Summary
Denne protokollen beskriver høyfrekvent ultralyd for å visualisere hele musens skjoldbruskkjertel og overvåke veksten av anaplastisk skjoldbruskkarsinom.
Abstract
Anaplastisk skjoldbruskkarsinom (ATC) er assosiert med dårlig prognose og kort median overlevelsestid, men ingen effektiv behandling forbedrer resultatene signifikant. Genetisk utviklede murine modeller som etterligner ATCs progresjon kan hjelpe forskere til å studere behandlinger for denne sykdommen. Krysser tre forskjellige genotyper av mus, en TPO-cre/ERT2; BrafCA / wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgen ATC-modell ble utviklet. ATC murine modellen ble indusert ved en intraperitoneal injeksjon av tamoksifen med overekspresjon av BrafV600E og delesjon av Trp53, og tumorene ble generert innen ca. 1 måned. Høyoppløselig ultralyd ble brukt for å undersøke tumorinitiering og progresjon, og den dynamiske vekstkurven ble oppnådd ved å måle tumorstørrelsene. Sammenlignet med magnetisk resonansavbildning (MR) og computertomografiskanning har ultralyd fordeler ved å observere ATC-murinmodellen, for eksempel å være ikke-invasiv, bærbar, i sanntid og uten strålingseksponering. Høyoppløselig ultralyd er egnet for dynamiske og flere målinger. Imidlertid krever ultralydundersøkelse av skjoldbruskkjertelen hos mus relevant anatomisk kunnskap og erfaring. Denne artikkelen gir en detaljert prosedyre for å bruke høyoppløselig ultralyd for å skanne svulster i den transgene ATC-modellen. I mellomtiden er ultralydparameterjustering, ultralydsskanningsferdigheter, anestesi og gjenoppretting av dyrene og andre elementer som trenger oppmerksomhet under prosessen, oppført.
Introduction
Selv om anaplastisk skjoldbruskkarsinom (ATC) står for færre enn 2% av skjoldbruskkreftene, forårsaker det mer enn 50% av skjoldbruskkreftrelaterte dødsfall årlig. Median overlevelsestid etter diagnose med ATC er bare ca. 6 måneder, og det finnes ingen behandlinger som signifikant forbedrer overlevelsen 1,2.
Sjeldenheten av ATC har hemmet forskningen som studerer hvordan sykdommen begynner og aggressivt utvikler seg. Genetisk konstruerte musemodeller som etterligner sykdommen har nylig blitt tilgjengelige, noe som gir innsikt i sykdommen og dens respons på mulige behandlinger 3,4,5. Slike studier krever nøyaktig tumoravbildning for målinger og overvåking, som vanligvis utføres ved hjelp av magnetisk resonansbilder, computertomografi eller høyoppløselig ultralyd 6,7. Ultralyd har vært mye brukt i museorganer. Det har fordeler i forhold til magnetisk resonansavbildning og computertomografi siden det kan utføres i sanntid og ikke utsetter motivet for stråling, og det nødvendige utstyret er lite nok til å være bærbart 8,9. Imidlertid er studier på kontinuerlig overvåking av ATC-vekst ved hjelp av ultralyd sjeldne; Derfor utforsker dette arbeidet nytten av ultralyd i denne sammenhengen.
Her presenteres en protokoll for bruk av høyoppløselig ultralyd for nøyaktig skanning, overvåking og måling av svulster i en musemodell av ATC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende studien ble utført med godkjenning fra Animal Care and Use Committee ved Sichuan University. TPO-cre/ERT2; BrafCA / wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgene mus10 ble brukt i denne studien (se materialfortegnelse). Protokolltrinnene kan endres for forskjellige dyrearter om nødvendig. Tolv mus, inkludert seks hunner og seks hanner, med en gjennomsnittsalder på 93 dager, ble brukt her.
1. Eksperimentell forberedelse
- Slå på ultralydsystemet (se Materialfortegnelse) og opprett en ny mappe for å ta bildene og samle inn dataene. Velg 40 MHz linjesonde og klikk på overfladisk vevsmønster for å aktivere den overfladiske vevstransduseren. Bruk "B-mode" for avbildning av skjoldbruskkjertelen (figur 1A).
