Summary
Nesse protocolo, um modelo de osteoartrite de joelho foi elaborado pelo método de Videman modificado, e os procedimentos operatórios e precauções da acupotomia são detalhados. A eficácia da acupotomia tem sido demonstrada testando-se as propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendíneo e as propriedades mecânicas e morfológicas da cartilagem.
Abstract
A osteoartrite do joelho (OA) é uma das doenças mais frequentemente encontradas no departamento ortopédico, o que reduz seriamente a qualidade de vida das pessoas com OA de joelho. Dentre vários fatores patogênicos, o desequilíbrio biomecânico da articulação do joelho é uma das principais causas de OA. A acupotomologia acredita que restaurar o equilíbrio mecânico da articulação do joelho é a chave para o tratamento da OA de joelho. Estudos clínicos mostraram que a acupotomia pode efetivamente reduzir a dor e melhorar a mobilidade do joelho, reduzindo a adesão, a contratura dos tecidos moles e os pontos de concentração de estresse nos músculos e tendões ao redor da articulação do joelho.
Nesse protocolo, utilizamos o método de Videman modificado para estabelecer um modelo de OA por meio da imobilização do membro posterior esquerdo em posição reta. Delineamos detalhadamente o método de operação e os cuidados relacionados à acupotomia e avaliamos a eficácia da acupotomia em conjunto com a teoria da "Modulação de Músculos e Tendões no Tratamento de Distúrbios Ósseos" através da detecção das propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendão, bem como da mecânica e morfologia da cartilagem. Os resultados mostram que a acupotomia tem um efeito protetor sobre a cartilagem, ajustando as propriedades mecânicas dos tecidos moles ao redor da articulação do joelho, melhorando o ambiente de estresse da cartilagem e retardando a degeneração da cartilagem.
Introduction
A osteoartrite do joelho (OA) é a forma mais frequente de osteoartrite, frequentemente reconhecida como uma doença de toda a articulação caracterizada por degeneração da cartilagem articular, que se manifesta clinicamente como dor, edema e limitação dos movimentos das articulaçõesafetadas1. De acordo com estatísticas epidemiológicas recentes, o KOA afetou 654,1 milhões de indivíduos em todo o mundo com 40 anos de idade ou mais em 2020. A prevalência e a incidência de OA aumentam com a idade, são mais altas em adultos de meia-idade e idosos, e afetam mais mulheres do que homens2. É provável que a prevalência de OA aumente devido ao envelhecimento da população e à epidemia de obesidade em todo o mundo, representando uma ameaça crescente à saúde pública global. Idade, sexo, obesidade, trauma e outros fatores de risco complicados associados à OA afetam diretamente a instabilidade do joelho, tornando o desequilíbrio biomecânico nas articulações do joelho uma das principais causas de OA3.
Em condições fisiológicas normais, a articulação do joelho está em um estado de equilíbrio mecânico, garantindo que as cargas mecânicas na articulação sejam distribuídas uniformemente sobre a cartilagem. Qualquer desequilíbrio mecânico na articulação do joelho pode levar a um estresse anormal na cartilagem, resultando na degeneração da cartilagem e no aparecimento de OA4. O sistema músculo-tendão é o principal sistema dinâmico que mantém o equilíbrio mecânico da articulação do joelho. O movimento coordenado do sistema músculo-tendão extensor e flexor pode distribuir uniformemente a carga gerada pelo movimento na superfície da cartilagem, evitando o desequilíbrio metabólico das tensões da cartilagem local além de sua carga fisiológica que resulta em perda de cartilagem5. A diminuição da força muscular é a principal causa de distúrbio do movimento intramuscular e dano da cartilagem, que pode ocorrer antes da OA sintomática.
A OA também pode induzir inibição da musculatura artrógena (IAM), manifestando-se como fraqueza muscular e diminuição da força muscular ao redor do joelho6. Dentre esses músculos, o grupo quadríceps femoral funciona como o único extensor do joelho, uma estrutura importante na manutenção da estabilidade articular do joelho. Estudos têm demonstrado que a diminuição da área de secção transversa do quadríceps e da força muscular correlaciona-se significativa e positivamente com a progressão do OA7. O declínio da força do quadríceps afeta o padrão da marcha, a estabilidade do joelho, os padrões de movimento e muitas outras funções. Além disso, o declínio da força muscular prejudica a função tendínea, manifestando-se como diminuição da rigidez tendínea, módulo de elasticidade e outras propriedades biomecânicas8. No reparo de estiramentos a longo prazo, alterações como adesão e contratura podem ocorrer nos músculos e tendões da articulação do joelho, prejudicando suas propriedades mecânicas, causando instabilidade articular e, finalmente, formando um ciclo vicioso de alterações patológicas da OA. É, portanto, crucial para o tratamento de OA melhorar as propriedades mecânicas do sistema músculo-tendão e restaurar o equilíbrio mecânico articular.
