Summary
Опубликованные данные, относящиеся к концентрациям пептидов, связанных с геном кальцитонина (CGRP), в плазме крови человека, противоречивы. Эти несоответствия могут быть связаны с отсутствием стандартизированной, проверенной методологии для количественной оценки этого нейропептида. Здесь мы описываем утвержденный протокол иммуноферментного анализа (ИФА) для очистки и количественного определения CGRP в плазме человека.
Abstract
Пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), представляет собой вазоактивный нейропептид, который играет предполагаемую роль в патофизиологии мигрени и может быть кандидатом на статус биомаркера. CGRP высвобождается из нейрональных волокон при активации и индуцирует стерильное нейрогенное воспаление и артериальную вазодилатацию в сосудистой сети, которая получает эфферентную иннервацию тройничного нерва. Присутствие CGRP в периферической сосудистой сети стимулировало исследования по обнаружению и количественному определению этого нейропептида в плазме человека с использованием протеомных анализов, таких как иммуноферментный анализ (ИФА). Однако его период полураспада 6,9 мин и вариабельность технических деталей протоколов анализа, которые часто не полностью описаны, привели к противоречивым данным CGRP ELISA в литературе. Здесь представлен модифицированный протокол ИФА для очистки и количественного определения CGRP в плазме человека. Процедурные этапы включают отбор и подготовку проб, экстракцию с использованием полярного сорбента в качестве средства очистки, дополнительные этапы блокирования неспецифического связывания и количественную оценку с помощью ИФА. Кроме того, протокол был проверен с помощью экспериментов по спайку, восстановлению и линейности разбавления. Этот валидированный протокол теоретически может быть использован для количественной оценки концентраций CGRP в плазме крови людей не только с мигренью, но и с другими заболеваниями, в которых CGRP может играть роль.
Introduction
Пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), представляет собой нейропептид из 37 аминокислот, который присутствует в нейронных волокнах с периваскулярной локализацией, а также в ненейрональных тканях. Две формы CGRP, α- и β-CGRP, имеют более 90% гомологии и общие физиологические функции; однако αCGRP обнаруживается в центральной и периферической нервной системе, а βCGRP обнаруживается в энтеральной нервной системе 1,2. При активации ноцицепторов и кальций-зависимом экзоцитозе CGRP высвобождается из нейронов, вызывая стерильное нейрогенное воспаление, включающее расширение артериальной вазодилатации и экстравазацию белка плазмы 3,4,5,6,7. Отсюда CGRP появляется в посткапиллярных сосудах и может быть биомаркером заболеваний, вызывающих афферентную ноцицептивную активацию, таких как мигрень 8,9,10,11. Следует отметить, что CGRP также участвует в COVID-19 благодаря своей роли в ангиогенезе и иммуномодуляции и может предсказывать неблагоприятное развитие заболевания12,13. Таким образом, протокол для точного количественного определения CGRP в плазме человека может иметь широкое значение.
Наибольшее внимание, пожалуй, было уделено роли CGRP в мигрени. Основываясь на доклинических и клинических исследованиях, CGRP был выдвинут в качестве возможного биомаркера мигрени и в качестве мишени для лечения 3,4,5,6,7,8,9,10. В некоторых исследованиях было обнаружено повышение CGRP в когортах с эпизодической мигренью по сравнению с контрольными участниками10,14,15. Успех ингибиторов CGRP в клинических испытаниях для лечения мигрени, по-видимому, подразумевает повышенный CGRP как причинный фактор мигрени. Однако не все исследователи подтвердили эти результаты16,17,18,19. Более того, роль CGRP в отсутствии головной боли при мигрени еще предстоит выяснить; Данная работа была мотивирована желанием понять роль CGRP в вестибулярных симптомах мигрени.
Противоречивые данные иммуноанализа CGRP в литературе могут быть вызваны несколькими причинами. Во-первых, период полувыведения CGRP в периферической сосудистой сети составляет 6,9 мин 20 из-за активности сериновых протеаз 21, инсулиноразрушающих ферментов и других металлопротеаз 22, нейтральных эндопептидаз 23 и эндотелинпревращающего фермента-1 24. Во-вторых, переменные технические детали иммунологических анализов, используемых для количественного определения CGRP, не полностью описаны в таких исследованиях. Наконец, отсутствие стандартизации методики иммуноанализа еще больше усложняет картину.
