Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

केमिलुमिनेसेंस परख के साथ चावल में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन का वास्तविक समय पता लगाना

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64776
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, 2Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, 3Bio-X Institutes, Key Laboratory for the Genetics of Developmental and Neuropsychiatric Disorders (Ministry of Education), Shanghai Jiao Tong University

Summary

यहां, हम रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न-ट्रिगर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में चावल के ऊतकों में एपोप्लास्टिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन के वास्तविक समय का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि सरल, मानकीकृत है, और नियंत्रित परिस्थितियों में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करती है।

Abstract

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, जिसमें अजैविक और जैविक तनावों का संवेदन शामिल है। रोगज़नक़-संबंधित रसायनों (रोगज़नक़-संबद्ध आणविक पैटर्न [पीएएमपी]) के साथ रोगज़नक़ संक्रमण या चुनौती पर, पौधों में आरओएस विस्फोट सहित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की एक सरणी जल्दी से प्रेरित होती है, जिसे पीएएमपी-ट्रिगर प्रतिरक्षा (पीटीआई) कहा जाता है। आरओएस फटना एक हॉलमार्क पीटीआई प्रतिक्रिया है, जो प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत एनएडीपीएच ऑक्सीडेज-आरबीओएच परिवार प्रोटीन के एक समूह द्वारा उत्प्रेरित होती है। आरओएस के विशाल बहुमत में हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) शामिल है, जिसे आसानी से और लगातार लुमिनोल-आधारित केमिल्यूमिनेसेंस विधि द्वारा पता लगाया जा सकता है। केमिल्यूमिनेसेंस एक फोटॉन-उत्पादक प्रतिक्रिया है जिसमें ल्यूमिनोल, या इसके व्युत्पन्न (जैसे एल -012), उत्प्रेरक की कार्रवाई के तहत आरओएस के साथ रेडॉक्स प्रतिक्रिया से गुजरते हैं। यह पेपर चावल के ऊतकों में पीएएमपी उत्पादन पर वास्तविक समय में एपोप्लास्ट आरओएस उत्पादन का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित एल -012-आधारित केमिलुमिनेसेंस विधि का वर्णन करता है। विधि आसान, स्थिर, मानकीकृत और दृढ़ता से नियंत्रित परिस्थितियों में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।

Introduction

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) में रासायनिक रूप से सक्रिय ऑक्सीजन डेरिवेटिव की एक श्रृंखला शामिल है, जिसमें सुपरऑक्साइड आयन कण (ओ2-) और इसके डेरिवेटिव, हाइड्रॉक्सिल रेडिकल (ओएच-), हाइड्रोजन पेरोक्साइड, और सिंगलेट ऑक्सीजन या ऑक्सीकरण-कमी प्रतिक्रियाओं के उत्पाद शामिल हैं, जो लगातार प्लास्टिड और क्लोरोप्लास्ट, माइटोकॉन्ड्रिया, पेरोक्सीसोम और अन्य उपकोशिकीयस्थानों में उत्पादित होते हैं। . आरओएस कई जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और सभी पौधों 2,3,4 के लिए आवश्यक है। आरओएस कार्यों का व्यापक स्पेक्ट्रम विकास और विकास के विनियमन से अजैविक और जैविक तनाव 5,6,7,8 की धारणा तक भिन्न होता है।