Dentre as causas de OA de joelho, o desequilíbrio biomecânico é o principal fator indutor de dor no joelho, disfunção, lesões inflamatórias e degeneração da cartilagem9. Portanto, a chave para o tratamento de OA é restaurar o equilíbrio biomecânico da articulação do joelho. A acupotomologia acredita que a etiologia e a patogênese da OA são "desequilíbrio mecânico". Quando as características mecânicas dos tecidos moles ao redor do joelho mudam anormalmente, a articulação do joelho perde seu equilíbrio mecânico, e o ambiente de estresse mecânico anormal da articulação acelera a degeneração, causando estimulação inflamatória para agravar ainda mais as aderências de tecidos moles, contraturas e declínio adicional na estabilidade articular. Esse ciclo vicioso acaba se transformando em KOA. Ao afrouxar aderências e contraturas de tecidos moles, bem como reduzir a concentração de estresse nos músculos e tendões, a acupotomia em conjunto com a teoria da "Modulação de Músculos e Tendões para Tratamento de Distúrbios Ósseos" melhora a mecânica dos tecidos moles e "modula músculos e tendões", o que equilibra o estresse mecânico da articulação, aliviando efetivamente a degeneração da cartilagem e "tratando distúrbios ósseos"10. Em termos de seleção de modelos animais, com base no objetivo deste estudo, preparamos o modelo de OA pelo método de Videman modificado de imobilização da extensão do membro posterior esquerdo.
Este trabalho detalha o estabelecimento do modelo de OA utilizando o método Videman modificado de imobilização da extensão do membro posterior esquerdo e o método de operação e precauções da acupotomia. Demonstramos a eficácia da acupotomia testando as propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendão e detectando alterações no estresse e morfologia da cartilagem articular.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (nº. BUCM-4-2022010101-1097). Neste protocolo, 24 coelhos machos da raça Nova Zelândia, com 6 semanas de idade, foram alojados sob uma condição específica, a saber, 20-25 °C, 50-60% de umidade e um ciclo circadiano claro / 12 h escuro de 12 horas, com livre acesso a uma dieta regular de ração. Os coelhos foram anestesiados e sacrificados pela combinação de anestesia profunda e embolização aérea. A dor é uma das características patológicas típicas da OA e também é um dos principais indicadores usados para avaliar modelos animais de OA e métodos de intervenção, de modo que analgésicos não são usados durante a preparação do modelo.
1. O modelo de coelho KOA
- Anestesiar coelhos com pentobarbital sódico a 3% (30 mg/kg) por via intravenosa na margem da orelha. Para confirmar o nível adequado de anestesia, procure um reflexo corneano significativamente enfraquecido ou ausente e a ausência de dor ao pinçar a pele com pinça hemostática. Durante a anestesia, adicione 2-3 gotas de lubrificante aos olhos dos coelhos a cada 15 minutos para evitar que os olhos dos coelhos sequem.
- Após a anestesia, fixar cada coelho na posição supina, puxando o membro posterior esquerdo para uma posição totalmente estendida.
- Fixar o membro posterior esquerdo de cada coelho na posição estendida.
- Como primeira camada, use fita adesiva para cobrir a pele do coelho desde a virilha até a articulação do tornozelo.
- Como segunda camada, enrole uma fita de espuma dupla face de 36 mm de largura sobre a fita médica e, em seguida, enrole uma bandagem de polímero da virilha até a articulação do tornozelo. Certifique-se de que a articulação do joelho esteja 180° reta e a articulação do tornozelo esteja dorsiflexionada em 60°.
- Como terceira camada, imobilize as articulações com pequenas talas na frente e atrás das articulações do joelho e tornozelo, e envolva a malha de aço ao redor da camada mais externa para proteger contra mordidas. Expor os dedos dos coelhos para observar se a circulação sanguínea está normal.
- Imobilizar os animais por 6 semanas para estabelecer o modelo de KOA (Figura 1).
OBS: 1) Durante a preparação do modelo, inspecione os moldes a cada dois dias. Se algum molde estiver solto ou desprendido, anestesiar os coelhos e reimobilizar os membros posteriores esquerdos em posição estendida. 2) Coloque tapetes de proteção no fundo das gaiolas para evitar que os membros dos coelhos fiquem presos e causem ferimentos.
2. Intervenção acupotomia
OBS: Antes do início da intervenção acupotomia, anestesiar os coelhos com pentobarbital sódico a 3% (30 mg/kg) por injeção intravenosa na margem da orelha.
- Determine os pontos de tratamento.
- Raspe a pele da articulação do joelho do membro posterior esquerdo do coelho.
- Palpar a inserção do tendão do músculo femoral medial da articulação do joelho do coelho, inserção do tendão do reto femoral, inserção do tendão do bíceps femoral e bursa do pé de ganso. Marque indurações patológicas dos músculos locais com um marcador cutâneo estéril. Desinfetar a articulação do joelho três vezes com rodadas alternadas de iodóforo médico e álcool medicinal a 75%.
- Operação de acupotomia
- Manter a lâmina de acuxotomia paralela à direção do trajeto paralela ao tendão e ao eixo longitudinal do membro.