MERK: B-modus er den grunnleggende ultralydbildemodusen. Utseendet til ultralydbilder er avhengig av de fysiske interaksjonene av lyd med vevene i kroppen. B-modusbilder produseres som gråbilder11,12. - Hold musene i bestemte bur med fri tilgang til mat og vann. Plasser buret på en supplerende varmeenhet (se Materialtabell) for å sikre termoregulering.
- Sørg for tilstrekkelig isofluran i fordamperen ogO2 i tanken. Hvis forsyningene er utilstrekkelige, bytt ut tankene med nye.
- Rengjør dyreavbildningsplattformen med sterilt saltvann og slå på varmeknappen. Kontroller at temperaturen er 38-40 °C før du plasserer dyret på plattformen (figur 1C).
2. Dyrforberedelse for avbildning
- Slå på isofluran fordamper. Overfør musen fra buret til bedøvelsesboksen.
- Bedøv dyret ved hjelp av en blanding av 1%-2% isofluran fra fordamperen og oksygen som strømmer ved 0,8 l / min.
- Påfør hårfjerningskrem fra brystet til nakken, vent 30 sekunder, og tørk deretter kremen og pelsen helt. Skyll området og den omkringliggende pelsen grundig med varm steril saltvann.
- Plasser det bedøvede dyret på den oppvarmede plattformen. Dekk snuten med en nesekjegle koblet til anestesiutløpet (figur 2A, B).
MERK: Musen må være helt bedøvet innen 1-2 min. Hvis dyret fortsatt er aktivt, utfør langvarig isofluraninduksjon til dyret ikke lenger viser en pedalrefleks. Sørg for at dyret puster stabilt. - Under avbildning må du overvåke musens hjertefrekvens gjennom den oppvarmede plattformen.
MERK: Ultralydbildesystemet er utstyrt med en pulsmåler. - Bruk tape for å feste musens lemmer til den oppvarmede plattformen, med dyret i liggende stilling. Sørg for at nesekjeglen er stabilt plassert med en konstant bedøvelsesgasstrøm (1,5 l/min).
- Beskytt øynene ved å bruke oftalmisk salve.
3. Tumor avbildning
- Juster bildesystemet for å optimalisere oppløsningen. Sett opp følgende parametere: todimensjonal forsterkning, 25-30 dB; bildedybde, 10 mm; antall brennviddesoner, 3; og senter, 3-6 mm.
MERK: For denne studien ble en 40 MHz sonde brukt. B-modus ble spesifisert for datainnsamling. - Påfør ultralydgel liberalt (se materialtabellen) på området med bar hud.
- Hold sonden og sett den i kontakt med ultralydgelen på brystet, og skann deretter fra brystet mot nakken for å finne skjoldbruskkjertelen (figur 2C).
MERK: Påfør trykk forsiktig mens du skanner; Overdreven trykk på dyrets nakke kan forårsake gisping eller apné. Denne protokollen ble utviklet basert på håndholdt skanning, men mekanisert skanning kan også utføres ved hjelp av en maskin for å lede sonden, for eksempel en dyrebildeplattform som beveger seg langs x- og y-aksene. - Skann opp og ned for å identifisere svulstens grenser og vurdere dens størrelse og form.
MERK: En sunn skjoldbrusk vises vanligvis som en hypoekogen, homogen struktur foran luftrøret. Anaplastiske svulster gjør at skjoldbruskkjertelen ser mye større ut, noe som lett kan identifiseres ved nakkeskanning (figur 3). - Identifiser ATC-svulstene fra luftrøret og stroppemusklene avhengig av anatomisk plassering og ultralydekko.
MERK: Stroppemusklene er plassert foran skjoldbruskkjertelen og luftrøret, samt bak skjoldbruskkjertelen. Ultralydekkoet av stroppemusklene virker høyere enn ATC, mens demping eksisterer bak luftrøret13.- Basert på inntrykket av den totale svulsten, bekreft bildeseksjonen med den største venstre til høyre tumordiameteren. Trykk på fryseknappen , og mål anteroposterior og venstre til høyre tumordiametre ved hjelp av ultralydkaliperen.
MERK: Den anteroposterior diameteren må måles vinkelrett på tumordiameteren fra venstre til høyre (figur 4). Tumorstørrelsen til ATC ble beregnet ved å multiplisere den anteroposterior diameteren med venstre til høyre tumordiameter14. Siden størrelsen på svulstene på venstre og høyre side var inkonsekvent, ble hver side av svulstene beregnet separat. Den totale størrelsen på svulstene ble oppnådd ved å legge til de bilaterale svulstene. Størrelsene ble registrert for å observere vekstkurven til ATC.