पौधे की प्रतिरक्षा प्रणाली में, प्लांट सेल प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत रिसेप्टर्स-तथाकथित पैटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स (पीआरआर) - रोगज़नक़-व्युत्पन्न रसायनों-रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी) का अनुभव करते हैं। यह पहचान कैल्शियम प्रवाह, आरओएस फटने और एमएपी कैस्केड सहित तेजी से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला को ट्रिगर करती है; इस प्रकार, प्रतिरक्षा की इस परत को पीएएमपी-ट्रिगर प्रतिरक्षा (पीटीआई) नाम दिया गया है। आरओएस विस्फोट पीटीआई की प्रतिक्रिया की एक हॉलमार्क प्रतिक्रिया है, जिसका निर्धारण पीटीआई से संबंधितअध्ययनों 9,10 पर व्यापक रूप से लागू होता है। पीएएमपी द्वारा ट्रिगर आरओएस उत्पादन को प्लाज्मा झिल्ली-निवासी एनएडीपीएच ऑक्सीडेज, या श्वसन विस्फोट ऑक्सीडेज होमोलॉग (आरबीओएच) परिवार प्रोटीन के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जो सुपरऑक्साइड (ओ2-) का उत्पादन करने के लिए साइटोसोलिक एनएडीपीएच या एनएडीएच से इलेक्ट्रॉनों को बाह्य ऑक्सीजन में स्थानांतरित करता है जो सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज8 द्वारा अनायास हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) में परिवर्तित हो जाता है। . पीएएमपी-ट्रिगर आरओएस विस्फोट काफी तेजी से होता है, पीएएमपी उपचार के कुछ मिनट बाद ही दिखाई देता है और ~ 10-12 मिनट पर चरम पर पहुंच जाता है। आरओएस अणुओं के विशाल बहुमत में हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) शामिल है, जिसे आसानी से और लगातार केमिल्यूमिनेसेंस परख के साथ पता लगाया जा सकता है।

केमिलुमिनेसेंस में, केमिलुमिनेसेंस अभिकर्मक उत्तेजित अवस्था मध्यवर्ती का उत्पादन करने के लिए उत्प्रेरक की कार्रवाई के तहत सक्रिय ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया करता है। फिर, उत्पाद में इलेक्ट्रॉन गैर-विकिरण संक्रमण के माध्यम से जमीन की स्थिति में लौटते हैं और फोटॉन का उत्सर्जन करते हैं। आम केमिलुमिनेसेंस अभिकर्मकों में ल्यूमिनोल और एल -012 शामिल हैं, जिसमें ल्यूमिनोल 11,12,13 आवेदन पर हावी है। हालांकि, अधिक शोधकर्ता आरओएस उत्पादन का पता लगाने के लिए एल -012 चुन रहे हैं, क्योंकि एल -012 में लुमिनोल की तुलना में तटस्थ या तटस्थ पीएच स्थितियों के तहत बहुत अधिक प्रकाश उत्सर्जन दक्षता है।

यह पेपर चावल (ओरिजा सैटिवा) ऊतकों-पत्ती डिस्क और शीथ में पीएएमपी के उत्पादन के बाद आरओएस उत्पादन के वास्तविक समय का पता लगाने के लिए एल -012 पर आधारित एक अनुकूलित केमिलुमिनेसेंस विधि का वर्णन करता है। यहां प्रदान की गई विधि सरल, स्थिर और मानकीकृत है, और विभिन्न प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है। इस विधि के साथ प्राप्त डेटा दृढ़ता से नियंत्रित परिस्थितियों में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: प्रोटोकॉल विभिन्न पौधों के ऊतकों पर लागू होता है। पीएएमपी पर आरओएस का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल में राइस शीथ और लीफ डिस्क का उपयोग किया गया था। चूंकि मतभेद मुख्य रूप से नमूनाकरण की विधि के कारण उत्पन्न होते हैं, केवल सामान्य प्रक्रियाओं को नीचे वर्णित किया गया है, जहां भी आवश्यक हो विशिष्ट चरणों का उल्लेख किया जाता है।