- Use o polegar da mão esquerda para pressionar a pele que entra no ponto marcador e mover-se lateralmente para que os vasos sanguíneos e nervos sejam separados no lado ventral do polegar.
- Com a alça de acupotomia na mão direita, pressione para baixo rapidamente com uma pequena força para que a lâmina de acupotomia passe instantaneamente pela pele. Avançar lentamente a lâmina de acuxotomia até as indurações musculares locais e fazer cortes longitudinais e balanços lateralmente.
- Após a operação de acupotomia estar completa, desinfete a articulação do joelho novamente e aplique um band-aid.
- Realizar esta operação uma vez por semana durante 4 semanas (Figura 2).
OBS: 1) Se não houver enduração ou tecido semelhante a um cordão tocado na inserção tendínea do vasto medial, vasto lateral, reto femoral, bíceps femoral ou bursa anserina, a agulha de acupotomia deve ser usada para liberar diretamente suas inserções tendíneas. 2) Durante a intervenção da acupotomia, não imobilizar os membros posteriores esquerdos dos coelhos do grupo acuxotomia e do grupo modelo em posição de extensão.
3. Módulo de elasticidade do quadríceps femoral
NOTA: 1) Este experimento utilizou o instrumento diagnóstico ultrassonográfico de onda de cisalhamento em tempo real (SWE) para medir o módulo de elasticidade do quadríceps femoral in vivo em cada grupo de coelhos. 2) O testador deve ser um ultrassonografista experiente em detecção por ultrassonografia. Durante a medição, a sonda de ultrassom deve ser suavemente colocada na superfície cutânea do quadríceps para evitar tensão muscular local. As medidas precisam ser feitas quando o animal está em um estado tranquilo, sem luta ou atividade. Se o animal estiver ativo, aguarde até que esteja calmo antes de realizar o teste.
- Raspar o pelo para expor a pele na região do quadríceps do membro posterior esquerdo.
- Utilizar ultrassonografia bidimensional convencional para localizar o músculo-abdome do quadríceps e determinar a região de interesse (ROI), ajustada para uma profundidade de 1-2 cm.
- Inicie o modo SWE para inspeção.
- Defina a área de interesse uniformemente para uma área circular com um diâmetro de 2 mm e a área de interesse para ~0,5-1 cm de profundidade da superfície da pele.
- Use o instrumento de diagnóstico ultra-sônico para gerar um impulso de força de radiação acústica para estimular o tecido muscular e obter elastografia tecidual.
- Aguarde 2-3 s para que a imagem se estabilize e, em seguida, congele a imagem. Ativar a função Q-BOX do instrumento para medir o módulo de Young do músculo quadríceps.
- Aguarde até que o sistema calcule automaticamente os valores máximo, mínimo e médio (unidade: KPa) do módulo de ROI de Young. Selecione três ROIs na mesma profundidade para três medições e tome o valor médio para análise estatística.
NOTA: O testador deve ser um ultrassonografista experiente em detecção de ultrassom. Durante a medição, a sonda de ultrassom deve ser suavemente colocada na superfície cutânea do quadríceps para evitar tensão muscular local. As medidas precisam ser feitas quando o animal está em um estado tranquilo, sem luta ou atividade. Se o animal estiver ativo, aguarde até que esteja calmo antes de realizar o teste.
4. Mensuração da força de contração do quadríceps femoral
OBS: Após a mensuração da força de contração do quadríceps femoral, os coelhos foram eutanasiados por embolia gasosa sob anestesia.
- Anestesiar os coelhos com pentobarbital sódico a 3% (30 mg/kg) por via intravenosa na margem da orelha. Para confirmar que o nível adequado de anestesia foi atingido, procure um reflexo corneano significativamente enfraquecido ou ausente e a ausência de dor ao pinçar a pele com pinça hemostática. Durante a anestesia, adicione 2-3 gotas de lubrificante aos olhos dos coelhos a cada 15 minutos para evitar que os olhos dos coelhos sequem.
- Expor os músculos quadríceps e fixar o transdutor de tensão.
- Corte a pele abaixo da patela, ao longo do eixo longitudinal do membro para cima até a base da coxa, e continue a cortar a pele para cima em 3-4 cm. Descasque cuidadosamente a pele e a fáscia e exponha o músculo. Cortar o ligamento patelar e separar cuidadosamente o quadríceps da junção ilíaca, mantendo o quadríceps em conexão com o ilíaco.
- Ligate as suturas cirúrgicas na junção tendínea entre a patela e o músculo quadríceps. Estique o músculo até o seu comprimento total em seu estado natural e, em seguida, fixe-o ao transdutor de tensão. Mantenha a linha de ligadura no músculo em linha reta com a linha de ligadura no transdutor de força.
- Fixe o transdutor de tensão no suporte. Conecte a linha de aquisição de sinal no transdutor de tensão ao processador do sistema de aquisição de biossinais.
- Medir o desempenho contrátil do músculo quadríceps.
- Inserir os eletrodos paralelamente ao abdome do quadríceps e evitar qualquer contato entre os eletrodos.