В этой статье описывается модифицированный протокол иммуноферментного анализа (ИФА), который позволяет проводить очистку и точное количественное определение α- и βCGRP в плазме человека. Антитела набора не являются перекрестно реактивными с амилином, кальцитонином или веществом P. Этот протокол прошел необходимые проверочные эксперименты, такие как спайк и восстановление и линейность разбавления, данные по которым представлены здесь. Такой протокол CGRP ELISA, прошедший валидацию, ранее не был полностью описан в литературе. Этот протокол может быть использован для количественной оценки CGRP в плазме человека в контексте мигрени, а также кардиологических2,25, дерматологических 26, акушерских 27, ревматологических28,29, скелетно-мышечных 30,31, эндокринных 32,33 и вирусных заболеваний 12,13, в которых участвует CGRP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был разработан с использованием образцов плазмы человека от согласившихся лиц с одобрения Институционального наблюдательного совета Джона Хопкинса (NA_00092491).
1. Отбор и подготовка образцов
- Соберите 5 мл цельной крови из антекубитальной вены с помощью стандартных методов венепункции34 в пробирку для сбора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) объемом 6 мл.
- Добавьте 0,5 мл апротинина (10 000 КИЕ/мл) конкурентного ингибитора сериновой протеазы в пробирку после сбора, чтобы блокировать лизис целевого пептида. Переверните пробирку 10 раз, чтобы апротинин адекватно смешался с кровью. После этого храните пробирки на льду до следующего шага.
- Центрифугируйте пробирку при 604 x g в течение 4 мин при 4 °C в течение 60 мин после забора крови.
- Снимите фракцию плазмы с помощью пипетки и переведите в 2 мл стерильных криовалов с круглым дном.
- Немедленно храните криовиалы при температуре -80 °C до 2 недель.
2. Извлечение образцов плазмы
- Поместите экстракционный картридж в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл так, чтобы внешние выступы картриджа поддерживались внешними гребнями пробирки.
- Активируйте картридж, сначала пропустив через картридж 5 мл 100% метанола, а затем 10 мл сверхчистой воды.
- Когда жидкость проходит через картридж под действием силы тяжести, она будет собираться в трубке.
- Выбрасывайте лишнюю жидкость по мере ее накопления, чтобы жидкость не поглотила картридж.
- Следите за тем, чтобы картридж не высыхал в ходе эксперимента.
- Разбавьте 250 мкл плазмы 750 мкл 4% уксусной кислоты.
- Медленно пропустите 1 мл плазмы и раствора уксусной кислоты через картридж.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен занять примерно 30 с через гравитационный поток на каждый пройденный миллилитр. - Промойте картридж 10 мл 4% уксусной кислоты. Как и ранее, выбрасывайте лишнюю жидкость по мере ее накопления, чтобы жидкость не поглотила картридж.
- После того, как последняя капля уксусной кислоты будет выпущена из картриджа, извлеките картридж из пробирки и поместите его в новую коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Приготовьте раствор 100% метанола и 4% уксусной кислоты в соотношении 10:1, смешав 2,7 мл 4% уксусной кислоты и 0,3 мл 100% метанола. Используйте это для разбавления CGRP, пропуская этот раствор через картридж по 1 мл за раз. Сделайте паузу на 25 мин между каждым миллилитром раствора. НЕ выбрасывайте элюент.
- Пробирка будет содержать 3 мл элюированной жидкости через 25 минут после того, как пройдет последний миллилитр раствора метанола и уксусной кислоты. Поместите каждый 1 мл элюента в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно дать три микроцентрифужные пробирки из каждого картриджа. - Поместите каждую пробирку в мини-центрифугу на 1 с, чтобы убедиться, что весь элюент находится на дне каждой пробирки.