1. पादप संस्कृति

  1. 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ निर्जलित चावल के बीज को निष्फल करें, फिर 1 घंटे के लिए 40% सोडियम हाइपोक्लोराइट (NaClO) के साथ। फिर, अवशिष्ट क्लोरीन को हटाने के लिए बाँझ पानी के साथ बीज को 5 गुना कुल्ला करें।
  2. बीज को 1/2 एमएस माध्यम (2.37 ग्राम / एल मुराशिगे और स्कूग (एमएस) माध्यम, 30 ग्राम / एल सुक्रोज, 2.1 ग्राम / एल फाइटगेल, पीएच 5.7, आटोक्लेव) पर अम्लीय रूप से प्लेट करें।
    1. चावल शीथ विधि में, सीधे एमएस माध्यम के साथ बाँझ कांच के बर्तन में बीज को प्लेट करें।
    2. पत्ती डिस्क विधि में, बीज को 5-7 दिनों के लिए एमएस प्लेटों पर प्लेट करें और उन्हें विकास मैट्रिक्स या मिट्टी में प्रत्यारोपित करें (चित्रा 1 ए)।
  3. 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे अंधेरे फोटोअवधि के साथ एक विकास कक्ष में रोपाई उगाएं।

2. ऊतक की तैयारी और प्रथागत

  1. चावल का आवरण
    1. आरओएस परख से 1 दिन पहले पूर्व-उपचार के लिए 10 दिन पुराने चावल के पौधों से म्यान को 3 मिमी खंडों में काटें (चित्रा 1 बी)।
    2. 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के एक व्यक्तिगत कुएं में पांच शीथ खंड रखें, जिसमें 10-12 घंटे के लिए 100 μLddH 2 O होता है, 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में, जो घाव की चोट से संबंधित आयन रिसाव और रक्षा प्रतिक्रियाओं को कम करने की अनुमति देता है (चित्रा 2)।
      नोट: कट को ऊर्ध्वाधर रखने का ध्यान रखना ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि निरंतर काटने की सतह का क्षेत्र उच्च प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। खंडों को धीरे से हिलाएं। खंडों पर अतिरिक्त कटौती या घाव न करें, जो डेटा भिन्नता का स्रोत हो सकता है। एक सिद्धांत के रूप में, प्रत्येक परीक्षण में कम से कम पांच प्रतिकृतियां होनी चाहिए क्योंकि आरओएस मान की भिन्नता बड़ी है। जितनी अधिक प्रतिकृति सेट की जाती है, डेटा उतना ही विश्वसनीय होता है।
  2. लीफ डिस्क
    1. प्लंजर के साथ बायोप्सी पंच का उपयोग करके 4-6 सप्ताह पुराने चावल के पौधों से पत्ती डिस्क (व्यास में 4 मिमी) काटें। डेटा भिन्नता को कम करने के लिए हमेशा मुख्य टिलर के दूसरे पत्ती (शीर्ष से क्रमांकित) के मध्य तिहाई से पत्ती डिस्क काटें (चित्रा 1 सी)।
    2. 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के एक अलग कुएं में एक पत्ती डिस्क रखें, जिसमें 100 μL ddH2O होता है, जो घाव से संबंधित प्रतिक्रियाओं को कम करने की अनुमति देता है क्योंकि ये पीएएमपी द्वारा आरओएस के प्रेरण में हस्तक्षेप कर सकते हैं (चित्रा 2)।
      नोट: पत्ती डिस्क को धीरे से संचालित करें। प्रयोग में डिस्क पर अतिरिक्त कटौती या घाव न करें, जिसके परिणामस्वरूप डेटा भिन्नता हो सकती है। आरओएस का प्रेरण ज्यादातर कटे हुए किनारे की कोशिकाओं से होता है, क्योंकि चावल के ऊतकों (पत्तियों या म्यान) की सतहें हाइड्रोफोबिक परतों से ढकी होती हैं। केवल कटे हुए किनारों की कोशिकाएं ही समाधान के संपर्क में होती हैं (चर्चा अनुभाग देखें)।
    3. पत्ती के किनारे से जुड़े बदलाव से बचने के लिए पानी के उपचार के लिए एक माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं में सभी पत्ती डिस्क को तैरते रहें, जिसमें अक्षीय सतह ऊपर की ओर हो।