- Pressione o botão do osciloscópio. Ajuste a posição do transdutor de força no suporte para manter a linha de base em zero. Selecionar os parâmetros de estimulação do estimulador com largura de onda de 5 ms e atraso de 10 ms.
- Use um único estímulo primeiro e ajuste gradualmente a intensidade do estímulo de zero com um incremento de 0,1 V a cada vez. Observar as mudanças na curva de contração muscular e amplitude de contração até determinar a amplitude de contração única (Pt) máxima do quadríceps. Registre-o para estatísticas subsequentes.
- Use um estímulo cluster e use a amplitude do estímulo que induz a amplitude máxima de contração única como linha de base para estimular continuamente o músculo e aumentar gradualmente a frequência do estímulo. Observe as mudanças na curva de contração muscular até determinar a amplitude máxima de contração (Pt) do quadríceps. Registre-o para estatísticas subsequentes.
NOTA: 1) Após cada contração muscular, o músculo deve receber 30 s para relaxar com a solução tampão muscular sendo gotejada continuamente sobre o músculo. 2) Durante a operação, julgar o estado anestésico monitorando o reflexo palpebral, o ritmo respiratório, o relaxamento muscular e a resposta de pinçamento da pele dos coelhos.
5. O desempenho mecânico do tendão do quadríceps
- Pré-processamento: No dia do teste, meça o comprimento, a largura e a espessura do tendão do quadríceps com um paquímetro vernier e instale uma pinça antiderrapante especial na máquina de teste de fadiga. Repita a carga e descarga 15x para pré-processamento.
- Teste de relaxamento de tensão: Use o sensor que varia de 0 N a 100 N, estique-o a uma velocidade de 5 mm/min até atingir o comprimento necessário e, em seguida, comece a coletar dados. Defina o tempo de aquisição de dados do computador a partir de t (0), coletando dados a cada 0,1 s, com duração de 1.800 s. Após atingir o tempo definido, registre dados e curvas.
- Ensaio de tração: Utilizar o sensor que varia de 0 N a 100 N e esticá-lo a uma velocidade de 5 mm/min até a carga máxima até que o corpo de prova seja afastado. Após o ensaio, calcular o deslocamento máximo, a carga última e a rigidez do corpo de prova.
6. Pressão na superfície de contato articular e pressão por unidade de área da cartilagem
- Fixar os corpos de prova de fêmur e tíbia de ambos os lados em posição reta sobre o acessório e realizar um teste de pré-carga. Meça a faixa aproximada da articulação do joelho, corte o papel sensível à pressão no mesmo formato e sela-o com filme plástico.
- Coloque o papel sensível à pressão selado entre as articulações da tíbia e do fêmur e realize um teste de pressão na articulação do joelho com uma pressão de 5 mm/min e uma pressão máxima de 50 N. Mantenha a pressão por 2 min até atingir 50 N quando o papel sensível à pressão estiver de cor estável.
- Após 2 min, remova o papel sensível à pressão, fixe a superfície colorida em uma folha de papel tamanho A4 e adquira imagens com a escala reservada.
- Carregue a imagem no computador. Use o software referenciado para medição de área e medição multissegmento para figuras irregulares. Meça a pressão interna e externa das articulações do fêmur e da tíbia e registre os resultados.
7. Coloração Safranin O/Fast Green da cartilagem articular do joelho
- Após o término da intervenção acupotomia, retirar os tecidos do complexo ósseo cartilaginoso-subcondral e incorporá-los em parafina. Corte os blocos de cera de tecido preparados e prepare lâminas. Desparafinizar as lâminas de tecido preparadas com solução de desparafinação ambiental (I) e solução de desparafinação ambiental (II) por 15 min cada; em seguida, mergulhá-los sucessivamente em xileno e etanol anidro (1:1), etanol anidro (I), etanol 95%, etanol 85% e etanol 75%, 2-5 min cada passo; e, por fim, mergulhe-os em água destilada por 15 min.
- Realizar coloração.
- Manchar as lâminas com solução Fast Green por 1 min. Durante esse processo, retire as lâminas da solução e observe-as ao microscópio até que o tecido fique corado de verde escuro.
- Separação de cor: Enxágue o excesso de solução Fast Green com água ultrapura. Mergulhe as lâminas rapidamente em solução de ácido acético a 1% por 5 a 10 segundos. Novamente, enxágue a lâmina com água ultrapura.
- Manchar as lâminas em solução de Safranine O por 10-15 min até que a cartilagem esteja corada de vermelho.
- Desidrate e clareie o tecido, sele as lâminas de vidro e observe-as ao microscópio.
- Mergulhe as lâminas em etanol 75%, etanol 85%, etanol 95% e etanol 100% por 3 a 5 segundos sucessivamente.
- Mergulhe as lâminas em solução de desparafinação ambiental (I) e solução de desparafinação ambiental (II) por 10 min sucessivamente. Retire as lâminas e solte o meio resinoso neutro na parte frontal das lâminas, evitando o tecido. Coloque a borda do vidro de cobertura sobre a lâmina e, em seguida, coloque-a lentamente para cobrir o bálsamo neutro. Retire o ar e evite bolhas de ar. Limpe o xileno extra e o bálsamo neutro e deixe-o repousar durante a noite à temperatura ambiente.
