気管とストラップの筋肉の周りのスペースを占めていました。彼らは、卵胞構造と同様に、超音波で固体嚢胞性の特徴を示しました。超音波検査の非侵襲性、短期間、および利便性は、磁気共鳴画像法やコンピューター断層撮影法よりも多くの研究グループにとって魅力的である可能性があります8。長い鎮静期間や麻酔期間が不要なため、超音波検査の利点は縦断的研究を容易にする可能性があります。
スキャン中に十分な超音波ゲルを適用することは、イメージングに影響を与える可能性のあるエアポケットを排除し、無呼吸につながる可能性のある過度の圧縮を回避するために重要です。このプロトコルは、フリーハンドスキャンを実行する経験豊富な超音波検査の専門家によって私たちの研究室で日常的に実行されます。フリーハンドスキャンは、動物の状態に応じて超音波プローブの位置を柔軟に調整できるため、機械化されたプラットフォームよりも好まれます。機械化されたプラットフォームを使用する場合、動物への過度の圧縮を防ぐためにx座標とy座標を調整する必要があります。結果は、腫瘍が早期にゆっくりと成長したことを示しましたが、60日目から、腫瘍は劇的に速く発達し、最大腫瘍サイズは38.188 mm2でした。主な死因は後期の窒息でした。臨床試験では、ATC腫瘍の希少性のために、発生の過程とメカニズムを観察するのに十分なサンプルを収集することは困難です。ATC病変の方法は、マウスモデルでよりよく観察することができました。将来的には、これらのサンプルは臨床治療のためのより多くの情報を提供する可能性があります。
超音波イメージングの1つの制限は、ATC腫瘍のエコー源性が周囲の組織のエコー源性に似ている可能性があるため、特に1つの静止画像で腫瘍の縁が不明瞭になることです。ただし、これらのマージンは動的コントラストを使用して識別できるため、この研究では動的画像を保存して後で分析しました。最も正確で信頼性の高い結果を得るには、甲状腺と腫瘍全体をさまざまな角度から視覚化するために、プローブをさまざまな方法で配置する必要があります。この研究では、1人の超音波検査者だけがすべての測定を行ったため、異なる検査者間の信頼性測定は評価されませんでした。
このプロトコルは、動物のATC腫瘍を特定および測定するための高解像度超音波検査の使用を容易にし、癌の発症、進行、および治療の詳細な研究への道を開く可能性があります。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、公的、商業的、または非営利の資金提供機関から特定の助成金を受け取っていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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