Summary
I dati pubblicati relativi alle concentrazioni di peptidi correlati al gene della calcitonina (CGRP) nel plasma umano sono incoerenti. Queste incongruenze possono essere dovute alla mancanza di una metodologia standardizzata e convalidata per quantificare questo neuropeptide. Qui, descriviamo un protocollo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) convalidato per purificare e quantificare CGRP nel plasma umano.
Abstract
Il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) è un neuropeptide vasoattivo che svolge un ruolo putativo nella fisiopatologia dell'emicrania e può essere un candidato per lo status di biomarcatore. CGRP viene rilasciato dalle fibre neuronali al momento dell'attivazione e induce infiammazione neurogena sterile e vasodilatazione arteriosa nel sistema vascolare che riceve l'innervazione efferente del trigemino. La presenza di CGRP nel sistema vascolaristico periferico ha stimolato indagini per rilevare e quantificare questo neuropeptide nel plasma umano utilizzando saggi proteomici, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Tuttavia, la sua emivita di 6,9 minuti e la variabilità nei dettagli tecnici dei protocolli di analisi, che spesso non sono completamente descritti, hanno prodotto dati ELISA CGRP incoerenti in letteratura. Qui viene presentato un protocollo ELISA modificato per la purificazione e la quantificazione del CGRP nel plasma umano. Le fasi procedurali comprendono la raccolta e la preparazione del campione, l'estrazione utilizzando un assorbente polare come mezzo di purificazione, ulteriori fasi per bloccare il legame non specifico e la quantificazione tramite ELISA. Inoltre, il protocollo è stato validato con spike e recupero e linearità degli esperimenti di diluizione. Questo protocollo validato può teoricamente essere utilizzato per quantificare le concentrazioni di CGRP nel plasma di individui non solo con emicrania, ma anche con altre malattie in cui CGRP può svolgere un ruolo.
Introduction
Il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) è un neuropeptide di 37 aminoacidi presente nelle fibre neuronali con localizzazione perivascolare e nei tessuti non neuronali. Le due forme di CGRP, α- e β-CGRP, condividono più del 90% di omologia e condividono funzioni fisiologiche; tuttavia, αCGRP si trova nel sistema nervoso centrale e periferico, mentre βCGRP si trova nel sistema nervoso enterico 1,2. Dopo l'attivazione dei nocicettori e l'esocitosi calcio-dipendente, CGRP viene rilasciato dai neuroni, inducendo un'infiammazione neurogena sterile che coinvolge vasodilatazione arteriosa e stravaso di proteine plasmatiche 3,4,5,6,7. Da qui, CGRP appare nei vasi postcapillari e può essere un biomarcatore per le malattie che causano l'attivazione nocicettiva afferente, come l'emicrania 8,9,10,11. Da notare che la CGRP è stata anche implicata nel COVID-19 attraverso il suo ruolo nell'angiogenesi e nella modulazione immunitaria e può prevedere un'evoluzione sfavorevole della malattia12,13. Pertanto, un protocollo per la quantificazione accurata del CGRP nel plasma umano potrebbe avere un valore ampio.
La maggiore attenzione è stata forse data al ruolo di CGRP nell'emicrania. Sulla base di studi preclinici e clinici, CGRP è stato proposto come un possibile biomarcatore per l'emicrania e come bersaglio per il trattamento 3,4,5,6,7,8,9,10. Alcuni studi hanno trovato un aumento di CGRP in coorti con emicrania episodica rispetto ai partecipanti di controllo10,14,15. Il successo degli inibitori CGRP negli studi clinici per il trattamento dell'emicrania sembra implicare un elevato CGRP come fattore causale per l'emicrania. Tuttavia, non tutti gli investigatori hanno confermato questi risultati16,17,18,19. Inoltre, il ruolo di CGRP nei sintomi non cefalei dell'emicrania deve ancora essere chiarito; il lavoro attuale è stato motivato dal desiderio di comprendere il ruolo del CGRP nei sintomi vestibolari dell'emicrania.
