Summary
Здесь мы описываем метод обнаружения в режиме реального времени продукции апопластических активных форм кислорода (АФК) в тканях риса в иммунном ответе, вызванном патогенным молекулярным паттерном. Этот метод прост, стандартизирован и дает высоковоспроизводимые результаты в контролируемых условиях.
Abstract
Активные формы кислорода (АФК) играют жизненно важную роль в различных биологических процессах, включая обнаружение абиотических и биотических стрессов. При заражении патогеном или контакте с химическими веществами, связанными с патогенами (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны [PAMP]), в растениях быстро индуцируется множество иммунных реакций, включая взрыв АФК, что называется иммунитетом, вызванным PAMP (PTI). Всплеск АФК является отличительной реакцией PTI, которая катализируется группой локализованных в плазматической мембране НАДФН-оксидаз - белков семейства RBOH. Подавляющее большинство АФК содержит перекись водорода (H2O2), которая может быть легко и стабильно обнаружена методом хемилюминесценции на основе люминола. Хемилюминесценция представляет собой реакцию, продуцирующую фотоны, в которой люминол или его производное (например, L-012) подвергается окислительно-восстановительной реакции с АФК под действием катализатора. В этой статье описывается оптимизированный метод хемилюминесценции на основе L-012 для обнаружения продукции апопласта АФК в режиме реального времени при выявлении PAMP в тканях риса. Метод прост, устойчив, стандартизирован и легко воспроизводим в строго контролируемых условиях.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК) включают ряд химически активных производных кислорода, включая супероксидные анионные радикалы (O2-) и его производные, гидроксильные радикалы (OH-), перекись водорода и продукты синглетного кислорода или окислительно-восстановительных реакций, которые постоянно образуются в пластидах и хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и других субклеточных участках 1 . АФК играют важную роль во многих биологических процессах и необходимы для всех растений 2,3,4. Широкий спектр функций АФК варьируется от регуляции роста и развития до восприятия абиотических и биотических стрессов 5,6,7,8.
В иммунной системе растений рецепторы, локализованные в плазматической мембране растительных клеток - так называемые рецепторы распознавания образов (PRR) - воспринимают химические вещества, полученные из патогенов, - молекулярные паттерны, связанные с патогенами (PAMP). Это распознавание запускает серию быстрых иммунных реакций, включая приток кальция, взрыв АФК и каскад MAPK; таким образом, этот уровень иммунитета называется иммунитетом, вызванным PAMP (PTI). Всплеск АФК является отличительной реакцией PTI, определение которой широко применяется в исследованиях, связанных с PTI 9,10. Продукция АФК, инициируемая PAMP, объясняется резидентной плазматической мембраной белками семейства НАДФН-оксидазы или гомолога респираторной взрывооксидазы (RBOH), которые переносят электроны из цитозольного НАДФН или НАДН во внеклеточный кислород с образованием супероксида (O2-), который спонтанно превращается в перекись водорода (H2O2O2) супероксиддисмутазой8 . Всплеск АФК, вызванный PAMP, довольно быстрый, появляется всего через несколько минут после лечения PAMP и достигает пика через ~ 10-12 минут. Подавляющее большинство молекул АФК содержит перекись водорода (H2O2), которую можно легко и стабильно обнаружить с помощью хемилюминесцентного анализа.
При хемилюминесценции хемилюминесцентный реагент реагирует с активным кислородом под действием катализатора с образованием промежуточных продуктов возбужденного состояния. Затем электроны в продукте возвращаются в основное состояние посредством безызлучательного перехода и испускают фотоны. Общие хемилюминесцентные реагенты включают люминол и L-012, причем люминол доминирует в применении11,12,13. Тем не менее, все больше исследователей выбирают L-012 для обнаружения образования АФК, поскольку L-012 имеет гораздо более высокую эффективность светового излучения в нейтральных или почти нейтральных условиях pH по сравнению с люминолом.
