여기에서 우리는 병원체 관련 분자 패턴 유발 면역 반응에서 벼 조직에서 아포플라스틱 활성 산소 종(ROS) 생성을 실시간으로 검출하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 간단하고 표준화되어 있으며 통제된 조건에서 재현성이 높은 결과를 생성합니다.
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방법 논문
Chemiluminescence Assay를 통한 벼의 면역 반응에서 활성 산소 종 생산의 실시간 검출
이 논문에서
요약
초록
활성 산소 종(ROS)은 비생물적 및 생물학적 스트레스 감지를 포함한 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 병원체 감염 또는 병원체 관련 화학 물질(병원체 관련 분자 패턴[PAMP])에 대한 도전 시, ROS 버스트를 포함한 일련의 면역 반응이 식물에서 빠르게 유도되며, 이를 PAMP 유발 면역(PTI)이라고 합니다. ROS 버스트는 특징적인 PTI 반응으로, 원형질막에 국한된 NADPH 산화효소(RBOH 계열 단백질) 그룹에 의해 촉매됩니다. 대부분의 ROS는 과산화수소(H2O2)를 포함하며, 이는 루미놀 기반 화학발광법으로 쉽고 안정적으로 검출할 수 있습니다. 화학발광은 루미놀 또는 그 유도체(예: L-012)가 촉매의 작용으로 ROS와 산화환원 반응을 겪는 광자 생성 반응입니다. 이 논문은 벼 조직에서 PAMP 추출 시 실시간으로 아포플라스트 ROS 생성을 감지하기 위해 최적화된 L-012 기반 화학발광 방법을 설명합니다. 이 방법은 확실하게 통제된 조건에서 쉽고, 안정적이며, 표준화되고, 재현성이 높습니다.
서론
활성산소종(ROS)은 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(O2-)과 그 유도체, 하이드록실 라디칼(OH-), 과산화수소, 일중항 산소 또는 산화환원 반응의 산물을 포함한 일련의 화학적 활성 산소 유도체로 구성되며, 색소체와 엽록체, 미토콘드리아, 퍼옥시좀 및 기타 세포 이하 위치에서 지속적으로 생성됩니다1 . ROS는 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하며 모든 식물에 필수적입니다 2,3,4. ROS 기능의 광범위한 스펙트럼은 성장과 발달의 조절에서 비생물적 및 생물학적 스트레스의 인식에 이르기까지 다양합니다 5,6,7,8.
식물 면역계에서 식물 세포 원형질막-국소화된 수용체-소위 패턴 인식 수용체(PRR)-병원체 유....
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프로토콜
참고: 프로토콜은 다양한 식물 조직에 적용할 수 있습니다. 벼집과 잎 디스크는 PAMP 추출 시 ROS 검출을 위해 이 프로토콜에서 사용되었습니다. 주로 샘플링 방법으로 인해 차이가 발생하므로 아래에서는 일반적인 절차만 설명하고 필요한 경우 특정 단계를 언급합니다.
1. 식물 배양
- 껍질을 벗긴 벼 종자를 70% 에탄올로 1분 동안 소독한 다음 40% 차아염소산나트륨(NaClO)으로 1시간 동안 소독합니다. 그런 다음 씨앗을 멸균 수로 5 배 헹구어 잔류 염소를 제거합니다.
- 씨앗을 1/2 MS 배지(2.37g/L Murashige 및 Skoog(MS) 배지, 30g/L 자당, 2.1g/L 피타젤, pH 5.7, 오토클레이브)에 무균 상태로 플레이트합니다.
- 쌀집 방법에서는 멸균 유리 용기에 있는 씨앗을 MS 배지로 직접 도금합니다.
- 잎 디스크 방법에서 씨앗을 MS 플레이트에 5-7일 동안 플레이트하고 성장 매트릭스 또는 토양에 이식합니다(그림 1A).
- 12 h light / 12 h dark photoperiod가있는 성장실에서 묘목을 재배하십시오. ....
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결과
여기서는 flg22 처리로 생성된 ROS를 결정하기 위해 쌀 재료를 예로 들어 보겠습니다. 유도 후 ROS의 생성은 일시적입니다. 벼에서 ROS 생산의 증가는 1-2분 안에 처음 감지되었고 10-12분에 최고조에 달했으며 ~30-35분 후에 기준선으로 돌아왔습니다(그림 3). 명백한 ROS 유도를 초래하지 않는 유도 용액에 PAMP가 없는 대조 테스트와 비교하여, 특정 ROS 버스트는 flg22 또는 키틴과 같은 다른 PAMP를 포함하는 유도 용액에서만 유도되었습니다. 한편, ROS의 총량은 곡선에서 계산할 수 있습니다(그림 4).
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토론
이 연구의 목적은 벼 조직에서 PAMP에 대한 반응으로 초기 ROS 생산을 정량화하는 매우 효율적인 방법을 확립하는 것이었습니다. 이 방법은 처리된 벼 조직에서 생성된 아포플라스트 ROS의 실시간 측정을 위한 표준화된 절차를 제공합니다. 이 방법은 작동이 간단하고 비용이 저렴하며 구성이 명확하고 상용 키트와 무관합니다. 이 방법을 사용하여 연구자들은 식물이 생물학적 또는 비생물적 스트레스를 받을 때 아포플라스트 ROS의 실시간 생산을 연구할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 L-012는 무독성 화학 물질이므로 화학 발광 시약으로 선택되었습니다. 루미놀은 ROS 생성을 검출하기 위한 화학발광 분석에 널리 사용됩니다. 그러나 루미놀에는 쌀 및 기타 식물 조직에서 ROS 검출에 적합하지 않은 세 가지 단점이 있습니다: 낮은 수용성, 짧은 반응 지속 시간 및 가혹한 반응 pH. 루미놀은 최적의 pH가 9.5인 알칼리성 조건에서만 빛을 생성하는데, 이는 식물 세포에 너무 가혹하고 바람직하지 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Shanghai Natural Science Foundation(보조금 번호: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University(Agri-X 프로그램, 보조금 번호:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds(보조금 번호: ZXWH2150201/001)의 보조금으로 Jiangbo Fan에, Shanghai Jiao Tong Univesity의 의료-공학 협력 프로젝트(보조금 번호: 21X010301734)가 Can Li에 지원했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 마이크로타이터 플레이트 | WHB WHB-96-01 | ||
| 에탄올 절대 | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | 소프트웨어 | |
| L-012 | 후지필름 | 120-04891 | 8-아미노-5-클로로-7-페닐-2,3-디하이드로피리도 [3,4-d] 피리다진-1,4-디온, CAS #:143556-24-5 |
| 마이크로플레이트 리더 | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| 자당 | 상곤 생명공학 | A502792 | |
| 트리스 | 상곤 생명공학 | A610195 |
참고문헌
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19....
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재인쇄 및 허가