Figure 1
चित्र 1: म्यान के नमूने के लिए चावल के पौधों की वृद्धि की स्थिति और चरण और परख में उपयोग किए जाने वाले चावल के म्यान और चावल के पत्तों के कुछ हिस्से। (ए) 10 दिनों के लिए बाँझ परिस्थितियों में 1/2 एमएस माध्यम पर उगाए गए चावल के पौधों को आरओएस परख के लिए नमूना लिया जा सकता है। निष्फल चावल के बीजों को 1/2 एमएस माध्यम पर संवर्धित किया गया था और स्पष्ट कांच की शीशी में 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे अंधेरे फोटोअवधि में उगाया गया था, व्यास में 8.5 सेमी और ऊंचाई में 15 सेमी। (बी) पत्ती म्यान के नमूना भागों का योजनाबद्ध आरेख। 10 दिन पुराने चावल के पौधों से पत्ती म्यान काटे गए थे। पत्ती म्यान की स्थिति जड़ों के ऊपर और पहली पत्ती के नीचे थी। (सी) पत्ती डिस्क की नमूना स्थिति का योजनाबद्ध आरेख। पत्ती डिस्क को किसी भी विकास चरण में स्वस्थ चावल के पौधों के मुख्य टिलर के दूसरे पत्ती (शीर्ष से गिनती) के मध्य तिहाई से काटा जा सकता है। संक्षेप: आरओएस = प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां; एमएस = मुराशिगे और स्कूग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ओरीज़ा सैटिवा की विभिन्न लाइनों के साथ आरओएस उत्पादन को मापने के लिए प्लेट सेटअप का योजनाबद्ध आरेख। 96-वेल प्लेट का उपयोग करके चावल के ऊतकों का पूर्व-उपचार और परीक्षण। लाइन 1, लाइन 2, और लाइन 3 (एक प्लेट पर आठ लाइनों तक) रुचि की कोई भी सामग्री हो सकती है, विभिन्न खेती, उत्परिवर्ती, या ट्रांसजेनिक लाइनें। आरओएस प्रतिक्रिया को मापने के लिए ऊतकों को पीएएमपी (पीएएमपी, सफेद) या पीएएमपी (डीडीएच 2 ओ, ग्रे) के बिना उपचार समाधानकेसाथ उत्तेजित किया गया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जितना अधिक नमूनों का परीक्षण किया जाना है, रीडिंग के बीच समय अंतराल उतना ही लंबा होगा। संक्षेप: आरओएस = प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां; पीएएमपी = रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न; ddH2O = डबल-डिस्टिल्ड पानी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. समाधान तैयार करना

  1. स्टॉक समाधान बनाने के लिए डीडीएच 2 ओ के साथ एल -012 पाउडर को 20 एमएम (6.23मिलीग्राम / एमएल) जलीय घोल में घोलें। फिर, स्टॉक समाधान को 50 mM Tris HCl बफर (pH 7.5) के साथ पतला करें ताकि 500 μM L-012 की अंतिम एकाग्रता पर काम करने वाला समाधान बनाया जा सके। स्टॉक समाधान को जमे हुए रखें और उपयोग करने से पहले कामकाजी समाधान को पतला करें।
  2. पीएएमपी, एल -012, और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी; डीडीएच2ओ में 10 मिलीग्राम / एमएल) युक्त उपचार समाधान तैयार करें। 10 mL मिश्रण समाधान के लिए, 50 mM Tris HCl (pH 7.5) समाधान का 9.4 mL, L-012 समाधान का 400 μL, HRP का 100 μL, और flg22 का 100 μL (PAMP; ddH2O में 10 mM) मिलाएं। नकारात्मक नियंत्रण के लिए, पीएएमपी के बजाय डीडीएच2ओ के 100 μL जोड़ें।
    नोट: चावल के ऊतकों को ठंडे तनाव से बचने के लिए कमरे के तापमान पर तैयार उपचार समाधान रखें। अन्य पीएएमपी का उपयोग आवश्यकतानुसार उपचार के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि चिटिन (अंतिम एकाग्रता में 20 एनजी / एमएल)। चूंकि एल -012 प्रकाश-संवेदनशील है, इसलिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एल -012 समाधान वाले सभी ट्यूबों को कवर करें।