Dati immunologici CGRP incoerenti in letteratura potrebbero essere dovuti a diversi motivi. In primo luogo, l'emivita di CGRP nel sistema vascolare periferico è di 6,9 min20, a causa dell'attività delle proteasi serina 21, degli enzimi che degradano l'insulina e di altre metalloproteasi 22, delle endopeptidasi neutre 23 e dell'enzima di conversione dell'endotelina-1 24. In secondo luogo, i dettagli tecnici variabili dei saggi immunologici utilizzati per quantificare CGRP non sono completamente descritti in tali studi. Infine, la mancanza di standardizzazione della metodologia di dosaggio immunologico complica ulteriormente il quadro.
Questo articolo descrive un protocollo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) modificato che consente la purificazione e la quantificazione accurata di α e βCGRP nel plasma umano. Gli anticorpi del kit non sono cross-reattivi con amilina, calcitonina o sostanza P. Questo protocollo è stato sottoposto agli esperimenti di validazione necessari, come spike e recupero e linearità di diluizione, i cui dati sono presentati qui. Tale protocollo ELISA CGRP sottoposto a validazione non è stato precedentemente completamente descritto in letteratura. Questo protocollo può essere utilizzato per quantificare CGRP nel plasma umano nel contesto dell'emicrania e cardiologica2,25, dermatologica 26, ostetrica 27, reumatologica28,29, muscoloscheletrica 30,31, endocrina 32,33 e malattie virali 12,13 in cui CGRP è stato implicato.
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Protocol
Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando campioni di plasma umano da individui consenzienti con l'approvazione del Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).
1. Raccolta e preparazione dei campioni
- Raccogliere 5 ml di sangue intero dalla vena antecubitale con metodi di venipuntura standard34 in una provetta di raccolta dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) vacutainer da 6 ml.
- Aggiungere 0,5 mL di aprotinina (10.000 KIU/mL) inibitore competitivo della proteasi serina al tubo dopo la raccolta per bloccare la lisi del peptide bersaglio. Capovolgere il tubo 10 volte per consentire all'aprotinina di mescolarsi adeguatamente con il sangue. Successivamente, conservare i tubi sul ghiaccio fino al passaggio successivo.
- Centrifugare la provetta a 604 x g per 4 minuti a 4 °C entro 60 minuti dalla raccolta del sangue.
- Togliere la frazione plasmatica con una pipetta e trasferire a 2 mL di crioviali sterili a fondo tondo.
- Conservare immediatamente i crioviali a -80 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Estrazione dei campioni di plasma
- Posizionare una cartuccia di estrazione all'interno di una provetta conica da centrifuga da 15 mL con le creste esterne della cartuccia sostenute dalle creste esterne del tubo.
- Attivare la cartuccia facendo passare prima 5 ml di metanolo al 100% e poi 10 ml di acqua ultrapura attraverso la cartuccia.
- Quando il fluido viene fatto passare attraverso la cartuccia attraverso il flusso guidato dalla gravità, si raccoglierà nel tubo.
- Eliminare il liquido in eccesso mentre si accumula per assicurarsi che il fluido non inghiottisca la cartuccia.
- Assicurarsi che la cartuccia non si asciughi durante il corso dell'esperimento.
- Diluire 250 μL di plasma con 750 μL di acido acetico al 4%.
- Far passare lentamente 1 mL di soluzione di plasma e acido acetico attraverso la cartuccia.
NOTA: questo passaggio dovrebbe richiedere circa 30 s tramite flusso guidato dalla gravità per ogni millilitro passato. - Lavare la cartuccia con 10 ml di acido acetico al 4%. Come fatto in precedenza, buttare via il liquido in eccesso mentre si accumula per assicurarsi che il fluido non inghiottisca la cartuccia.
- Dopo che l'ultima goccia di acido acetico è stata rilasciata dalla cartuccia, rimuovere la cartuccia dal tubo e posizionarla in una nuova provetta conica da centrifuga da 15 ml.