- Высушите все образцы вакуумным центрифугированием при 4 °C (для водных растворов установлено значение концентратора при 1 400 об/мин; перегрузка изменяется в зависимости от положения пробирок и, следовательно, колеблется от 130 до 250 x g).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое вакуумной центрифуге для сушки образцов, будет зависеть от типа используемой микроцентрифужной пробирки. - Непосредственно перед тем, как приступить к процедуре анализа (этап 4.1), восстановите ранее высушенный образец с помощью буфера для иммуноферментного анализа (ИФА) (см. Таблицу материалов), размороженного до комнатной температуры (RT) или 20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера ОВОС, используемого для восстановления высушенного образца, должен быть равен исходному объему образца или 250 мкл.
3. Подготовка ИФА-планшета - блокировка для ограничения неспецифического связывания
- Добавьте 250 мкл трис-буферного солевого раствора (TBS) / рыбьего желатинового блокирующего буфера в каждую лунку на тарелке.
- Накройте тарелку накрытым листом и выдерживайте 2 часа при RT.
- Снимите защитный лист и опорожните пластину путем инверсии или аспирации с помощью многоканальной пипетки. Затем промокните тарелку бумажным полотенцем, чтобы удалить следы жидкости.
- Высушите пластину, оставив пластину в вытяжке с ламинарным потоком на 10 минут.
- После того, как пластина заметно высохнет, поместите ее в герметичный пакет из фольги с пакетиком с осушителем силикагеля и храните пакет при температуре -20 °C в течение 24 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины следует использовать в течение 4 недель после инкубации пластин.
4. Перед процедурой анализа
- Приготовьте реагенты (буфер EIA, стандарт CGRP, контроль качества CGRP, индикатор CGRP, буфер для промывки) в соответствии с инструкциями набора. Готовят реактив Эллмана только после окончания 16-20 ч инкубационного периода.
- Разморозьте все образцы и реагенты до RT перед выполнением остальной части протокола.
5. Процедура анализа
- Промойте каждую скважину в заблокированной пластине пять раз с помощью входящего в комплект буфера для стирки (300 мкл / лунка). Для каждого полоскания сделайте паузу в 30 с после помещения буфера для промывки в лунки, затем вылейте жидкость или аспират с помощью многоканальной пипетки.
- После окончательного промывания удалите весь буфер из лунок путем инверсии (переворачивания пластины для вытеснения жидкости из лунок) или аспирации с помощью многоканальной пипетки. Промокните последние капли на бумажное полотенце и постучите по перевернутой тарелке, пока вся жидкость не будет заметно удалена из лунок.
- Выделите по крайней мере две скважины без реагентов или буфера, которые будут известны как «пустые» скважины. Затем отложите по крайней мере две другие лунки для неспецифического связывания (NSB).
- Распределите 100 мкл буфера EIA в каждую лунку NSB.
- Распределите 100 мкл стандартов CGRP в двух экземплярах в соответствующие лунки.
- Распределите 100 мкл образцов (восстановленных в буфере ОВОС) и контролируйте качество в двух экземплярах в соответствующие лунки.
- Распределите 100 мкл индикатора CGRP (антитела против CGRP, прикрепленного к ацетилхолинэстеразе) в каждую лунку, содержащую NSB, стандарты CGRP, образцы и контроль качества. Не выдавайте трассер в «холостые» скважины.
- Накройте пластину прозрачным покровным листом, герметизируя каждую лунку таким образом, чтобы образцы и реагенты в каждой лунке не испарялись значительно. Выдерживают пластину в течение 16-20 ч при температуре 4 °C.
- После завершения инкубации восстановите реагент Эллмана в соответствии с инструкциями набора.
- Переверните пластину, чтобы удалить всю жидкость. Промойте каждую лунку (как описано выше) три раза 300 мкл буфера для стирки.
- После третьего полоскания удалите жидкость с тарелок, поставьте тарелку на шейкер и встряхивайте при 120 об/мин в течение 2 мин.
- Вымойте тарелку еще три раза. После окончательного промывания удалите весь буфер из лунок методом инверсии или аспирации с помощью многоканальной пипетки. Промокните последние капли жидкости бумажным полотенцем и постучите по перевернутой тарелке, пока вся жидкость не будет заметно удалена из лунок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные три промывки, описанные на этом этапе, могут не понадобиться, если используется шайба для микропланшетов ИФА. - Распределите 200 мкл реагента Эллмана в каждую лунку (не включая «пустые» скважины).