4. सॉफ्टवेयर शुरू करना और संदर्भित माइक्रोप्लेट रीडर के साथ प्रोटोकॉल स्थापित करना (सामग्री की तालिका देखें)

नोट: माइक्रोप्लेट रीडर सॉफ्टवेयर के मापदंडों को सेट करने में कुछ समय लगता है। समाधान जोड़ने से पहले मशीन और प्रोटोकॉल तैयार करने (आगे बढ़ने के लिए एक क्लिक) प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है।

  1. सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें। नया प्रोटोकॉल बनाने या मौजूदा प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए प्रयोग बटन क्लिक करें.
  2. प्लेट सेट करने के लिए पॉप-अप में प्रक्रिया क्लिक करें. निगरानी के लिए प्लेट से कुओं का चयन करें।
  3. कुल रन टाइम और पठन अंतराल सेट करने के लिए प्रारंभ काइनेटिक क्लिक करें. प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर रन टाइम को 35 मिनट या उससे अधिक पर सेट करें। जितनी बार संभव हो रीडिंग प्राप्त करने के लिए, न्यूनतम अंतराल का चयन करें। एकीकरण समय के लिए, सिग्नल तीव्रता के आधार पर 1 एस या उससे अधिक चुनें।
    नोट: पढ़ने का अंतराल नमूने की संख्या और सिग्नल एकीकरण अवधि पर निर्भर करता है।
  4. मान्य करें पर क्लिक करें | सेटिंग्स की पुष्टि करने के लिए ठीक है।
  5. पॉप-अप में नई प्लेट का पता लगाएं पर क्लिक करें और लोड प्लेट संवाद बॉक्स को संकेत देने के लिए सॉफ़्टवेयर की प्रतीक्षा करें। वाहक पर परीक्षण किए जाने के लिए प्लेट रखें।
  6. सिस्टम स्थापित होने की प्रतीक्षा करने के लिए यहां रुकें (अगले भाग में)। जैसे ही सिस्टम तैयार हो जाता है, रीडिंग शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें।

5. उत्पादन प्रणाली की स्थापना और वास्तविक समय आरओएस उत्पादन को मापना

  1. किसी भी ऊतक क्षति या निर्जलीकरण से बचने के लिए, पूर्वउपचारित ऊतकों वाले कुओं से डीडीएच2ओ को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  2. ऊतकों वाले कुओं में 200 μL का मिश्रण घोल जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
  3. मिश्रण करने के लिए धीरे से हिलाएं। पहचान प्रारंभ करने के लिए चलाएँ क्लिक करें.
    नोट: पीएएमपी उपचार के साथ, पौधे के ऊतक प्रतिक्रिया करते हैं और बहुत जल्दी आरओएस का उत्पादन करते हैं। इसलिए, यह सुझाव दिया जाता है कि ऑपरेशन के समय को कम करने के लिए पीएएमपी के बिना नकारात्मक नियंत्रण का पहले इलाज किया जाए, जब कई उपचार होते हैं। उपचार के बीच देरी को कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके काम करें। समाधान के अतिरिक्त और पहचान की शुरुआत के बीच का समय जितना कम होगा, महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक डेटा का कब्जा उतना ही बेहतर होगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां, हम एफएलजी 22 उपचार के साथ उत्पादित आरओएस को निर्धारित करने के लिए चावल सामग्री को एक उदाहरण के रूप में लेते हैं। उत्पादन के बाद आरओएस की उत्पत्ति क्षणिक है। चावल में, आरओएस उत्पादन में वृद्धि पहली बार 1-2 मिनट में पाई गई थी, 10-12 मिनट पर पहुंच गई थी, और ~ 30-35 मिनट में बेसलाइन पर लौट आई थी (चित्रा 3)। नियंत्रण परीक्षण की तुलना में, जिसमें पीएएमपी एसिटिव समाधान में अनुपस्थित था, जिसके परिणामस्वरूप कोई स्पष्ट आरओएस प्रेरण नहीं था, एक विशिष्ट आरओएस विस्फोट केवल तभी प्रेरित हुआ जब एफएलजी 22, या अन्य पीएएमपी, जैसे चिटिन युक्त समाधान। इस बीच, आरओएस की कुल राशि की गणना वक्र से की जा सकती है (चित्रा 4)।