- Preparare una soluzione 10:1 di metanolo al 100% e acido acetico al 4% mescolando 2,7 ml di acido acetico al 4% e 0,3 ml di metanolo al 100%. Utilizzare questo per eluire il CGRP facendo passare questa soluzione attraverso la cartuccia 1 mL alla volta. Pausa per 25 minuti tra ogni millilitro di soluzione passata. NON buttare via l'eluente.
- Il tubo conterrà 3 ml di fluido eluito 25 minuti dopo il passaggio dell'ultimo millilitro della soluzione di metanolo e acido acetico. Introdurre ogni 1 mL di eluente in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL.
NOTA: Questo dovrebbe produrre tre tubi di microcentrifuga da ogni cartuccia. - Mettere ogni tubo in una mini centrifuga per 1 s per assicurarsi che tutto l'eluente sia sul fondo di ogni tubo.
- Essiccare tutti i campioni mediante centrifugazione sotto vuoto a 4 °C (impostata sulla funzione concentratore, per soluzioni acquose, a 1.400 giri/min; la forza g varia a seconda della posizione dei tubi e quindi varia da 130-250 x g).
NOTA: Il tempo impiegato dalla centrifuga sottovuoto per asciugare i campioni dipenderà dal tipo di provetta per microcentrifuga utilizzata. - Immediatamente prima di procedere alla procedura di analisi (fase 4.1), ricostituire il campione precedentemente essiccato con tampone enzimatico immunologico (EIA) (vedere Tabella dei materiali) scongelato a temperatura ambiente (RT) o 20 °C.
NOTA: il volume del tampone EIA utilizzato per ricostituire il campione essiccato deve essere uguale al volume originale del campione, ovvero 250 μL.
3. Preparazione della piastra ELISA - bloccaggio per limitare il legame non specifico
- Aggiungere 250 μL di tampone salino tris-buffered (TBS)/tampone bloccante la gelatina di pesce a ciascun pozzetto sulla piastra.
- Posizionare un foglio di copertura sopra la piastra e incubare per 2 ore a RT.
- Rimuovere il foglio di copertura e svuotare la piastra mediante capovolgimento o aspirazione utilizzando una pipetta multicanale. Quindi, asciugare il piatto su un tovagliolo di carta per eliminare qualsiasi traccia di liquido.
- Asciugare la piastra lasciando la piastra in una cappa a flusso laminare per 10 minuti.
- Dopo che la piastra è visibilmente asciutta, metterla in una busta di alluminio sigillata con una bustina essiccante in gel di silice e conservare la busta a -20 °C per 24 ore.
NOTA: Le piastre devono essere utilizzate entro 4 settimane dall'incubazione della piastra.
4. Prima della procedura di analisi
- Preparare i reagenti (tampone EIA, standard CGRP, controllo qualità CGRP, tracciante CGRP, tampone di lavaggio) secondo le istruzioni del kit. Preparare il reagente di Ellman solo dopo la fine del periodo di incubazione di 16-20 ore.
- Scongelare tutti i campioni e i reagenti in RT prima di eseguire il resto del protocollo.
5. Procedura di analisi
- Risciacquare ogni pozzetto nella piastra bloccata cinque volte con un tampone di lavaggio fornito in kit (300 μL/pozzetto). Per ogni risciacquo, mettere in pausa 30 s dopo aver posizionato il tampone di lavaggio nei pozzetti, quindi gettare il liquido o aspirare utilizzando una pipetta multicanale.
- Dopo il risciacquo finale, rimuovere tutto il tampone dai pozzetti mediante inversione (invertendo la piastra per espellere il liquido all'interno dei pozzetti) o aspirazione utilizzando una pipetta multicanale. Tamponare le ultime gocce su un tovagliolo di carta e picchiettare la piastra rovesciata fino a quando tutto il liquido è visibilmente rimosso dai pozzetti.
- Mettere da parte almeno due pozzi senza reagenti o tampone per essere noti come pozzi "vuoti". Quindi, mettere da parte almeno altri due pozzetti per il legame non specifico (NSB).