- Накройте тарелку новым защитным листом и оберните ее алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света. Инкубировать в темноте при РТ в течение 1 ч.
- Убедитесь, что на обратной стороне пластины нет жидкости, которая может испортить показания спектрофотометра, протерев заднюю сторону сухим бумажным полотенцем.
- Прочтите табличку для поглощения при 405 нм (желтый цвет).
6. Анализ данных
- Рассчитайте среднюю поглощающую способность для каждого «бланка», NSB, стандарта, контроля качества и образцов.
- Вычтите средние значения поглощения NSB из стандартных значений поглощения, значений контроля качества и поглощения образца.
- График поглощения по оси Y и концентрация по оси X. Постройте стандартную кривую, используя четырехпараметрическую модель логистической регрессии.
- После того, как кривая построена, используйте уравнение кривой для определения интерполированных концентраций для контроля качества и образцов, которые можно прочитать по оси x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая проверяется только в том случае, если рассчитанная интерполированная концентрация для контроля качества находится в пределах 25% от ожидаемой концентрации (обычно 125 пг/мл, но см. этикетку флакона для контроля качества).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В протоколе есть несколько ключевых шагов, которые следует выделить. Во-первых, апротинин, ингибитор сериновой протеазы, должен быть добавлен к образцам цельной крови сразу после сбора, чтобы предотвратить дальнейшую ферментативную деградацию CGRP. Было показано, что сериновые протеазы играют роль в метаболизме CGRP, и в предыдущем исследовании также использовался апротинин для количественной оценки CGRP у людей21,35. Если ингибиторы протеазы не используются, а подготовка образцов занимает более 60 минут, то можно ожидать снижения уровня CGRP при выполнении ИФА. Во-вторых, твердофазная экстракция перед ИФА концентрирует CGRP в элюенте и устраняет потенциально мешающие молекулы из плазменного матрикса. Эта стадия экстракции увеличивает выход CGRP в экспериментах по спайку и восстановлению (подробнее обсуждается в следующем разделе). Вакуумное центрифугирование в холодильной камере после экстракции еще больше ограничивает потери CGRP. В-третьих, перед ИФА микротитровальные планшеты должны быть заблокированы с помощью блокирующего буфера. Это позволяет осуществлять пассивную адсорбцию неспецифических белков в буфере к оставшимся сайтам связывания в планшетах, тем самым уменьшая фоновый сигнал. Блокировка помогает снизить нереально высокие выходы CGRP.
Эксперименты по спайку и восстановлению определяют, влияют ли на обнаружение CGRP различия между разбавителем стандартной кривой (в данном случае буфер EIA) и матрицей экспериментального образца (в данном случае плазмой). Плазма и/или сыворотка могут содержать молекулы, которые блокируют связывание антител с CGRP или разрушают пептид, тем самым препятствуя способности анализа точно обнаруживать и количественно определять начальную концентрацию CGRP. С этой целью мы добавили известные количества CGRP в образцы плазмы — стадия «всплеска» — и рассчитали, сколько CGRP было «восстановлено» после экстракции и ИФА. Запас CGRP был получен от производителя и хранился в морозильной камере с температурой -20 °C до использования.
При линейности испытаний на разбавление образец последовательно разбавляют, и для каждого разбавления рассчитываются концентрации CGRP. Если разбавленные образцы не демонстрируют соответствующего линейного снижения концентрации CGRP, это будет указывать на то, что буфер или плазма ОВОС мешают обнаружению CGRP в некоторых концентрациях или что стандартная кривая не является точной в диапазоне, на который воздействует. При проведении описанного выше эксперимента по спайку и восстановлению мы последовательно разбавляли «шипованные» образцы; мы подняли образец плазмы, чтобы получить концентрацию CGRP 200 пг / мл, а затем разбавили образец до 100 пг / мл, а затем до 50 пг / мл.