Figure 3
चित्र 3: चावल के ऊतकों में आरओएस प्रेरण। (A) पत्ती डिस्क (व्यास में 4 मिमी) और (B) 3 मिमी लंबे म्यान का उपयोग flg22 द्वारा ROS को प्रेरित करने के लिए किया गया था। आरओएस उत्पादन की निगरानी 35 मिनट के लिए की जाती है। सलाखों से पांच तकनीकी दोहराव से गणना की गई एसडी के साधनों को इंगित किया जाता है। पढ़ने के डेटा को स्प्रेडशीट में आयात किया गया था। सूत्र "औसत" और "STDEV" लागू करें। प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए प्रतिकृति से क्रमशः औसत मूल्य और मानक त्रुटि की गणना करने के लिए डेटासेट में पी "। फिर, आरओएस मानों (औसत मान और मानक त्रुटि) से वक्र उत्पन्न किए गए थे। संक्षेप: आरओएस = प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां; एफएलजी 22 = 22-एमिनो एसिड फ्लैगेलिन पेप्टाइड; डीडीएच2ओ = डबल-डिस्टिल्ड पानी; आरएलयू = सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: म्यान के साथ उत्पन्न आरओएस की कुल मात्रा। आरओएस की कुल राशि की गणना आमतौर पर परीक्षण से प्राप्त वक्र से की जाती है। यहां दिखाए गए कुल आरओएस राशि की गणना चित्रा 3 ए के अनुरूप वक्र से की गई थी। आरओएस मानों की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक समय अंतराल पर उत्पन्न आरओएस की गणना करने के लिए संबंधित डेटासेट पर सूत्र "= (y3 n + Equation 1n + 1) × समय अंतराल /2" लागू करें, जिसे उत्पन्न कुल राशि की गणना करने के लिए सूत्र "SUM" लागू करके जोड़ा जा सकता है। संक्षेप: आरओएस = प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां; एफएलजी 22 = 22-एमिनो एसिड फ्लैगेलिन पेप्टाइड; ddH2O = डबल-डिस्टिल्ड पानी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: कट एज के उजागर कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन। एक पत्ती डिस्क के एक पूरे या दो हिस्सों को 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं में रखा गया था, जिसे 10-12 घंटे के लिए डीडीएच 2 ओ के 100 μL के साथ इलाज कियागयाथा, और फिर आरओएस प्रेरण के लिए एफएलजी 22 के साथ इलाज किया गया था। दो हाफ-डिस्क नमूनों से पढ़ने के मान पूरे पत्ती डिस्क (ए) की तुलना में बहुत अधिक हैं। औसतन, दो हाफ-डिस्क नमूनों से कुल मान पूरे पत्ती डिस्क (बी) से ~ 1.6 गुना है, जो नमूने के किनारे की लंबाई के आनुपातिक है, न कि क्षेत्र के लिए। यह परिणाम इस बात का समर्थन करता है कि आरओएस मुख्य रूप से घाव स्थल पर कोशिकाओं में उत्पन्न होते हैं। संक्षेप: आरओएस = प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां; एफएलजी 22 = 22-एमिनो एसिड फ्लैगेलिन पेप्टाइड; ddH2O = डबल-डिस्टिल्ड पानी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस अध्ययन का उद्देश्य चावल के ऊतकों में पीएएमपी के जवाब में प्रारंभिक आरओएस उत्पादन को निर्धारित करने के लिए एक अत्यधिक कुशल विधि स्थापित करना था। यह विधि उपचारित चावल के ऊतकों से उत्पादित एपोप्लास्ट आरओएस के वास्तविक समय के निर्धारण के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया प्रदान करती है। यह विधि संचालन में सरल है, लागत में कम है, संरचना में स्पष्ट है, और वाणिज्यिक किट से स्वतंत्र है। इस विधि का उपयोग करके, शोधकर्ता एपोप्लास्ट आरओएस के वास्तविक समय के उत्पादन का अध्ययन कर सकते हैं जब पौधों को जैविक या अजैविक तनाव के अधीन किया जाता है।