- Erogare 100 μL di tampone EIA in ciascun pozzetto NSB.
- Erogare 100 μL degli standard CGRP in duplice copia in pozzi appropriati.
- Erogare 100 μL di campioni (ricostituiti in tampone EIA) e controllo qualità in duplicato in appositi pozzetti.
- Erogare 100 μL di tracciante CGRP (anticorpo anti-CGRP attaccato all'acetilcolinesterasi) a ciascun pozzetto contenente NSB, standard CGRP, campioni e controllo qualità. Non dispensare tracciante ai pozzi "Blank".
- Coprire la piastra con un foglio di copertura trasparente, sigillando ciascun pozzetto in modo che i campioni e i reagenti in ciascun pozzetto non evaporino in modo significativo. Incubare la piastra per 16-20 ore a 4 °C.
- Al termine dell'incubazione, ricostituire il reagente di Ellman secondo le istruzioni del kit.
- Capovolgere la piastra per rimuovere tutto il liquido. Risciacquare ogni pozzetto (come descritto sopra) tre volte con 300 μL di tampone di lavaggio.
- Dopo il terzo risciacquo, rimuovere il liquido dalle piastre, posizionare la piastra su una piastra agitatrice e agitare a 120 giri / min per 2 minuti.
- Lavare il piatto altre tre volte. Dopo il risciacquo finale, rimuovere tutto il tampone dai pozzetti mediante inversione o aspirazione utilizzando una pipetta multicanale. Tamponare le ultime gocce di liquido su un tovagliolo di carta e picchiettare la piastra rovesciata fino a quando tutto il liquido è visibilmente rimosso dai pozzetti.
NOTA: i tre lavaggi aggiuntivi descritti in questo passaggio potrebbero non essere necessari se si utilizza una lavapiastre ELISA. - Erogare 200 μL di reagente di Ellman in ciascun pozzetto (esclusi i pozzetti "Blank").
- Coprire la piastra con un nuovo foglio di copertura e avvolgerla in un foglio di alluminio per evitare qualsiasi esposizione alla luce. Incubare al buio a RT per 1 ora.
- Assicurarsi che non vi sia liquido sul retro della piastra che possa confondere la lettura dello spettrofotometro strofinando il retro con un tovagliolo di carta asciutto.
- Leggere la piastra per l'assorbanza a 405 nm (colore giallo).
6. Analisi dei dati
- Calcolare l'assorbanza media per ogni "Blank", NSB, standard, controllo qualità e campioni.
- Sottrarre i valori medi di assorbanza NSB dai valori standard, controllo qualità e assorbanza del campione.
- Tracciare l'assorbanza sull'asse y e la concentrazione sull'asse x. Costruire una curva standard utilizzando un modello di regressione logistica a quattro parametri.
- Una volta costruita la curva, utilizzare l'equazione della curva per determinare le concentrazioni interpolate per il controllo qualità e i campioni, che possono essere letti sull'asse x.
NOTA: La curva standard è convalidata solo se la concentrazione interpolata calcolata per il controllo di qualità è entro il 25% della concentrazione prevista (di solito 125 pg/ml, ma vedere l'etichetta del flaconcino di controllo qualità).