- Observe as lâminas ao microscópio e adquira imagens. Para cada grupo, selecione seis amostras de cartilagem do joelho de coelho e selecione aleatoriamente quatro campos de visualização diferentes para cada amostra para avaliação. Pontuar a histologia da cartilagem de cada grupo de acordo com o método de Mankin (Tabela 1).
8. Análise estatística
- Dados expressos como média ± desvio padrão (
± s). - Realizar análise de variância (ANOVA) one-way e teste LSD para determinar a significância estatística das comparações entre múltiplos grupos.
- Considerar diferenças estatisticamente significantes quando P < 0,05.
± s).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultados experimentais das propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendão
Para avaliar o efeito da acupotomografia nas propriedades mecânicas do quadríceps femoral em coelhos com OA de joelhos, utilizamos imagens de ultrassom elástico por ondas de cisalhamento em tempo real e um transdutor de tensão muscular, respectivamente. Em comparação com o grupo controle, o módulo de Young do quadríceps femoral no grupo OA apresentou diminuição (P < 0,05). Em comparação com o grupo OA, o módulo de elasticidade do grupo acuxotomia estava aumentado (P < 0,05, Figura 3A). Em relação à capacidade de contração do quadríceps femoral, em comparação com o grupo controle, a amplitude de contração única e a amplitude de contração tetânica do quadríceps femoral estavam significativamente diminuídas no grupo OA (P < 0,05, P < 0,01). Em comparação com o grupo OA, a amplitude de contração única e a amplitude de contração tetânica do quadríceps femoral no grupo acupotomia estavam significativamente aumentadas (P < 0,05, P < 0,01, Figura 3B,C). Estes resultados mostram que a acupotomia pode melhorar o módulo de Young e a contratilidade muscular do quadríceps femoral em coelhos com OA.
Para avaliar o efeito da acupotomia nas propriedades mecânicas do tendão do quadríceps em coelhos com OA de joelhos, realizamos um teste de tração e um teste de relaxamento de estresse no tendão do quadríceps. Em relação às características de tração do tendão do quadríceps, em comparação com o grupo controle, a carga máxima e o deslocamento máximo do tendão do quadríceps no grupo OA foram significativamente reduzidos (P < 0,01, P < 0,01), enquanto a rigidez do tendão do quadríceps no grupo OA apresentou tendência de queda (P > 0,05). Em comparação com o grupo OA, a carga máxima e o deslocamento máximo do tendão do quadríceps no grupo acupotomia foram significativamente reduzidos (P < 0,01, P < 0,01), e a rigidez do tendão do quadríceps no grupo acupotomia mostrou tendência ascendente (P > 0,05, Figura 4A-C). Em relação à taxa de relaxamento do estresse, em comparação com o grupo controle, a taxa de relaxamento do estresse do tendão do quadríceps no grupo OA foi reduzida (P < 0,05). Em comparação com o grupo OA, a taxa de relaxamento de estresse do tendão do quadríceps no grupo acupotomia foi aumentada (P < 0,05, Figura 4D). Estes resultados mostram que a acupotomia pode melhorar as características de relaxamento de tensão e estresse do tendão do quadríceps em coelhos com OA de joelhos.
Resultados experimentais de pressão e pressão por unidade de área na superfície de contato da cartilagem e morfologia da cartilagem
Em relação à pressão máxima na superfície de contato da cartilagem, em comparação com o grupo controle, não houve diferença significativa na pressão máxima na superfície de contato da cartilagem no grupo OA (P > 0,05), mas houve tendência de queda. Em comparação com o grupo OA, não houve diferença significativa na pressão máxima na superfície de contato da cartilagem no grupo acupotomia (P > 0,05), mas houve tendência de aumento (Figura 5A). Em relação à pressão por unidade de área da superfície de contato da cartilagem, em comparação com o grupo controle, não houve diferença significativa na pressão máxima por unidade de área no grupo OA (P > 0,05), mas houve tendência de queda. Em comparação com o grupo controle, não houve diferença significativa na pressão máxima por unidade de área no grupo acupotomia (P > 0,05), mas houve tendência de aumento (Figura 5B). Estes resultados mostram que a intervenção de acupotomia teve uma tendência a aumentar a pressão máxima e a pressão por unidade de área da superfície de contato da cartilagem, indicando efeitos positivos sobre o ambiente de estresse da cartilagem.