Образцы плазмы от трех участников, у которых в анамнезе не было сердечно-сосудистой, дыхательной или недавней головной боли или неврологических симптомов, были отмечены различными концентрациями CGRP. Протокол был запущен для этих образцов в дополнение к контрольным образцам без шипов. На рисунке 1 показан пример карты плит для экспериментов по спайку, восстановлению и линейности разбавления. Была выполнена четырехпараметрическая логистическая подгонка для создания стандартной кривой, которая позволяла подгонять за пределы линейного диапазона (табл. 1 и рис. 2). Показатели извлечения рассчитывались для каждого образца с шипами и находились в пределах допустимого диапазона (табл. 2). Линейность разбавления была продемонстрирована в образцах с шипами (рис. 3). В таблице 3 показаны результаты, полученные в результате неудачного эксперимента по спайку и восстановлению, проведенного в соответствии с инструкциями производителя и до включения дополнительных шагов для блокировки неспецифического связывания. Эти данные показывают показатели восстановления, превышающие верхнюю границу в 125%, что указывает на наличие неспецифического связывания. После добавления шагов в протокол для блокировки пластины с помощью блокирующего буфера (шаги 3.1-3.5) мы смогли уменьшить этот эффект и достичь приемлемых значений восстановления (табл. 2). У трех пациентов без мигрени или вестибулярных симптомов мы обнаружили, что средняя концентрация CGRP в плазме составляла 1,68 ± 0,13 пг/мл. Будущие эксперименты должны быть направлены на использование существующей методологии в более широком масштабе контрольных пациентов.
Рисунок 1: Пример карты плит. Каждая табличка должна содержать стандарты, образцы, заготовки и скважины NSB, все в двух или трех экземплярах. Пустые лунки не должны содержать жидкости, а лунки NSB должны содержать запатентованный иммуноферментный буфер, связанные с ферментами вторичные антитела и реагент Эллмана. Средние значения поглощения для скважин NSB должны быть вычтены из значений поглощения стандарта до создания стандартной кривой. Средние значения поглощения для скважин NSB также должны быть вычтены из значений поглощения проб до расчета процента извлечения. Нет никакого влияния положения тарелки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пример стандартной кривой регрессии с четырьмя параметрами логистики (4PL). Эта стандартная кривая математически описывается уравнением в форме, аналогичной той, что показана в таблице 1. Кривая регрессии 4PL лучше подходит к биологическим системам по сравнению с линейными кривыми. Эта кривая и уравнение используются для интерполяции элементов контроля качества и образцов на той же пластине, на которой был создан стандарт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Диаграмма линейности разбавления, показывающая образцы, скачкообразные 200 пг / мл, а затем последовательно разбавленные 1: 2 и 1: 4. Эти данные демонстрируют линейность в широком диапазоне разведений, что указывает на то, что метод анализа точен в широком диапазоне концентраций CGRP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Параметр | Ценность |
| Х50 | 294.75 |
| Уравнение |  |
| Форма уравнения |  |
Таблица 1: Пример уравнения стандартной кривой четырехпараметрической логистической (4PL) регрессии с титрами X50. Кривая регрессии 4PL учитывает сложность, наблюдаемую в биологических системах. Эта кривая была использована для анализа результатов ИФА, так как она больше подходит, чем линейная регрессия.
| Поглощение (OD) | Интерполированная концентрация (пг/мл) | Процент доходности | |
| Управление без шипов | -0.0434 | Не падает на кривую (т.е. ~0) | |
| Повышенная концентрация при 200 пг/мл | 0.2712 | 214,7 ± 23,4 | 107.40% |
| Повышенная концентрация 100 пг/мл | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| Повышенная концентрация при 50 пг/мл | 0.0205 | 55.1 ± 12.65 | 110.20% |
Таблица 2: Результаты успешного эксперимента по спайку и восстановлению трех участников контрольной группы из-за отсутствия твердофазной экстракции и блокировки пластин. Процент выхода для образцов с шипами находился в пределах 20% от идеального 100% выхода, что указывает на то, что обнаружение CGRP не зависит от матрицы экспериментальных образцов плазмы.