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Representative Results
Ci sono diversi passaggi chiave nel protocollo che dovrebbero essere evidenziati. In primo luogo, l'aprotinina, un inibitore della proteasi serina, deve essere aggiunta ai campioni di sangue intero immediatamente dopo la raccolta per prevenire un'ulteriore degradazione enzimatica di CGRP. Le proteasi serina hanno dimostrato di svolgere un ruolo nel metabolismo della CGRP e uno studio precedente ha anche utilizzato l'aprotinina per quantificare la CGRP nell'uomo21,35. Se non vengono utilizzati inibitori della proteasi e la preparazione del campione richiede più di 60 minuti, ci si può aspettare una diminuzione dei livelli di CGRP dopo l'esecuzione di ELISA. In secondo luogo, l'estrazione in fase solida prima dell'ELISA concentra CGRP nell'eluente ed elimina le molecole potenzialmente interferenti dalla matrice plasmatica. Questa fase di estrazione aumenta la resa di CGRP negli esperimenti di spike e recupero (ulteriormente discusso nella prossima sezione). La centrifugazione sotto vuoto in una cella frigorifera dopo l'estrazione limita ulteriormente la perdita di CGRP. In terzo luogo, prima dell'ELISA, le piastre di microtitolazione devono essere bloccate utilizzando un buffer di blocco. Ciò consente l'adsorbimento passivo di proteine non specifiche nel tampone ai siti di legame rimanenti nelle piastre, riducendo così il segnale di fondo. Il blocco aiuta a ridurre i rendimenti irrealisticamente elevati di CGRP.
Gli esperimenti di spike e recupero determinano se il rilevamento CGRP è influenzato dalle differenze tra il diluente della curva standard (qui, tampone EIA) e la matrice del campione sperimentale (qui, plasma). Il plasma e/o il siero possono contenere molecole che bloccano il legame anticorpale al CGRP o degradano il peptide, interferendo così con la capacità del test di rilevare e quantificare accuratamente la concentrazione iniziale di CGRP. A tal fine, abbiamo aggiunto quantità note di CGRP ai campioni di plasma - la fase di "spiking" - e calcolato quanto CGRP è stato "recuperato" dopo l'estrazione e l'ELISA. Il materiale di riserva CGRP è stato ottenuto dal produttore e conservato in un congelatore a -20 °C fino all'uso.
Nella linearità della prova di diluizione, un campione viene diluito in serie e le concentrazioni di CGRP vengono calcolate per ogni diluizione. Se i campioni diluiti non presentano diminuzioni lineari appropriate della concentrazione di CGRP, ciò indicherebbe che il tampone EIA o il plasma interferiscono con la rilevazione di CGRP a determinate concentrazioni o che la curva standard non è accurata nell'intervallo interessato. Nell'eseguire l'esperimento di spike e recupero sopra descritto, abbiamo diluito in serie i campioni "spiked"; abbiamo picchiato un campione di plasma per ottenere una concentrazione di CGRP di 200 pg / mL e successivamente diluito il campione a 100 pg / mL e poi 50 pg / mL.
I campioni di plasma di tre partecipanti senza storia di problemi cardiovascolari, respiratori o recenti mal di testa o sintomi neurologici sono stati aumentati con diverse concentrazioni di CGRP. Il protocollo è stato eseguito per questi campioni, oltre ai campioni di controllo senza picchi. La Figura 1 mostra un esempio di mappa delle piastre per il picco e il recupero e la linearità degli esperimenti di diluizione. È stato eseguito un adattamento logistico a quattro parametri per creare una curva standard che consentisse l'adattamento oltre l'intervallo lineare (Tabella 1 e Figura 2). I tassi di recupero sono stati calcolati per ciascun campione spiked e rientravano nell'intervallo accettabile (tabella 2). La linearità della diluizione è stata dimostrata nei campioni chiodati (Figura 3). La tabella 3 mostra i risultati ottenuti da un esperimento di spike e recupero non riuscito effettuato seguendo le istruzioni del fabbricante e prima dell'inclusione dei passaggi aggiuntivi per bloccare il binding non specifico. Questi dati mostrano tassi di recupero superiori al limite superiore del 125%, indicando la presenza di legami non specifici. Dopo aver aggiunto i passaggi nel protocollo per bloccare la piastra utilizzando un buffer di blocco (passaggi 3.1-3.5), siamo stati in grado di ridurre questo effetto e ottenere valori di recupero accettabili (Tabella 2). In tre pazienti senza emicrania o sintomi vestibolari, abbiamo scoperto che la concentrazione media di CGRP nel plasma era 1,68 ± 0,13 pg / ml. Gli esperimenti futuri dovrebbero mirare a utilizzare la presente metodologia su una scala più ampia di pazienti di controllo.