Para avaliar o efeito da acupotomia na morfologia da cartilagem, foi utilizada a coloração Safranin O-Fast Green. No grupo controle, a superfície da cartilagem era lisa; os condrócitos em todas as camadas estavam dispostos ordenadamente e ordenadamente; os condrócitos superficiais estavam dispostos em forma de fuso; as camadas média e profunda dos condrócitos foram dispostas em arranjo colunar; a linha da maré era clara e completa; e não houve formação de pannus (Figura 6A). No grupo OA, a superfície da cartilagem era áspera ou havia defeitos de descamação; o número de condrócitos superficiais foi reduzido; a hierarquia e o arranjo dos condrócitos estavam desordenados; os condrócitos da camada média apresentavam sinais de desidratação, contração e necrose; observou-se agrupamento de condrócitos; linhas de maré borradas ou fratura distorcida; linhas de maré repetidas podiam ser vistas em algumas áreas; os vasos sanguíneos podem ter passado através da linha de maré para a cartilagem da camada não calcificada; ou houve formação de pannus (Figura 6B). No grupo acuxotomia, a camada superficial da cartilagem era relativamente lisa; a estrutura dos condrócitos era normal; o arranjo dos condrócitos em todas as camadas foi relativamente limpo; a linha de maré era clara ou, ocasionalmente, havia linhas de maré repetidas; não houve formação de pannus (Figura 6C). Em relação aos escores morfológicos da cartilagem, comparado com o grupo controle, o escore de Markin da cartilagem do grupo OA apresentou aumento significativo (P < 0,01). Em comparação com o grupo OA, o escore de Markin da cartilagem do grupo acupotomia foi significativamente reduzido (P < 0,01, Figura 6D). Estes resultados mostram que a integridade da cartilagem de coelhos com OA de joelhos foi prejudicada e que a intervenção de acupotomia pode retardar a degeneração da cartilagem e ter um efeito protetor sobre a cartilagem.
Figura 1: Método de Videman modificado para estabelecer um modelo de osteoartrite de joelho. (A) Materiais necessários para o estabelecimento do modelo KOA. (B) Use fita médica sensível à pressão para cobrir o membro posterior esquerdo dos coelhos. (C) Envolver bandagens poliméricas ao redor do membro posterior esquerdo de coelhos. (D,E) Use talas para imobilizar as articulações do joelho e tornozelo do coelho. (F) Enrolar malha de arame para evitar que os coelhos roam. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Método operatório de intervenção acupotomia. (A) Preparo da pele na articulação do joelho do membro posterior esquerdo de um coelho. (B) Selecione os pontos de inserção e use um marcador cutâneo cirúrgico para marcar as posições. (C) Use iodóforo médico para desinfetar. (D) Pressurizar e separar para evitar nervos e vasos sanguíneos. (E) Perfurar a acupotomia e operar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Propriedades mecânicas do quadríceps femoral. (A) Análise do módulo de elasticidade do quadríceps femoral; (B) análise da amplitude de contração única do quadríceps femoral; (C) análise da amplitude de contração tetânica do quadríceps femoral. Os valores são médios ± DP. N = 6 por grupo. Em comparação com o grupo controle correspondente: *P < 0,05 e **P < 0,01; em comparação com o grupo de modelos correspondente: #P < 0,05 e ##P < 0,01. Abreviação: KOA = osteoartrite do joelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Propriedades mecânicas do tendão do quadríceps. (A) Análise da carga máxima do tendão do quadríceps; (B) análise do deslocamento máximo do tendão do quadríceps; (C) análise da rigidez do tendão do quadríceps; (D) relaxamento acentuado do tendão do quadríceps. Os valores são médios ± DP. N = 6 por grupo. Em comparação com o grupo controle correspondente: *P < 0,05 e **P < 0,01; em comparação com o grupo de modelos correspondente: #P < 0,05 e ##P < 0,01. Abreviação: KOA = osteoartrite do joelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Pressão na superfície de contato da cartilagem. (A) Análise da pressão máxima na superfície de contato da cartilagem; (B) análise da pressão por unidade de área da superfície de contato da cartilagem. Os valores são médios ± DP. N = 6 por grupo. Abreviação: KOA = osteoartrite do joelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Coloração da cartilagem com Safranin O-Fast verde e markin score da cartilagem. (A) grupo controle, (B) grupo modelo, (C) grupo acufotomia, (D) análise do escore de markin da cartilagem. Os valores são médios ± DP. N = 6 por grupo. Em comparação com o grupo controle correspondente: **P < 0,01; em comparação com o grupo de modelos correspondente: ##P < 0,01. Barras de escala = 50 μm (A-C). Abreviação: KOA = osteoartrite do joelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Não. Estrutura | III. Coloração | ||
| um. Normal | 0 | um. Normal | 0 |
| b. Irregularidades superficiais | 1 | b. Ligeira redução | 1 |
| c. Pannus e irregularidades de superfície | 2 | c. Redução moderada | 2 |
| d. Fissuras para zona de transição | 3 | d. Redução severa | 3 |
| e. Fissuras para zona radial | 4 | e. Nenhum corante anotado | 4 |
| f. Fissuras para zona calcificada | 5 | ||
| g. Desorganização completa | 6 | ||
| II. Células | IV. Integridade da maré | ||
| um. Normal | 0 | um. Intacto | 0 |
| b. Hipercelularidade difusa | 1 | b. Atravessado por vasos sanguíneos | 1 |
| c.Clonagem | 2 | ||
| d. Hipocelularidade | 3 | ||
Tabela 1: Escore de Mankin modificado.