| Поглощение (OD) | Интерполированная концентрация (пг/мл) | Процент доходности | |
| Управление без шипов | -0.2087 | Не падает на кривую (т.е. ~0) | |
| Повышенная концентрация при 200 пг/мл | 2.371 | 264,2 ± 104 | 132.10% |
| Повышенная концентрация 100 пг/мл | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| Повышенная концентрация при 50 пг/мл | 0.3218 | 80.55 ± 4.54 | 161.10% |
Таблица 3: Результаты неудачного эксперимента по спайку и восстановлению трех участников контрольной группы из-за отсутствия блокировки пластин. Процент выхода для образцов с шипами упал значительно выше верхнего предела выхода 120%, что указывает на то, что анализ может быть искажен NSB. После получения этих результатов мы добавили шаги 3.1-3.5 в протокол, чтобы заблокировать NSB на пластине перед анализом.
| Поглощение (OD) | Интерполированная концентрация (пг/мл) | Процент доходности | |
| Управление без шипов | 0.0401 | 12.93 | |
| Повышенная концентрация 100 пг/мл | 0.0315 | 17.10.±2.31 | 10.17% |
| Повышенная концентрация при 50 пг/мл | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| Повышенная концентрация 25 пг/мл | 0.0007 | 0,2177±6,43 | 0.87% |
Таблица 4: Результаты неудачного эксперимента по спайку и восстановлению трех участников контроля. Процент выхода для образцов с шипами упал значительно ниже нижнего предела выхода в 80%, что указывает на необходимость дальнейшей оптимизации для устранения возможных процессов деградации и конкурентного связывания. Эти результаты получены в результате конкурентного анализа ИФА другого производителя с нижним пределом обнаружения 2,23 пг/мл, при внутрианализовом cv < 10% и в межанализовом cv < 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается проверенный протокол, позволяющий обнаруживать и количественно определять CGRP в плазме человека. Этот протокол был синтезирован после того, как было обнаружено, что коммерческие наборы CGRP ELISA не точно определяют количественное количество этой молекулы. После разработки протокола пробоподготовки и достоверной стандартной кривой эксперименты по спайку, извлечению и линейности разбавления показали, что процент извлечения был намного ниже, чем ожидалось. Аналогичные результаты были получены при использовании другого коммерческого набора CGRP ELISA (таблица 4). Для справки, общепринятое стандартное восстановление составляет 80-120%36. Эти результаты могут свидетельствовать о наличии активности протеазы, деградирующей CGRP21,22,23,24, других молекул, связывающихся с CGRP, тем самым ограничивая ее доступность для связывания с антителами планшета, или конкурентного связывания нецелевых белков с антителами планшета.
Чтобы контролировать эти возможные искажающие факторы, протокол экстракции был оптимизирован для очистки плазмы путем экстракции запатентованным сорбентом до ИФА. Этот сорбент якобы изолирует полярные молекулы, такие как CGRP. Чтобы определить эффективность экстракции до ИФА, образцы плазмы человека были повышены с известными концентрациями CGRP, поскольку положительный контроль подвергся экстракции, а затем ИФА. Эти образцы с шипами дали только ~ 50% -60% восстановления. Эти результаты показали, что экзогенно добавленная CGRP не обнаруживается в плазме, как можно было бы ожидать.
Были оптимизированы различные другие этапы протокола: добавление ингибитора сериновой протеазы в образцы цельной крови перед центрифугированием для ингибирования деградации21, снижение температуры вакуумного центрифугирования после экстракции и корректировка методов ресуспендирования после центрифугирования. Эксперимент по всплеску и восстановлению после этих изменений выявил нереально высокие концентрации CGRP, более 120% восстановления (таблица 3). Обнадеживает то, что недавно сообщалось о более высоких, чем ожидалось, значениях после экстракции с использованием аналогичного анализа Messlinger et al.37, что указывает на то, что это остается проблемой. Messlinger et al. признают, что анализ после экстракции плазмы не воспроизводит реалистичные концентрации CGRP, не объясняя причин этого явления37.