Figura 1: Esempio di mappa delle lastre. Ogni piastra dovrebbe contenere standard, campioni, spazi vuoti e pozzetti NSB, tutti in duplicato o triplice copiato. I pozzetti vuoti non dovrebbero contenere liquidi e i pozzetti NSB dovrebbero contenere tampone immunoenzimatico brevettato, anticorpi secondari legati all'enzima e reagente di Ellman. I valori medi di assorbanza per i pozzi NSB devono essere sottratti dai valori di assorbanza dello standard prima di creare la curva standard. I valori medi di assorbanza per i pozzi NSB devono essere sottratti anche dai valori di assorbanza dei campioni, prima di calcolare la percentuale di recupero. Non vi è alcun effetto della posizione della piastra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Esempio di curva standard di regressione logistica a quattro parametri (4PL). Questa curva standard è matematicamente descritta da un'equazione in una forma simile a quella vista nella Tabella 1. Una curva di regressione 4PL è più adatta ai sistemi biologici rispetto alle curve lineari. Questa curva ed equazione vengono utilizzate per interpolare controlli di qualità e campioni sulla stessa piastra su cui è stato creato lo standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Linearità del grafico delle linee di diluizione che mostra i campioni aumentati a 200 pg/mL, quindi diluiti in serie 1:2 e 1:4. Questi dati dimostrano la linearità su un'ampia gamma di diluizioni, indicando che il metodo di analisi è accurato in un'ampia gamma di concentrazioni di CGRP. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Parametro | Valore |
| X50 | 294.75 |
| Equazione |  |
| Forma dell'equazione |  |
Tabella 1: Esempio di equazione della curva standard di regressione logistica a quattro parametri (4PL) con titoli X50. Una curva di regressione 4PL si adatta alla complessità osservata nei sistemi biologici. Questa curva è stata utilizzata per analizzare i risultati dell'ELISA, in quanto è più adatta della regressione lineare.
| Assorbanza (OD) | Concentrazione interpolata (pg/mL) | Rendimento percentuale | |
| Controllo senza spike | -0.0434 | Non cade sulla curva (ad esempio, ~0) | |
| Spiked a 200 pg/mL | 0.2712 | 214,7 ± 23,4 | 107.40% |
| Spiked a 100 pg/mL | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| Spiked a 50 pg/mL | 0.0205 | 55,1 ± 12,65 | 110.20% |
Tabella 2: Risultati di un esperimento di picco e recupero riuscito di tre partecipanti di controllo a causa della mancanza di estrazione in fase solida e blocco della piastra. La percentuale di resa per i campioni spiked è scesa tutti entro il 20% della resa ideale del 100%, indicando che la rilevazione CGRP non è influenzata dalla matrice campione sperimentale del plasma.
| Assorbanza (OD) | Concentrazione interpolata (pg/mL) | Rendimento percentuale | |
| Controllo senza spike | -0.2087 | Non cade sulla curva (ad esempio, ~0) | |
| Spiked a 200 pg/mL | 2.371 | 264,2 ± 104 | 132.10% |
| Spiked a 100 pg/mL | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| Spiked a 50 pg/mL | 0.3218 | 80,55 ± 4,54 | 161.10% |
Tabella 3: Risultati di un esperimento di picco e recupero infruttuoso di tre partecipanti di controllo a causa della mancanza di blocco delle piastre. La percentuale di resa per i campioni chiodati è scesa ben al di sopra del limite superiore del 120%, indicando che il test potrebbe essere danneggiato da NSB. Dopo aver ottenuto questi risultati, abbiamo aggiunto i passaggi 3.1-3.5 nel protocollo per bloccare NSB sulla piastra prima del test.