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Discussion
Um modelo animal adequado é um dos fatores-chave para atingir os objetivos experimentais e esclarecer uma questão científica específica. Este estudo foi baseado nas teorias de "Zongjin controlando ossos e articulações lubrificantes" e "desequilíbrio mecânico" em acupotomologia, com o objetivo de explicar a conotação científica por trás do tratamento de OA por meio da "modulação de músculos e tendões para tratar distúrbios ósseos" na terapia de acupotomia. Em outras palavras, a acupotomia melhora o ambiente mecânico anormal da cartilagem regulando as características mecânicas dos tecidos moles ao redor do joelho para retardar a degeneração e proteger a cartilagem. Os modelos animais de OA são geralmente classificados em duas categorias: modelos espontâneos e induzidos. Modelos de OA espontâneo são menos utilizados devido à duração relativamente longa da modelagem e maiores limitações. Os modelos de OA induzida podem ser estabelecidos por abordagens cirúrgicas (por exemplo, método de Hulth modificado, meniscectomia, ruptura do ligamento cruzado anterior, injeção intra-articular e imobilização articular). Métodos cirúrgicos, incluindo o corte do ligamento colateral medial, ligamento cruzado anterior, remoção do menisco medial e outras estruturas, são utilizados para desestabilizar a articulação do joelho, o que levará ao desequilíbrio mecânico interno e ao atrito direto entre as superfícies articulares, induzindo a OQ11. Este tipo de modelo é mais adequado para o estudo da artrite traumática. A injeção intra-articular libera medicamentos na cavidade articular do joelho para induzir inflamação, distúrbios metabólicos dos condrócitos e reações tóxicas dos condrócitos na cavidade articular, desenvolvendo OA e tendo pouco efeito sobre o estresse articular12. A imobilização articular desenvolve e exacerba a degeneração da cartilagem articular, limitando o movimento da articulação do joelho, causando atrofia dos músculos e ligamentos ao redor do joelho, resultando em alterações no estresse articular, estabelecendo, assim, um modelo de OA12.
O método de Videman modificado é um método de imobilização articular, que está mais de acordo com o processo patológico de OA causado pela fraqueza dos músculos do joelho humano, como visto na atrofia por desuso dos músculos e ligamentos do joelho pela imobilização do joelho em uma posição sobreestendida, resultando em mudanças no estresse articular e degeneração da cartilagem. Comparado aos métodos cirúrgicos que causam instabilidade articular resultando em OA, o método de Videman modificado está mais de acordo com a patogênese natural da OA em que a lesão tendínea é a primeira fase, seguida pela doença tendínea e óssea; é, portanto, mais adequado para este estudo13. Como o efeito da acupotomia no tratamento da OA em estágio inicial ou médio é mais evidente, o tempo de moldagem é de 6 semanas, o que é consistente com as alterações patológicas da OA em estágio médio. No processo de indução do modelo, a frenagem por sobreextensão prolongada pode levar à atrofia por desuso dos músculos ao redor da articulação do joelho, e o desconforto no membro posterior esquerdo muitas vezes faz com que os coelhos roam os aparelhos do modelo. Como os aparelhos modelo podem estar soltos, é necessário verificar regularmente a estanqueidade do dispositivo tipo coelho e reforçá-los a tempo. Além disso, é necessário sempre prestar atenção ao suprimento sanguíneo do membro do coelho, inchaço, lesões de pele e sintomas do trato digestivo, e remover os aparelhos do modelo, se necessário. Uma vez que os coelhos estão em estado de anestesia durante este processo, é necessário mantê-los aquecidos e prestar atenção ao estado dos coelhos em tempo real até que os coelhos acordem.
A acupotomia envolve uma função de bisturi além da agulha de acupuntura existente, utilizando o conceito de acupuntura para penetrar no corpo, com efeitos cortantes e separadores superiores a uma agulha de acupuntura, trazendo muito menos trauma ao corpo humano do que um bisturi14. A acupotomologia acredita que a causa raiz da OA é o desequilíbrio mecânico devido ao dano dos tecidos moles ao redor da articulação do joelho. Portanto, a chave para o tratamento de OA com acupotomia é restaurar o equilíbrio mecânico da articulação do joelho. Em relação à seleção dos pontos de tratamento, por um lado, a acupotomia baseia-se na teoria dos meridianos e sinews e toma como acuponto a localização dolorosa. Por outro lado, a acupotomia é guiada pela anatomia e biomecânica modernas e acredita que o dano dos tecidos moles ao redor da articulação do joelho causa adesão e contração, o que destrói o equilíbrio mecânico da articulação do joelho e produz pontos de alto estresse na articulação. Portanto, a adesão, a contração tecidual e os pontos de alto estresse são frequentemente tomados como pontos de tratamento15,16.