इस प्रोटोकॉल में, एल -012 को केमिलुमिनेसेंस अभिकर्मक के रूप में चुना गया था क्योंकि यह एक नॉनटॉक्सिक रसायन है। आरओएस उत्पादन का पता लगाने के लिए केमिल्यूमिनेसेंस परख में लुमिनोल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, लुमिनोल के साथ तीन कमियां हैं, जो इसे चावल और अन्य पौधों के ऊतकों में आरओएस का पता लगाने के लिए अनुपयुक्त बनाती हैं: खराब पानी घुलनशीलता, कम प्रतिक्रिया अवधि और कठोर प्रतिक्रिया पीएच। ल्यूमिनोल केवल क्षारीय परिस्थितियों में प्रकाश का उत्पादन करता है, जिसमें 9.5 पर इष्टतम पीएच होता है, जो पौधों की कोशिकाओं के लिए बहुत कठोर होता है और अवांछनीय प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है। इसके अतिरिक्त, ल्यूमिनोल में एल -012 की तुलना में बहुत कम प्रकाश उत्सर्जन दक्षता होती है, जिसमें तटस्थ या तटस्थ पीएच के पास शारीरिक परिस्थितियों में उच्चतम ल्यूमिनेसेंट संवेदनशीलता होती है। इस प्रकार, एल -012 का उपयोग आरओएस उत्पादन का पता लगाने के लिए जीवित ऊतक या सेल सिस्टम में तेजी से किया जाता है।

पीटीआई प्रतिक्रिया में आरओएस उत्पादन कई आंतरिक या बाहरी कारकों से प्रभावित होता है। इस प्रकार, पीटीआई प्रतिक्रिया में आरओएस प्रेरण में भिन्नता बड़ी है। जितना संभव हो उतना भिन्नताओं को खत्म करने के लिए, यह प्रोटोकॉल परीक्षण स्थितियों को दृढ़ता से नियंत्रित करने के उपाय करता है। सबसे पहले, प्रोटोकॉल में समाधान समाधान के लिए एक 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल बफर सिस्टम लागू किया गया था। यद्यपि कुछ शोधकर्ता आरओएस उत्पादन का परीक्षण करने के लिए अनबफ़र्ड सिस्टम का उपयोग करते हैं, हमने पाया कि एक बफर सिस्टम में डेटा स्थिरता और प्रजनन क्षमता के संबंध में बेहतर प्रदर्शन होता है और नियंत्रण समूह में बेहतर आधार रेखा होती है। दूसरा, लेखक दृढ़ता से नमूने लेने का सुझाव देते हैं जितना संभव हो उतना लगातार।