В данной работе описывается оптимизированный метод хемилюминесценции, основанный на L-012, для обнаружения продукции АФК в режиме реального времени после выявления PAMP в тканях риса (Oryza sativa), листовых дисках и оболочке. Представленный здесь метод прост, стабилен и стандартизирован и легко адаптируется к различным экспериментальным потребностям. Данные, полученные с помощью этого метода, обладают высокой воспроизводимостью в строго контролируемых условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол применим к различным тканям растений. Рисовая оболочка и листовые диски использовались в этом протоколе для обнаружения АФК при выявлении PAMP. Поскольку различия возникают главным образом из-за метода отбора проб, ниже описываются только общие процедуры, при этом при необходимости упоминаются конкретные шаги.
1. Растительная культура
- Стерилизуйте очищенные от шелухи семена риса 70% этанолом в течение 1 мин, затем 40% гипохлоритом натрия (NaClO) в течение 1 ч. Затем промойте семена 5 раз стерильной водой, чтобы удалить остатки хлора.
- Положите семена асептически на среду 1/2 мс (2,37 г/л среды Murashige и Skoog (MS), 30 г/л сахарозы, 2,1 г/л фитагеля, pH 5,7, автоклавированная).
- В методе рисовой оболочки непосредственно помещают семена в стерильный стеклянный сосуд со средой MS.
- При методе листового диска поместите семена на пластины MS на 5-7 дней и пересадите их в матрицу роста или почву (рис. 1А).
- Выращивайте рассаду в комнате для роста с 12-часовым светлым / 12-часовым темным фотопериодом.
2. Подготовка и предварительная обработка тканей
- Рисовая оболочка
- Острым бритвенным лезвием или хирургическим лезвием разрежьте оболочку с 10-дневных проростков риса на сегменты по 3 мм для предварительной обработки за 1 день до анализа АФК (рис. 1Б).
- Поместите пять сегментов оболочки в отдельную лунку 96-луночной микротитровальной пластины, содержащей 100 мкл ddH 2 O,в течение 10-12 часов в темноте при 25 ° C, что позволяет снизить утечку ионов, связанную с повреждением раны, и защитные реакции (рис. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Забота о том, чтобы разрезы были вертикальными, чтобы обеспечить постоянную площадь режущей поверхности, подверженную воздействию раствора, является важным шагом для получения высоковоспроизводимых результатов. Аккуратно перемещайте сегменты. Не делайте лишних порезов или ран на сегментах, которые могут быть источником отклонения данных. В принципе, каждый тест должен содержать не менее пяти повторений, поскольку вариация значения АФК велика. Чем больше реплик установлено, тем надежнее данные.
- Листовой диск
- Срежьте листовые диски (диаметром 4 мм) с 4-6-недельных рисовых растений с помощью пуансона для биопсии с поршнем. Всегда обрезайте листовые диски от средней трети второго листа (пронумерованного сверху) основного культиватора, чтобы уменьшить отклонение данных (рис. 1C).
- Поместите один листовой диск в отдельную лунку 96-луночной микротитровальной пластины, содержащей 100 мкл ddH2 O, в течение 10-12 ч для предварительной обработки, что позволяет ослабить реакции, связанные с ранами, поскольку они могут мешать индукции АФК PAMP (рис. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно обращайтесь с листовыми дисками. Не делайте лишних порезов или ран на дисках в эксперименте, которые могут привести к изменению данных. Индукция АФК в основном происходит из клеток края среза, так как поверхности рисовых тканей (листьев или оболочек) покрыты гидрофобными слоями. Только ячейки срезанных кромок соприкасаются с раствором для выталкивания (см. раздел обсуждения). - Держите все листовые диски плавающими, абаксиальной поверхностью вверх, в лунках микротитровальной пластины для предварительной обработки воды, чтобы избежать отклонений, связанных со стороной листа.
Рисунок 1: Условия роста и стадии проростков риса для отбора проб оболочки и частей рисовой оболочки и листьев риса, используемых в анализе. (A) Проростки риса, выращенные на среде 1/2 мс в стерильных условиях в течение 10 дней, могут быть отобраны для анализа АФК. Стерилизованные семена риса культивировали на среде 1/2 мс и выращивали в 12-часовом светлом/12-часовом темном фотопериоде во флаконе из прозрачного стекла диаметром 8,5 см и высотой 15 см. (B) Принципиальная схема частей отбора проб листовых оболочек. Листовые влагалища были срезаны с 10-дневных рассад риса. Положения листовых влагалищ были над корнями и ниже первого листа. С) Принципиальная схема положения отбора проб листовых дисков. Листовые диски можно срезать со средней трети второго листа (считай от верхушки) основного культиватора здоровых растений риса на любой стадии роста. Сокращения: АФК = активные формы кислорода; MS = Murashige и Skoog. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Принципиальная схема пластинчатой установки для измерения производства АФК с различными линиями Oryza sativa. Предварительная обработка и тестирование рисовых тканей с использованием 96-луночной пластины. Линия 1, линия 2 и линия 3 (до восьми линий на одной пластине) могут представлять собой любой интересующий материал, различные сорта, мутанты или трансгенные линии. Ткани стимулировали элекуционными растворами с PAMP (PAMP, белый) или без PAMP (ddH2O, серый) для измерения реакции АФК. Следует отметить, что чем больше образцов подлежащих испытанию, тем больше временной интервал между показаниями. Сокращения: АФК = активные формы кислорода; PAMP = молекулярный паттерн, связанный с патогеном; ddH2O = вода двойной дистилляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Приготовление раствора для выявления
- Растворите порошок L-012 в 20 мМ (6,23 мг / мл) водном растворе с ddH2O, чтобы получить исходный раствор. Затем разбавьте исходный раствор буфером 50 мМ Tris HCl (pH 7,5), чтобы получить рабочий раствор с конечной концентрацией 500 мкМ L-012. Храните исходный раствор в замороженном состоянии и разбавьте рабочим раствором перед использованием.
- Приготовьте экстрактивный раствор, содержащий PAMP, L-012 и пероксидазу хрена (HRP; 10 мг / мл в ddH2O). Для получения 10 мл раствора для выведения смешайте 9,4 мл 50 мМ раствора Tris HCl (pH 7,5), 400 мкл раствора L-012, 100 мкл HRP и 100 мкл flg22 (PAMP; 10 мМ в ddH2O). Для отрицательного контроля добавьте 100 мкл ddH2O вместо PAMP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните приготовленные растворы при комнатной температуре, чтобы избежать холодового стресса для рисовых тканей. Другие PAMP также могут быть использованы для лечения по мере необходимости, такие как хитин (20 нг / мл в конечной концентрации). Поскольку L-012 чувствителен к свету, накройте все трубки, содержащие раствор L-012, алюминиевой фольгой.
4. Запуск программного обеспечения и настройка протокола с помощью эталонного считывателя микропланшетов (см. Таблицу материалов)
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка параметров программного обеспечения для считывания микропланшетов занимает некоторое время. Рекомендуется подготовить машину и протокол (один щелчок, чтобы продолжить) перед добавлением решения для выявления.
- Запустите программное обеспечение. Нажмите кнопку «Эксперименты », чтобы создать новый протокол или использовать существующий протокол.
- Нажмите «Процедура» во всплывающем окне, чтобы настроить пластину. Выберите скважины из плиты, которую нужно контролировать.
- Нажмите кнопку Start Kinetic , чтобы настроить общее время выполнения и интервал чтения. Установите время выполнения на 35 минут или больше, в зависимости от экспериментальных требований. Чтобы получать показания как можно чаще, выберите «Минимальный интервал». Для времени интеграции выберите 1 с или больше, в зависимости от интенсивности сигнала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал считывания зависит от количества выборок и длительности интегрирования сигнала. - Нажмите кнопку Проверить | OK для подтверждения настроек.
- Нажмите « Обнаружить новую пластину» во всплывающем окне и подождите, пока программа предложит диалоговое окно загрузочной пластины. Поместите тестируемую пластину на держатель.
- Остановитесь здесь, чтобы дождаться установки системы выявления (в следующем разделе). Как только система выявления будет готова, нажмите « Выполнить », чтобы начать чтение.
5. Создание системы выявления и измерение производства АФК в режиме реального времени
- Осторожно удалите ddH2O из лунок, содержащих предварительно обработанные ткани, избегая повреждения или высыхания тканей.
- Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 200 мкл раствора для стимуляции в лунки, содержащие ткани.
- Аккуратно встряхните, чтобы перемешать. Нажмите кнопку Выполнить , чтобы начать обнаружение.
ПРИМЕЧАНИЕ: При лечении PAMP растительные ткани реагируют и очень быстро вырабатывают АФК. Поэтому предлагается, чтобы отрицательный контроль без PAMP был обработан в первую очередь, чтобы сократить время операции, когда есть несколько обработок. Действуйте как можно быстрее, чтобы уменьшить задержку между процедурами. Чем короче время между добавлением решения для выявления и началом обнаружения, тем лучше будет сбор важных экспериментальных данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы берем рисовый материал в качестве примера для определения АФК, полученных при обработке flg22. Генерация АФК после выявления является преходящей. В рисе увеличение продукции АФК было впервые обнаружено через 1-2 мин, достигло пика через 10-12 мин и вернулось к исходному уровню через ~ 30-35 мин (рис. 3). По сравнению с контрольным тестом, в котором PAMP отсутствовал в растворе для стимуляции, что приводило к отсутствию очевидной индукции АФК, специфический всплеск АФК индуцировался только тогда, когда раствор для выявления, содержащий flg22 или другой PAMP, такой как хитин. Между тем, общее количество АФК можно рассчитать по кривой (рис. 4).
Рисунок 3: Индукция АФК в тканях риса. (A) Листовые диски (диаметром 4 мм) и (B) оболочки длиной 3 мм использовались для индукции АФК с помощью flg22. Генерация АФК контролируется в течение 35 мин. Столбцы обозначают среднее значение SD, рассчитанное из пяти технических повторов. Данные чтения были импортированы в электронную таблицу. Примените формулы «СРЕДНЕЕ» и «СТДДВ. P» в набор данных для вычисления среднего значения и стандартной ошибки соответственно из репликаций для каждой точки данных. Затем кривые были построены из значений ROS (среднее значение и стандартная ошибка). Сокращения: АФК = активные формы кислорода; FLG22 = 22-аминокислотный пептид флагеллина; ddH2O = дистиллированная вода; RLU = относительные единицы люминесценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Общее количество АФК, генерируемых оболочкой. Общее количество АФК обычно рассчитывается по кривой, полученной в результате теста. Общее количество АФК, показанное здесь, было рассчитано на основе кривой, соответствующей рисунку 3А. Чтобы получить общее количество значений ROS, примените формулу «= (y̅ n+ 
n + 1) × интервал времени/2» к соответствующим наборам данных, чтобы рассчитать ROS, сгенерированные за каждый интервал времени, которые можно объединить, применив формулу «СУММ» для расчета общей сгенерированной суммы. Сокращения: АФК = активные формы кислорода; FLG22 = 22-аминокислотный пептид флагеллина; ddH2O = вода двойной дистилляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Образование АФК в открытых ячейках кромки среза. Одну целую или две половинки листового диска помещали в лунки 96-луночной микротитровальной пластины, предварительно обрабатывали 100 мкл ddH2O в течение 10-12 ч, а затем обрабатывали flg22 для индукции АФК. Значения показаний для двух образцов с половинным диском намного выше, чем со всего листового диска (A). В среднем, общие значения из двух образцов полудиска ~ в 1,6 раза выше, чем для всего листового диска (B), что пропорционально длине края, а не площади образцов. Этот результат подтверждает, что АФК в основном генерируются в клетках в месте раны. Сокращения: АФК = активные формы кислорода; FLG22 = 22-аминокислотный пептид флагеллина; ddH2O = вода двойной дистилляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель этого исследования состояла в том, чтобы создать высокоэффективный метод количественной оценки ранней продукции АФК в ответ на ПАМП в тканях риса. Этот метод обеспечивает стандартизированную процедуру определения в режиме реального времени апопластных АФК, полученных из обработанных рисовых тканей. Этот способ прост в эксплуатации, недорог, понятен по составу и не зависит от коммерческих комплектов. Используя этот метод, исследователи могут изучать производство апопласта АФК в режиме реального времени, когда растения подвергаются биотическим или абиотическим стрессам.
В этом протоколе L-012 был выбран в качестве реагента хемилюминесценции, поскольку он является нетоксичным химическим веществом. Люминол широко используется в хемилюминесцентных анализах для обнаружения продукции АФК. Однако у люминола есть три недостатка, которые делают его непригодным для обнаружения АФК в рисе и других тканях растений: плохая растворимость в воде, короткая продолжительность реакции и резкий рН реакции. Люминол излучает свет только в щелочных условиях с оптимальным рН на уровне 9,5, что слишком агрессивно для растительных клеток и вызывает нежелательные реакции. Кроме того, люминол обладает гораздо более низкой эффективностью светового излучения, чем у L-012, который обладает самой высокой люминесцентной чувствительностью в физиологических условиях, при нейтральном или близком к нейтральному pH. Таким образом, L-012 все чаще используется в живых тканях или клеточных системах для обнаружения продукции АФК.
На выработку АФК в ответ PTI влияет множество внутренних или внешних факторов. Таким образом, вариация индукции АФК в ответе PTI велика. Чтобы максимально исключить отклонения, в этом протоколе принимаются меры по жесткому контролю условий испытаний. Во-первых, 50 мМ буферная система Tris-HCl была применена к раствору для выявления, указанному в протоколе. Хотя некоторые исследователи используют небуферизованные системы для тестирования производства АФК, мы обнаружили, что буферная система имеет лучшую производительность в отношении согласованности и воспроизводимости данных и лучший исходный уровень в контрольной группе. Во-вторых, авторы настоятельно рекомендуют брать пробы как можно более последовательно.
Несоответствие между тканями является основным источником вариаций данных. Этот протокол рекомендует выбирать ткани из одного и того же положения одного листа (количества) или оболочки здоровых растений в тех же условиях культуры. Мы всегда вырезаем листовые диски из средней трети второго листа (пронумерованы сверху) главного культиватора и поддерживаем согласованность между различными экспериментальными группами или разными генотипами. При использовании оболочки в качестве исследуемой ткани срез оболочки должен оставаться вертикальным во время процесса отбора проб. Если разрез косой, результирующая область раны не может быть последовательной, что приведет к нестабильным экспериментальным результатам. В-третьих, ткани должны быть обработаны осторожно и предварительно обработаны таким же образом. Следует избегать ран или травм на исследуемых тканях, так как раны будут подвергать больше клеток воздействию элективного раствора, что, несомненно, приведет к изменению данных. Как показано на рисунке 5, выявление АФК в основном связано с подвергшимися воздействию клетками. Кроме того, стоимость производства АФК будет резко снижена, когда новые повреждения произойдут непосредственно перед считыванием.
Еще одним важным фактором, который следует учитывать при обнаружении выработки АФК в реальном времени растительными тканями, является влияние циркадных часов. Мы заметили различия в значениях показаний в разное время суток. Было доказано, что циркадные часы могут влиять на выработку и реакцию АФК, а также на транскрипционную регуляцию генов, связанных с АФК. Уровень АФК колеблется в течение дня, достигая пика в полдень и опускаясь в полночь14. Таким образом, эта высокопроизводительная процедура позволяет одновременно обнаруживать несколько образцов, что может помочь избежать влияния циркадных часов на выработку АФК. Для достижения воспроизводимых результатов мы рекомендуем выполнять биологические реплики в одно и то же время суток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Шанхайского фонда естественных наук (номер гранта: 21ZR1429300 / BS1500016), Шанхайского университета Цзяотун (программа Agri-X, номер гранта: AF1500088/002), Шанхайского совместного инновационного центра сельскохозяйственных семян (номер гранта: ZXWH2150201/001) для Цзянбо Фана и Проекта сотрудничества в области медицины и инженерии Шанхайского университета Цзяотун (номер гранта: 21X010301734) для Кан Ли.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R.
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).