Мы предположили, что остаточная связывающая способность на микротитровальных планшетах ИФА, вызывающая неспецифическое связывание, может быть ответственна за высокие скорости восстановления. До ИФА пластину инкубировали с блокирующим буфером, TBS/рыбным желатиновым буфером, чтобы уменьшить эту связывающую способность. Этот дополнительный шаг привел к более приемлемым показателям восстановления (таблица 2). Таким образом, изменения и оптимизации, рассмотренные выше, включая использование буфера блокировки, остаются критическими шагами в протоколе. Эти шаги позволили установить нижний предел обнаружения 1,05 пг/мл по сравнению с исходным набором производителя, указанным как 2 пг/мл.
Что касается устранения неисправностей, шаг 2.10 требует вакуумного центрифугирования для сушки элюента. Было замечено, что продолжительность этого этапа варьируется в зависимости от типа микроцентрифужной пробирки, в которой находятся образцы. При использовании микроцентрифужных пробирок, описанных в таблице материалов, этот этап обычно длится 5 часов. Однако при использовании альтернативных микроцентрифужных пробирок большего объема этот этап может длиться до 11 часов. Альтернативой вакуумному центрифугированию может быть лиофилизация или сублимационная сушка образцов, что потребует замораживания образцов после экстракции. Однако лиофилизация не тестировалась при построении этого протокола. Кроме того, если обнаружены систематически более низкие, чем ожидалось, концентрации CGRP, следует убедиться, что все реагенты, особенно антитела, разморожены до комнатной температуры перед использованием. Нестабильность реагентов, таких как растворы антител и индикаторов, может способствовать систематической ошибке связывания CGRP. Если выход по-прежнему недостаточен, на связывание антител с CGRP может влиять относительная кислотность элюента (раствора метанола и уксусной кислоты), несмотря на восстановление с помощью буфера. В этом случае этап ректификации pH будет логическим дополнением после восстановления с буфером.
Ограничения этого протокола включают ограничения, связанные с любой методологией ИФА, в частности, нестабильность антител38. Реагенты антител должны быть разморожены до комнатной температуры перед использованием в анализе; однако потепление в течение длительного периода может вызвать денатурацию и, следовательно, снижение эффективности связывания CGRP. Кроме того, CGRP может подвергаться деградации различными несериновыми протеазами, что приводит к увеличению ложноотрицательных результатов. Хотя этот протокол ограничивает деградацию путем добавления сериновой протеазы и ограничения времени обработки образца менее чем 60 минутами, деградация все же может происходить. Еще одним ограничением является отсутствие проверенных циклов замораживания-оттаивания. Lee et al.39 продемонстрировали, что циклы замораживания-оттаивания могут увеличивать или уменьшать количество белка в сыворотке и плазме в зависимости от восприимчивости белка. Восприимчивость CGRP к циклам замораживания-оттаивания не была полностью проверена в литературе, хотя Messlinger et al. отметили, что уровни CGRP снижаются после одного цикла замораживания и оттаивания37. Кроме того, выход этого протокола может выиграть от использования белковых пробирок LoBind, спроектированных с гидрофильной поверхностью, что приводит к улучшению восстановления белка.
Мы отмечаем, что эти проверочные эксперименты, по-видимому, не проводились авторами недавних исследований, количественно определяющих CGRP в плазме человека 16,18,35,40,41. Обзор методологии ИФА, проведенный Messlinger et al.37, подчеркивает необходимость такого контроля и ставит под сомнение исследования, в которых они не использовались. Мы считаем, что наша работа по проверке и стандартизации протокола поставит будущие исследования CGRP на более прочную основу. Последствия такого протокола широки и теоретически могут быть распространены на исследование статуса биомаркеров CGRP в неврологических и неневрологических заболеваниях 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет дополнительных раскрытий, которые они могли бы добавить.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Роберта Н. Коула, Лорен Р. Девайн и Маркоса Иглесиаса за их полезные обсуждения этого протокола. Это было частично поддержано финансированием Американского отологического общества (грант стипендии, PSK), Американского фонда исследований слуха (90066548/90072266, JPC) и Национального центра развития трансляционных наук (NCATS), компонента Национальных институтов здравоохранения (NIH) и Дорожной карты NIH по медицинским исследованиям (UL1 TR003098, NSF). Содержание публикации является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Джонса Хопкинса, МУТР, NCATS или NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H.
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