| Assorbanza (OD) | Concentrazione interpolata (pg/mL) | Rendimento percentuale | |
| Controllo senza spike | 0.0401 | 12.93 | |
| Spiked a 100 pg/mL | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| Spiked a 50 pg/mL | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| Spiked a 25 pg/mL | 0.0007 | 0,2177±6,43 | 0.87% |
Tabella 4: Risultati di un esperimento di picco e recupero infruttuoso di tre partecipanti al controllo. La percentuale di resa per i campioni chiodati è scesa ben al di sotto del limite inferiore dell'80%, indicando che era necessaria un'ulteriore ottimizzazione per affrontare i possibili processi di degradazione e di legame competitivi. Questi risultati provengono dal test ELISA competitivo di un altro produttore, con un limite inferiore di rilevazione di 2,23 pg / mL, e cv intra-test < 10% e cv inter-test < 12%.
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Discussion
Questo articolo descrive un protocollo convalidato che consente la rilevazione e la quantificazione di CGRP nel plasma umano. Questo protocollo è stato sintetizzato dopo che i kit commerciali CGRP ELISA sono stati trovati per non quantificare accuratamente questa molecola. Dopo aver stabilito un protocollo di preparazione del campione e una curva standard valida, gli esperimenti di spike e recupero e linearità della diluizione hanno mostrato che la percentuale di recuperi era molto più bassa del previsto. Risultati simili sono stati trovati utilizzando un diverso kit commerciale CGRP ELISA (Tabella 4). Per riferimento, il recupero standard ampiamente accettato è 80-120%36. Questi risultati possono suggerire la presenza di attività proteasi che degrada CGRP21,22,23,24, altre molecole che si legano a CGRP, limitando così la sua disponibilità per il legame agli anticorpi della piastra, o il legame competitivo di proteine non bersaglio agli anticorpi della piastra.
Per controllare questi possibili fattori confondenti, è stato ottimizzato un protocollo di estrazione per purificare il plasma attraverso l'estrazione con un assorbente proprietario prima dell'ELISA. Questo assorbente apparentemente isola molecole polari come CGRP. Per determinare l'efficacia dell'estrazione prima dell'ELISA, i campioni di plasma umano hanno raggiunto concentrazioni note di CGRP quando i controlli positivi sono stati sottoposti a estrazione e quindi ELISA. Questi campioni a spillo hanno prodotto solo ~ 50% -60% di recupero. Questi risultati hanno indicato che il CGRP aggiunto esogenamente non viene rilevato nel plasma, come ci si aspetterebbe.
Varie altre fasi del protocollo sono state ottimizzate: aggiunta di inibitore della proteasi serina a campioni di sangue intero prima della centrifugazione per inibire la degradazione21, abbassamento della temperatura della centrifugazione sottovuoto dopo l'estrazione e regolazione dei metodi di risospensione post-centrifugazione. Un esperimento di picco e recupero dopo questi cambiamenti ha rivelato concentrazioni irrealisticamente elevate di CGRP, un recupero superiore al 120% (Tabella 3). In modo rassicurante, anche valori più alti del previsto sono stati recentemente riportati dopo l'estrazione utilizzando un test simile di Messlinger et al.37, indicando che questo rimane un problema. Messlinger et al. riconoscono che il test dopo l'estrazione del plasma non riproduce concentrazioni realistiche di CGRP, senza fornire una ragione per questo fenomeno37.
Abbiamo ipotizzato che la capacità di legame residua sulle piastre di microtitolazione ELISA che causano il legame non specifico possa essere responsabile degli alti tassi di recupero. Prima dell'ELISA, la piastra è stata incubata con un tampone bloccante, tampone TBS/gelatina di pesce, per ridurre questa capacità di legame. Questo ulteriore passo ha portato a tassi di recupero più appropriati (tabella 2). Pertanto, le modifiche e le ottimizzazioni discusse sopra, incluso l'uso del buffer di blocco, rimangono passaggi critici nel protocollo. Questi passaggi hanno permesso un limite inferiore di rilevazione di 1,05 pg/mL, rispetto a quello del kit originale del produttore indicato come 2 pg/mL.