ऊतकों के बीच असंगति डेटा भिन्नता का एक प्रमुख स्रोत है। यह प्रोटोकॉल एक ही संस्कृति स्थितियों के तहत स्वस्थ पौधों की एक ही पत्ती (संख्या) या म्यान की एक ही स्थिति से ऊतकों को चुनने की सलाह देता है। हम हमेशा मुख्य टिलर के दूसरे पत्ती (शीर्ष से क्रमांकित) के मध्य तीसरे से पत्ती डिस्क काटते हैं और विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों या विभिन्न जीनोटाइप के बीच स्थिरता बनाए रखते हैं। परीक्षण ऊतक के रूप में म्यान का उपयोग करते समय, नमूना प्रक्रिया के दौरान म्यान के कट को ऊर्ध्वाधर रखा जाना चाहिए। यदि कट तिरछा है, तो परिणामी घाव क्षेत्र को सुसंगत नहीं रखा जा सकता है, जिससे अस्थिर प्रयोगात्मक परिणाम होंगे। तीसरा, ऊतकों को धीरे से संचालित किया जाना चाहिए और उसी तरह से इलाज किया जाना चाहिए। परीक्षण ऊतकों पर घाव या चोटों से बचा जाना चाहिए, क्योंकि घाव अधिक कोशिकाओं को उपचार समाधान के लिए उजागर करेगा, जिसके परिणामस्वरूप निस्संदेह डेटा भिन्नता होगी। जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, आरओएस के प्रभाव को मुख्य रूप से उजागर कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। इसके अलावा, आरओएस उत्पादन का मूल्य नाटकीय रूप से कम हो जाएगा जब पढ़ने से ठीक पहले नई क्षति होती है।

पौधे के ऊतकों द्वारा आरओएस के वास्तविक समय के उत्पादन का पता लगाते समय विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक सर्कैडियन घड़ी का प्रभाव है। हमने दिन के अलग-अलग समय पर पढ़ने के मूल्यों में अंतर देखा। यह साबित हो गया है कि सर्कैडियन घड़ी आरओएस के उत्पादन और प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकती है, साथ ही आरओएस से संबंधित जीन के ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन को भी प्रभावित कर सकती है। आरओएस का स्तर पूरे दिन उतार-चढ़ाव होता रहता है, दोपहर में चरम पर पहुंच जाता है औरमध्यरात्रि 14 पर गिर जाता है। सारांश में, यह उच्च-थ्रूपुट प्रक्रिया कई नमूनों का एक साथ पता लगाने की अनुमति देती है, जो आरओएस उत्पादन पर सर्कैडियन घड़ी के प्रभाव से बचने में मदद कर सकती है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, हम दिन के एक ही समय में जैविक प्रतिकृति करने की सलाह देते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को शंघाई नेचुरल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या: 21ZR1429300/ BS1500016), शंघाई जिओ टोंग विश्वविद्यालय (एग्री-एक्स प्रोग्राम, अनुदान संख्या: AF1500088/002), शंघाई सहयोगी नवाचार केंद्र ऑफ एग्री-सीड्स (अनुदान संख्या: ZXWH2150201/001) से जियांगबो फैन को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microtiter plate WHB WHB-96-01
Ethanol absolute Innochem A43543
flg22 Sangon Biotech p20973 PAMP
Gen5 BioTek software
L-012 FUJIFILM 120-04891 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5
Microplate reader BioTek Synergy 2
MS Medium Solarbio M8521
NaCLO Aladdin S101636
Peroxidase from horseradish (HRP) Sigma P8375
Phytagel Sigma P8169
Sampler Miltex  15110-40
Sucrose Sangon Biotech A502792
Tris Sangon Biotech A610195

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
  2. Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).
  3. Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
  4. Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
  5. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
  6. Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
  7. Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
  8. Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
  9. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  10. Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
  11. Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
  12. Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
  13. Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
  14. Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).

Tags

वापसी अंक 189
केमिलुमिनेसेंस परख के साथ चावल में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन का वास्तविक समय पता लगाना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., An, Z., Zhao, Z., Li, C.,… More

Wang, Y., An, Z., Zhao, Z., Li, C., Fan, J. Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay. J. Vis. Exp. (189), e64776, doi:10.3791/64776 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter