Summary
여기에서 우리는 병원체 관련 분자 패턴 유발 면역 반응에서 벼 조직에서 아포플라스틱 활성 산소 종(ROS) 생성을 실시간으로 검출하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 간단하고 표준화되어 있으며 통제된 조건에서 재현성이 높은 결과를 생성합니다.
Abstract
활성 산소 종(ROS)은 비생물적 및 생물학적 스트레스 감지를 포함한 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 병원체 감염 또는 병원체 관련 화학 물질(병원체 관련 분자 패턴[PAMP])에 대한 도전 시, ROS 버스트를 포함한 일련의 면역 반응이 식물에서 빠르게 유도되며, 이를 PAMP 유발 면역(PTI)이라고 합니다. ROS 버스트는 특징적인 PTI 반응으로, 원형질막에 국한된 NADPH 산화효소(RBOH 계열 단백질) 그룹에 의해 촉매됩니다. 대부분의 ROS는 과산화수소(H2O2)를 포함하며, 이는 루미놀 기반 화학발광법으로 쉽고 안정적으로 검출할 수 있습니다. 화학발광은 루미놀 또는 그 유도체(예: L-012)가 촉매의 작용으로 ROS와 산화환원 반응을 겪는 광자 생성 반응입니다. 이 논문은 벼 조직에서 PAMP 추출 시 실시간으로 아포플라스트 ROS 생성을 감지하기 위해 최적화된 L-012 기반 화학발광 방법을 설명합니다. 이 방법은 확실하게 통제된 조건에서 쉽고, 안정적이며, 표준화되고, 재현성이 높습니다.
Introduction
활성산소종(ROS)은 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(O2-)과 그 유도체, 하이드록실 라디칼(OH-), 과산화수소, 일중항 산소 또는 산화환원 반응의 산물을 포함한 일련의 화학적 활성 산소 유도체로 구성되며, 색소체와 엽록체, 미토콘드리아, 퍼옥시좀 및 기타 세포 이하 위치에서 지속적으로 생성됩니다1 . ROS는 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하며 모든 식물에 필수적입니다 2,3,4. ROS 기능의 광범위한 스펙트럼은 성장과 발달의 조절에서 비생물적 및 생물학적 스트레스의 인식에 이르기까지 다양합니다 5,6,7,8.
식물 면역계에서 식물 세포 원형질막-국소화된 수용체-소위 패턴 인식 수용체(PRR)-병원체 유래 화학 물질-병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 인식합니다. 이 인식은 칼슘 유입, ROS 버스트 및 MAPK 캐스케이드를 포함한 일련의 빠른 면역 반응을 유발합니다. 따라서 이 면역 층을 PAMP 유발 면역(PTI)이라고 합니다. ROS 버스트는 특징적인 PTI 반응이며, 그 결정은 PTI 관련 연구 9,10에 널리 적용됩니다. PAMP에 의해 유발된 ROS 생성은 세포질 NADPH 또는 NADH에서 세포외 산소로 전자를 전달하여 슈퍼옥사이드(O2-)를 생성하고, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)에 의해 자발적으로 과산화수소(H2O2)로 전환되는 원형질막 상주(Plasma membrane-resident NADPH oxidase) 또는 호흡 버스트 산화효소 상동체(RBOH) 계열 단백질에 기인합니다8 . PAMP 유발 ROS 버스트는 매우 빠르며 PAMP 치료 후 몇 분 만에 나타나고 ~10-12분에 최고조에 달합니다. ROS 분자의 대다수는 과산화수소(H2O2)를 포함하며, 이는 화학발광 분석법으로 쉽고 안정적으로 검출할 수 있습니다.
화학발광에서, 화학발광 시약은 촉매의 작용하에 활성 산소와 반응하여 여기 상태 중간체들을 생성한다. 그런 다음 제품의 전자는 비방사 전이를 통해 바닥 상태로 돌아가 광자를 방출합니다. 일반적인 화학발광 시약에는 루미놀 및 L-012가 포함되며, 루미놀은 응용 분야11,12,13을 지배합니다. 그러나 L-012는 루미놀에 비해 중성 또는 중성에 가까운 pH 조건에서 발광 효율이 훨씬 높기 때문에 더 많은 연구자들이 ROS 생성을 감지하기 위해 L-012를 선택하고 있습니다.
이 논문은 벼(Oryza sativa) 조직-잎 디스크 및 외피에서 PAMP를 추출한 후 ROS 생산의 실시간 검출을 위해 L-012를 기반으로 최적화된 화학발광 방법을 설명합니다. 여기에 제공된 방법은 간단하고 안정적이며 표준화되어 있으며 다양한 실험 요구 사항을 충족할 수 있도록 적응성이 뛰어납니다. 이 방법으로 얻은 데이터는 확고하게 제어된 조건에서 재현성이 높습니다.
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Protocol
참고: 프로토콜은 다양한 식물 조직에 적용할 수 있습니다. 벼집과 잎 디스크는 PAMP 추출 시 ROS 검출을 위해 이 프로토콜에서 사용되었습니다. 주로 샘플링 방법으로 인해 차이가 발생하므로 아래에서는 일반적인 절차만 설명하고 필요한 경우 특정 단계를 언급합니다.
1. 식물 배양
- 껍질을 벗긴 벼 종자를 70% 에탄올로 1분 동안 소독한 다음 40% 차아염소산나트륨(NaClO)으로 1시간 동안 소독합니다. 그런 다음 씨앗을 멸균 수로 5 배 헹구어 잔류 염소를 제거합니다.
- 씨앗을 1/2 MS 배지(2.37g/L Murashige 및 Skoog(MS) 배지, 30g/L 자당, 2.1g/L 피타젤, pH 5.7, 오토클레이브)에 무균 상태로 플레이트합니다.
- 쌀집 방법에서는 멸균 유리 용기에 있는 씨앗을 MS 배지로 직접 도금합니다.
- 잎 디스크 방법에서 씨앗을 MS 플레이트에 5-7일 동안 플레이트하고 성장 매트릭스 또는 토양에 이식합니다(그림 1A).
- 12 h light / 12 h dark photoperiod가있는 성장실에서 묘목을 재배하십시오.
2. 조직 준비 및 전처리
- 쌀집
- ROS 분석 1일 전에 전처리를 위해 날카로운 면도날이나 수술용 칼날을 사용하여 10일 된 벼 묘목의 칼집을 3mm 조각으로 자릅니다(그림 1B).
- 25°C의 암실에서 10-12시간 동안 100μL의ddH2O를 포함하는 96웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 5개의 시스 세그먼트를 배치하여 상처 손상 관련 이온 누출 및 방어 반응을 감소시킵니다(그림 2).
알림: 추출 용액에 노출된 일관된 절단 표면적을 보장하기 위해 절단을 수직으로 유지하도록 주의하는 것은 재현성이 높은 결과를 얻기 위한 중요한 단계입니다. 세그먼트를 부드럽게 움직입니다. 데이터 변동의 원인이 될 수 있는 세그먼트에 추가 절단이나 상처를 입히지 마십시오. 원칙적으로 각 검정에는 ROS 값의 변동이 크기 때문에 최소 5번의 반복실험이 포함되어야 합니다. 반복실험 집합이 많을수록 데이터의 신뢰성이 높아집니다.
- 리프 디스크
- 플런저가 달린 생검 펀치를 사용하여 4-6 주 된 벼에서 잎 디스크 (직경 4mm)를 자릅니다. 데이터 변동을 줄이기 위해 항상 주 경운기의 두 번째 잎(상단에서 번호가 매겨짐)의 중간 1/3에서 잎 디스크를 자릅니다(그림 1C).
- 전처리를 위해 10-12시간 동안 100μL의ddH2O가 포함된 96웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 리프 디스크 하나를 배치하면 PAMP에 의한 ROS 유도를 방해할 수 있으므로 상처 관련 반응이 감소할 수 있습니다(그림 2).
알림: 리프 디스크를 부드럽게 작동하십시오. 실험에서 디스크에 추가 상처나 상처를 입히지 마십시오. ROS의 유도는 벼 조직(잎 또는 외피)의 표면이 소수성 층으로 덮여 있기 때문에 절단면의 세포에서 주로 발생합니다. 절단면의 셀만 유도 용액과 접촉합니다(토론 섹션 참조). - 잎 측면과 관련된 변화를 피하기 위해 물 전처리를 위해 미세 역가 플레이트의 우물에서 모든 잎 디스크를 축 표면이 위를 향하도록 부동 상태로 유지하십시오.
그림 1: 칼집 샘플링을 위한 벼 묘목의 성장 조건 및 단계, 분석에 사용된 벼 칼집 및 벼 잎의 일부. (A) 10일 동안 무균 조건에서 1/2 MS 배지에서 자란 벼 묘목은 ROS 분석을 위해 샘플링할 수 있습니다. 멸균된 벼 종자를 1/2 MS 배지에서 배양하고 직경 8.5cm, 높이 15cm의 투명 유리 바이알에서 12시간 밝게/12시간 어두운 광주기에서 성장시켰습니다. (B) 잎집의 샘플링 부분의 개략도. 잎집은 10 일 된 벼 묘목에서 잘라냈습니다. 잎집의 위치는 뿌리 위와 첫 번째 잎 아래에있었습니다. (C) 리프 디스크의 샘플링 위치 개략도. 잎 디스크는 모든 성장 단계에서 건강한 벼의 주 경운기의 두 번째 잎의 중간 1/3 (상단에서 계산)에서자를 수 있습니다. 약어: ROS = 활성 산소 종; MS = 무라시게와 스쿠그. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Oryza sativa의 다양한 라인으로 ROS 생산을 측정하기 위한 플레이트 설정의 개략도. 96-well plate를 이용한 벼 조직의 전처리 및 시험. 라인 1, 라인 2 및 라인 3(한 플레이트에 최대 8개의 라인)은 관심 있는 모든 재료, 다른 품종, 돌연변이 또는 형질전환 라인이 될 수 있습니다. ROS 반응을 측정하기 위해 PAMP(PAMP, 흰색) 또는 PAMP가 없는 (ddH2O, 회색)의 유도 용액으로 조직을 자극하였다. 테스트 할 샘플이 많을수록 판독 사이의 시간 간격이 길어집니다. 약어: ROS = 활성 산소 종; PAMP = 병원체-관련 분자 패턴; ddH2O= 이중 증류수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 유도 용액 준비
- L-012 분말을 ddH 2O가 포함된 20mM(6.23mg/mL) 수용액에 용해시켜 원액을 만듭니다. 그런 다음 원액을 50mM Tris HCl 완충액(pH 7.5)으로 희석하여 최종 농도 500μM L-012로 작업액을 만듭니다. 사용하기 전에 원액을 동결 상태로 유지하고 작업 용액으로 희석하십시오.
- PAMP, L-012 및 양 고추 냉이 과산화효소(HRP; ddH2O 중 10mg/mL)를 포함하는 유도 용액을 준비합니다. 10 mL 유도 용액의 경우, 9.4 mL의 50 mM Tris HCl (pH 7.5) 용액, 400 μL의 L-012 용액, 100 μL의 HRP, 및 100 μL의 flg22 (PAMP; 10 mM in ddH2O)를 혼합한다. 음성 대조군의 경우 PAMP 대신ddH2O100μL를 추가합니다.
알림: 쌀 조직에 차가운 스트레스가 가해지지 않도록 준비된 추출 용액을 실온에 보관하십시오. 키틴(최종 농도 20ng/mL)과 같은 다른 PAMP도 필요에 따라 치료에 사용할 수 있습니다. L-012는 빛에 민감하므로 L-012 용액이 들어 있는 모든 튜브를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
4. 참조된 마이크로플레이트 리더로 소프트웨어 시작 및 프로토콜 설정(재료 표 참조)
알림: 마이크로플레이트 리더 소프트웨어의 매개변수를 설정하는 데 시간이 걸립니다. 유도 솔루션을 추가하기 전에 기계와 프로토콜을 준비하는 것이 좋습니다(한 번의 클릭으로 진행).
- 소프트웨어를 시작합니다. 실험 버튼을 클릭하여 새 프로토콜을 만들거나 기존 프로토콜을 사용합니다.
- 팝업에서 절차를 클릭하여 플레이트를 설정합니다. 플레이트에서 모니터링할 웰을 선택합니다.
- Start Kinetic을 클릭하여 총 실행 시간과 읽기 간격을 설정합니다. 실험 요구 사항에 따라 실행 시간을 35분 이상으로 설정합니다. 가능한 한 자주 판독값을 얻으려면 최소 간격을 선택합니다. 통합 시간의 경우 신호 강도에 따라 1초 이상을 선택합니다.
알림: 판독 간격은 s의 수에 따라 다릅니다.amples 및 신호 통합 지속 시간. - Validate(검증) | 확인을 눌러 설정을 확인합니다.
- 팝업에서 새 플레이트 감지 를 클릭하고 소프트웨어가 로드 플레이트 대화 상자를 표시할 때까지 기다립니다. 테스트할 플레이트를 캐리어에 놓습니다.
- 여기에서 멈추고 유도 시스템이 설정될 때까지 기다리십시오(다음 섹션에서). 유도 시스템이 준비되면 실행을 클릭하여 읽기를 시작합니다.
5. 유도 시스템 구축 및 실시간 ROS 생산 측정
- 전처리된 조직을 함유하는 웰로부터ddH2O를 조심스럽게 제거하여, 임의의 조직 손상 또는 건조를 방지한다.
- 다채널 피펫을 사용하여 200 μL의 유도 용액을 조직이 들어 있는 웰에 추가합니다.
- 부드럽게 흔들어 섞습니다. Run(실행 )을 클릭하여 검색을 시작합니다.
참고: PAMP 처리를 통해 식물 조직은 반응하여 ROS를 매우 빠르게 생성합니다. 따라서 여러 번의 치료가 있는 경우 수술 시간을 줄이기 위해 PAMP가 없는 음성 대조군을 먼저 치료하는 것이 좋습니다. 치료 사이의 유도 지연을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 작동하십시오. 유도 용액 추가와 검출 시작 사이의 시간이 짧을수록 중요한 실험 데이터를 더 잘 캡처할 수 있습니다.
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Representative Results
여기서는 flg22 처리로 생성된 ROS를 결정하기 위해 쌀 재료를 예로 들어 보겠습니다. 유도 후 ROS의 생성은 일시적입니다. 벼에서 ROS 생산의 증가는 1-2분 안에 처음 감지되었고 10-12분에 최고조에 달했으며 ~30-35분 후에 기준선으로 돌아왔습니다(그림 3). 명백한 ROS 유도를 초래하지 않는 유도 용액에 PAMP가 없는 대조 테스트와 비교하여, 특정 ROS 버스트는 flg22 또는 키틴과 같은 다른 PAMP를 포함하는 유도 용액에서만 유도되었습니다. 한편, ROS의 총량은 곡선에서 계산할 수 있습니다(그림 4).
그림 3: 벼 조직의 ROS 유도. (A) 잎 디스크(직경 4mm) 및 (B) 3mm 길이의 덮개를 사용하여 flg22에 의한 ROS를 유도했습니다. ROS 생성은 35분 동안 모니터링됩니다. 막대는 5개의 기술 반복에서 계산된 SD 평균을 나타냅니다. 판독 데이터를 스프레드시트로 가져왔습니다. 수식 "AVERAGE" 및 "STDEV. P"를 데이터 세트에 추가하여 각 데이터 포인트에 대한 반복실험에서 평균값과 표준 오차를 각각 계산합니다. 그런 다음 ROS 값(평균값 및 표준 오차)에서 곡선을 생성했습니다. 약어: ROS = 활성 산소 종; flg22 = 22-아미노산 편모 펩티드; ddH2O= 이중 증류수; RLU = 상대 발광 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 피복으로 생성된 ROS의 총량. ROS의 총량은 일반적으로 테스트에서 얻은 곡선에서 계산됩니다. 여기에 표시된 총 ROS 양은 그림 3A에 해당하는 곡선에서 계산되었습니다. ROS 값의 총량을 구하려면 해당 데이터셋에 "= (y̅ n+ 
n + 1) × time interval/2" 공식을 적용하여 각 시간 간격에서 생성된 ROS를 계산하고, 이를 조합하여 "SUM" 공식을 적용하여 생성된 총 양을 계산할 수 있습니다. 약어: ROS = 활성 산소 종; flg22 = 22-아미노산 편모 펩티드; ddH2O= 이중 증류수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 절단면의 노출된 셀에서 ROS 생성. 잎 디스크의 단일 전체 또는 두 개의 반쪽을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣고, 10-12시간 동안 100 μL의 ddH2O로 전처리한 다음, ROS 유도를 위해flg22로 처리하였다. 두 개의 하프 디스크 샘플의 판독 값은 전체 리프 디스크 (A)의 판독 값보다 훨씬 높습니다. 평균적으로 두 개의 하프 디스크 샘플의 총 값은 전체 잎 디스크 (B)의 총 값보다 ~ 1.6 배 더 높으며, 이는 샘플의 면적이 아닌 가장자리 길이에 비례합니다. 이러한 결과는 ROS가 주로 상처 부위의 세포에서 생성된다는 것을 뒷받침한다. 약어: ROS = 활성 산소 종; flg22 = 22-아미노산 편모 펩티드; ddH2O= 이중 증류수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구의 목적은 벼 조직에서 PAMP에 대한 반응으로 초기 ROS 생산을 정량화하는 매우 효율적인 방법을 확립하는 것이었습니다. 이 방법은 처리된 벼 조직에서 생성된 아포플라스트 ROS의 실시간 측정을 위한 표준화된 절차를 제공합니다. 이 방법은 작동이 간단하고 비용이 저렴하며 구성이 명확하고 상용 키트와 무관합니다. 이 방법을 사용하여 연구자들은 식물이 생물학적 또는 비생물적 스트레스를 받을 때 아포플라스트 ROS의 실시간 생산을 연구할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 L-012는 무독성 화학 물질이므로 화학 발광 시약으로 선택되었습니다. 루미놀은 ROS 생성을 검출하기 위한 화학발광 분석에 널리 사용됩니다. 그러나 루미놀에는 쌀 및 기타 식물 조직에서 ROS 검출에 적합하지 않은 세 가지 단점이 있습니다: 낮은 수용성, 짧은 반응 지속 시간 및 가혹한 반응 pH. 루미놀은 최적의 pH가 9.5인 알칼리성 조건에서만 빛을 생성하는데, 이는 식물 세포에 너무 가혹하고 바람직하지 않은 반응을 유도합니다. 또한 루미놀은 중성 또는 중성에 가까운 pH에서 생리학적 조건에서 가장 높은 발광 감도를 갖는 L-012보다 훨씬 낮은 발광 효율을 가지고 있습니다. 따라서 L-012는 ROS 생성을 감지하기 위해 생체 조직 또는 세포 시스템에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다.
PTI 반응에서 ROS 생성은 많은 내부 또는 외부 요인의 영향을 받습니다. 따라서, PTI 반응에서 ROS 유도의 변동이 크다. 가능한 한 변형을 제거하기 위해 이 프로토콜은 테스트 조건을 확고하게 제어하기 위한 조치를 취합니다. 먼저, 50 mM Tris-HCl 완충 시스템을 프로토콜의 유도 용액에 적용하였다. 일부 연구자들은 ROS 생산을 테스트하기 위해 버퍼링되지 않은 시스템을 사용하지만, 우리는 버퍼 시스템이 데이터 일관성 및 재현성 측면에서 더 나은 성능을 가지며 대조군에서 더 나은 기준선을 갖는다는 것을 발견했습니다. 둘째, 저자는 가능한 한 일관되게 샘플을 채취 할 것을 강력히 제안합니다.
조직 간의 불일치는 데이터 변동의 주요 원인입니다. 이 프로토콜은 동일한 배양 조건에서 동일한 잎(번호) 또는 건강한 식물의 외피의 동일한 위치에서 조직을 선택할 것을 권장합니다. 우리는 항상 주 경운기의 두 번째 잎 (상단에서 번호가 매겨짐)의 중간 1/3에서 잎 디스크를 자르고 다른 실험 그룹 또는 다른 유전자형 간의 일관성을 유지합니다. 칼집을 테스트 조직으로 사용할 때 샘플링 과정에서 칼집 절단을 수직으로 유지해야 합니다. 절단이 비스듬하면 결과 상처 부위를 일정하게 유지할 수 없어 실험 결과가 불안정해집니다. 셋째, 조직은 부드럽게 작동하고 동일한 방식으로 전처리되어야 합니다. 상처는 더 많은 세포를 유도 용액에 노출시켜 의심할 여지 없이 데이터 변동을 초래할 수 있으므로 테스트 조직의 상처나 부상을 피해야 합니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 ROS의 유도는 주로 노출된 세포에 기인합니다. 또한 판독 직전에 새로운 손상이 발생하면 ROS 생산의 가치가 크게 감소합니다.
식물 조직에 의한 ROS의 실시간 생산을 감지할 때 고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 생체 시계의 효과입니다. 우리는 하루 중 다른 시간에 판독 값의 차이를 발견했습니다. 생체 시계가 ROS의 생성 및 반응뿐만 아니라 ROS 관련 유전자의 전사 조절에 영향을 미칠 수 있음이 입증되었습니다. ROS의 수준은 하루 종일 변동하여 정오에 최고조에 도달하고자정 14에 떨어집니다. 요약하면, 이 고처리량 절차를 통해 여러 샘플을 동시에 검출할 수 있으므로 ROS 생산에 대한 생체 시계의 영향을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 하루 중 같은 시간에 생물학적 복제를 수행하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Shanghai Natural Science Foundation(보조금 번호: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University(Agri-X 프로그램, 보조금 번호:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds(보조금 번호: ZXWH2150201/001)의 보조금으로 Jiangbo Fan에, Shanghai Jiao Tong Univesity의 의료-공학 협력 프로젝트(보조금 번호: 21X010301734)가 Can Li에 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
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