Per quanto riguarda la risoluzione dei problemi, il passaggio 2.10 richiede la centrifugazione sotto vuoto per asciugare l'eluente. È stato osservato che la lunghezza di questa fase varia a seconda del tipo di provetta per microcentrifuga in cui si trovano i campioni. Utilizzando le provette per microcentrifuga descritte nella Tabella dei Materiali, questa fase dura solitamente 5 ore. Tuttavia, quando vengono utilizzati tubi di microcentrifuga alternativi di volumi maggiori, questo passaggio potrebbe durare fino a 11 ore. Un'alternativa alla centrifugazione sottovuoto può essere la liofilizzazione o la liofilizzazione dei campioni, che richiederebbe il congelamento dei campioni dopo l'estrazione. Tuttavia, la liofilizzazione non è stata testata nella costruzione di questo protocollo. Inoltre, se si riscontrano concentrazioni sistematicamente inferiori al previsto di CGRP, si dovrebbe garantire che tutti i reagenti, in particolare gli anticorpi, siano scongelati a temperatura ambiente prima dell'uso. L'instabilità dei reagenti, come le soluzioni anticorpali e traccianti, potrebbe contribuire all'errore sistematico nel legame CGRP. Se la resa continua ad essere inadeguata, il legame anticorpale al CGRP può essere influenzato dall'acidità relativa dell'eluente (soluzione di metanolo e acido acetico), nonostante la ricostituzione con un tampone. In questo caso, una fase di rettifica del pH sarebbe un'aggiunta logica dopo la ricostituzione con tampone.
Le limitazioni di questo protocollo includono le limitazioni associate a qualsiasi metodologia ELISA, in particolare l'instabilità degli anticorpi38. I reagenti anticorpali devono essere scongelati a temperatura ambiente prima dell'uso nel test; tuttavia, il riscaldamento per un periodo prolungato può causare denaturazione e una conseguente diminuzione dell'efficacia nel legare CGRP. Inoltre, CGRP può subire degradazione da una varietà di proteasi non serina, portando ad un aumento dei risultati falsi negativi. Sebbene questo protocollo limiti la degradazione aggiungendo una serina proteasi e limitando il tempo di elaborazione del campione a meno di 60 minuti, la degradazione può ancora verificarsi. Un'altra limitazione è la mancanza di cicli di gelo-disgelo testati. Lee et al.39 hanno dimostrato che i cicli di congelamento-scongelamento possono aumentare o diminuire le quantità di proteine sieriche e plasmatiche, a seconda della suscettibilità della proteina. La suscettibilità del CGRP ai cicli di congelamento-scongelamento non è stata completamente testata in letteratura, sebbene Messlinger et al. abbiano notato che i livelli di CGRP diminuiscono dopo un ciclo di congelamento e scongelamento37. Inoltre, la resa di questo protocollo può beneficiare dell'uso di tubi LoBind proteici, progettati con una superficie idrofila, portando così a un migliore recupero delle proteine.
Notiamo che questi esperimenti di convalida non sembrano essere stati condotti da autori di studi recenti che quantificano CGRP nel plasma umano 16,18,35,40,41. Una revisione della metodologia ELISA da parte di Messlinger et al.37 sottolinea la necessità di tali controlli e mette in discussione gli studi che non li hanno utilizzati. Crediamo che il nostro lavoro nella convalida e standardizzazione di un protocollo metterà la futura ricerca CGRP su una base migliore. Le implicazioni di tale protocollo sono di ampio respiro e possono teoricamente essere estese allo studio dello stato dei biomarcatori di CGRP nei processi patologici e non neurologici 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
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Disclosures
Gli autori non hanno ulteriori rivelazioni da aggiungere.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Robert N. Cole, Lauren R. DeVine e Marcos Iglesias per le loro utili discussioni su questo protocollo. Ciò è stato sostenuto in parte dai finanziamenti dell'American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), dell'American Hearing Research Foundation (90066548 / 90072266, JPC) e del National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), un componente del National Institutes of Health (NIH) e NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). I contenuti della pubblicazione sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della Johns Hopkins ICTR, NCATS, o NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
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