- Basert på inntrykket av den totale svulsten, bekreft bildeseksjonen med den største venstre til høyre tumordiameteren. Trykk på fryseknappen , og mål anteroposterior og venstre til høyre tumordiametre ved hjelp av ultralydkaliperen.
- Lagre opptaket som en cine-loop, noe som letter gjennomgangen av de valgte bildene.
4. Dyr utvinning
- Etter skanning, tørk ultralydgelen og fjern fastholdelsesbåndet fra dyrets lemmer.
- Plasser musen på den supplerende varmeenheten (trinn 1.2). Legg dyret på siden (figur 2D).
- Etter at musen gjenoppretter (~ 5 min), overfør den tilbake til buret.
- Rengjør ultralydsystemet, sonden og plattformen med en myk klut og isopropylalkohol eller glutaraldehydservietter.
- Slå av bildesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjennomsnittlig høyre ATC-størrelse i begynnelsen av studien var 4,867 mm 2, og gjennomsnittlig venstre ATC-størrelse var 5,189 mm2. Ved fjerde måling hadde gjennomsnittlig høyre ATC-størrelse vokst til 11,844 mm 2, mens tumorstørrelsen i venstre hadde vokst til 9,280 mm2. Den totale ATC-størrelsen økte fra 10.057 mm 2 til 15.843 mm2. I den senere fasen av studien vokste ATC raskt. Når det gjelder musen merket "P92" (tabell 1), hadde tumorstørrelsen på den fjerde målingen vokst til nesten fire ganger større enn størrelsen på den første målingen. De representative målingene av fire mus og vekstkurvene er vist i figur 5.
Høyfrekvent ultralyd er den avbildningsmodaliteten som oftest brukes til å undersøke skjoldbruskkjertelen hos mennesker, og teknikken virker også godt egnet for mus. Det kan visualisere hele musen skjoldbruskkjertelen og detaljer om skjoldbrusk lesjon vekst. Denne protokollen for å anvende metoden for høyfrekvent ultralyd kan brukes til å nøyaktig skanne, overvåke og måle svulster i en genetisk utviklet musemodell av ATC.
Figur 1: Utstyr brukt i denne studien . (A) Det høyfrekvente ultralydsystemet. (B) Laboratorieutstyr: (1) Elektrisk varmeteppe. (2) Tørkepapir. (3) Ultralyd gel. (4) Isofluran fordamper. (5) Hårfjerningskrem. (6) Bomullspinner. (7) Saks. (8) Selvklebende tape. (9) Medisinske hansker. (10) Kammer for anestesiinduksjon. (11) Anestesi system. (C) Et mekanisert skanningssystem for ultralydavbildning. Den fullstendig bedøvede musen ble plassert på den oppvarmede plattformen (vist i grønt), og skannesonden ble festet til en presis bevegelig arm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Museforberedelse og ultralydundersøkelse. (A) Anestesiinduksjon. (B) Feste dyret på den oppvarmede plattformen og vedlikehold av anestesi. (C) Ultralydsskanning med frihåndsmetode. (D) Gjenvinning av dyret på det elektriske varmeteppet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Ultralydbilder av en ortotopisk ATC-tumormusemodell. Den grønne linjen avgrenser luftrøret, den røde linjen avgrenser ATC-svulsten, og den gule linjen avgrenser stroppemuskelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Beregning av tumorstørrelse. Tumorstørrelsen ble beregnet ved å multiplisere anteroposterior diameter (oransje linje) med venstre mot høyre tumordiameter (hvit linje). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Longitudinell analyse av ortotopisk ATC-vekst i musemodellen . (A) Høyre thyreoidealapp. (B) Venstre skjoldbruskkjertellapp. (C) Hele skjoldbruskkjertelen. Hver kurve tilsvarer ett dyr målt fire ganger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Daddel | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| Etikett | Plassering | Tumorstørrelse (mm2) | |||
| P71 | Høyre | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| Venstre | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| total | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| P85 | Høyre | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| Venstre | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| total | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| P89 | Høyre | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| Venstre | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| total | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| P92 | Høyre | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| Venstre | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| total | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
Tabell 1: Data om måling av tumorstørrelse. "P71", "P85", "P89" og "P92" representerer etikettene til musene. Høyre: svulststørrelsen på høyre side. Venstre: svulststørrelsen på venstre side. Totalt: den totale tumorstørrelsen ved å legge til de bilaterale svulstene. Den første linjen inkluderer tumorstørrelsen (mm2: kvadrat millimeter) og datoen for målingene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen bruker høyoppløselig ultralyd for å analysere ortotopiske ATC-svulster i en genetisk konstruert musemodell. Den transgene modellen, med en genotype av TPO-cre/ERT2; BrafCA / wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10, ble utviklet i vårt laboratorium. Dyrene overuttrykker BrafV600E og mangler Trp53; Injeksjon av dyrene intraperitonealt med tamoxifen fører til tumorvekst etter ca. 1 måned10. Svulstene vokser raskt og når en målbar størrelse innen 50 dager. Denne protokollen ble brukt til å overvåke tumorvekst i 4 måneder.
Ultralyd har vist seg pålitelig hos mus for avbildning av vev som opptar lignende kroppssteder som menneskelig vev, inkludert leveren, skjoldbruskkjertelen og fosteret9. Som hos mennesker er musens skjoldbruskkjertel plassert på hver side av skjoldbruskkjertelen, brusk og luftrøret13. Den presenterte protokollen tillater analyse av ATC-svulster i skjoldbruskkjertelen, noe som muliggjør studier av tumorinitiering, progresjon og respons på behandlinger. Skjoldbruskkjertelsvulstene i musemodellen vokste seg ganske store og okkuperte plassen rundt luftrøret og stroppemuskulaturen. De viste solid-cystiske egenskaper i ultralyd, som ligner follikulære strukturer. Den ikke-invasivitet, kort varighet og bekvemmelighet av ultralyd kan gjøre det mer attraktivt for mange forskningsgrupper enn magnetisk resonansavbildning eller computertomografi8. Siden lange sedasjons- eller anestesiperioder er unødvendige, kan ultralydens fordeler lette longitudinelle studier.
Bruk av tilstrekkelig ultralydgel under skanning er avgjørende for å eliminere luftlommer som kan påvirke bildebehandling og for å unngå overdreven kompresjon som kan føre til apné. Denne protokollen utføres rutinemessig i vårt laboratorium av erfarne ultralydspesialister som utfører frihåndsskanning. Frihåndsskanning foretrekkes fremfor en mekanisert plattform fordi det gir fleksibilitet i å justere ultralydsondens posisjon i henhold til dyrets tilstand. Ved bruk av en mekanisert plattform må x- og y-koordinatene justeres for å forhindre overdreven kompresjon på dyret. Resultatene viste at svulstene vokste langsomt i den tidlige perioden, men fra dag 60 utviklet svulstene seg dramatisk raskere, og maksimal tumorstørrelse var 38.188 mm2. Den viktigste dødsårsaken var kvelning i sen fase. I kliniske studier, på grunn av sjeldenhet av ATC-svulster, er det vanskelig å samle nok prøver til å observere prosessen og utviklingsmekanismen. Metoden for ATC-lesjoner kan bedre observeres i murinmodellen. I fremtiden kan disse prøvene gi mer informasjon for kliniske behandlinger.
En begrensning av ultralydavbildning er at ekkogeniteten til ATC-svulster kan ligne den i det omkringliggende vevet, og dermed skjule tumormarginer, spesielt i ett stillbilde. Imidlertid kan disse marginene identifiseres ved hjelp av dynamisk kontrast, så dynamiske bilder ble lagret i denne studien for senere analyse. For å sikre de mest nøyaktige og pålitelige resultatene, må sonden plasseres på ulike måter for å visualisere hele skjoldbruskkjertelen og svulsten fra forskjellige vinkler. I denne studien utførte bare en ultralydograf alle målingene, så reliabilitetsmålinger mellom forskjellige sensorer ble ikke evaluert.
Denne protokollen kan lette bruken av høyoppløselig ultralyd for lokalisering og måling av ATC-svulster hos dyr, og dermed bane vei for detaljerte studier av kreftutbrudd, progresjon og behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Denne forskningen mottok ingen spesifikk tilskudd fra offentlige, kommersielle eller ikke-for-profit finansieringsorganer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527 (2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731 (2017).
- Renault, G., et al.
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M.
- Aldrich, J. E.
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