A análise biomecânica dos tecidos moles mostra que os pontos de fixação de tendões e ossos são, em sua maioria, onde se concentram os estresses dos tecidos moles, também chamados de concentração de estresse, e onde produtos patológicos como aderências, contraturas e nódulos semelhantes a cordões são facilmente produzidos17. Além disso, a prática clínica tem comprovado que os tender points encontrados pela palpação muitas vezes se sobrepõem aos pontos de fixação de tendões e ossos. Portanto, este estudo optou pela inserção tendínea do vasto medial, vasto lateral, reto femoral, bíceps femoral e bursa anserina. Embora a acupotomia cause menos trauma aos tecidos, ainda é um método de intervenção invasiva. Durante a intervenção, é necessário seguir rigorosamente o procedimento de quatro etapas da acupotomia: localização, direção, pressão-liberação e punção. Além disso, os usuários devem estar atentos com o grau de relaxamento e frequência de tratamento de cada intervenção. É aconselhável liberar cada ponto de tratamento 2-3 vezes uma vez por semana para evitar danos excessivos aos tecidos. Após o término da intervenção de acupotomia, a articulação do joelho do membro posterior esquerdo do coelho é desinfetada novamente e band-aids são aplicados no ponto de entrada da acupotomia.
Articulações estáveis do joelho são pré-requisitos para a manutenção do equilíbrio mecânico e realização de movimentos fisiológicos normais18. Músculos e tendões - fatores importantes na manutenção da estabilidade articular do joelho - são estruturas do tecido viscoelástico que determinam as diferentes propriedades mecânicas dos músculos em contração e tração passiva, que são componentes importantes das propriedades mecânicas dos músculos e garantem a função motora normal dos músculos. O módulo de elasticidade, indicador das propriedades mecânicas dos tecidos moles, correlaciona-se positivamente com alterações na função mecânica do quadrícepsfemoral19. Fisiologicamente, a contração do músculo esquelético inclui duas formas: contração única e contração tetânica. A primeira é a unidade básica de atividade muscular, enquanto a segunda produz principalmente movimentos suaves dos músculos esqueléticos. Portanto, a amplitude máxima de contração única e tetânica é comumente utilizada para avaliar a função contrátil muscular.
A atrofia muscular esquelética por desuso leva à redução da contração tetânica e da contração voluntária máxima, indicando diminuição da capacidade contrátil muscular20. O declínio da força muscular pode prejudicar a função dos tendões, manifestando-se como uma diminuição da viscoelasticidade tendínea e uma diminuição da capacidade dos tendões de resistir à deformação8. Sob condições patológicas, o relaxamento do estresse e as propriedades de tração dos tendões podem diminuir, fazendo com que a articulação do joelho perca o equilíbrio e acelerando o desenvolvimento de OA. Portanto, neste estudo, foram selecionados o módulo de elasticidade, amplitude de contração única, amplitude de contração tetânica do quadríceps, características tênsis do tendão do quadríceps como carga máxima, deslocamento máximo, rigidez, bem como o relaxamento sob tensão do tendão do quadríceps para avaliar o efeito da acupotomia nas propriedades mecânicas do quadríceps. O teste de estresse e pressão da área de sustentação da cartilagem e a coloração Safranin O/Fast Green da cartilagem articular do joelho foram utilizados para avaliar se a acupotomia melhorava as propriedades mecânicas do quadríceps femoral e exercia efeito protetor sobre a cartilagem. Os resultados experimentais mostram que a acupotomia combinada com a teoria de "modular músculos e tendões para tratar distúrbios ósseos" pode melhorar o ambiente de estresse da cartilagem, retardar a degeneração da cartilagem e ter um efeito protetor sobre a cartilagem por modular as propriedades mecânicas dos músculos e tendões do quadríceps.
Há certas limitações neste experimento. Por um lado, não avaliamos o desalinhamento do joelho e seu efeito nos desequilíbrios biomecânicos do joelho. Por outro lado, este estudo escolheu o método de Videman modificado de imobilização da extensão do membro posterior esquerdo para modelagem da OA para elucidar o papel da acupotomia no retardo da degeneração da cartilagem por meio da modulação das propriedades mecânicas dos tecidos moles ao redor do joelho. Entretanto, o papel da acupotomia na osteoartrite do joelho causada por fatores traumáticos, como rupturas ligamentares e meniscais, ainda não foi investigado. Além disso, a intervenção de acupotomia é um tipo de cirurgia fechada e minimamente invasiva. Neste estudo, tanto a palpação quanto a acupotomia foram realizadas sem exposição do tecido doente em condições de visão não direta. Para reduzir o impacto de fatores subjetivos nos resultados experimentais, tanto a palpação quanto a acupotomia foram realizadas pelo mesmo pessoal. Assim, embora existam algumas limitações, elas não afetam a confiabilidade das conclusões deste estudo.
Em resumo, este trabalho descreve em detalhes a indução do modelo de KOA com o método de Videman modificado (imobilização da extensão do membro posterior esquerdo) e a intervenção na acupotomia. Mostra também a análise do mecanismo de tratamento da acupotomia para OA através de experimentos sobre o módulo elástico e função contrátil do quadríceps, as características mecânicas do tendão do quadríceps, a força e pressão da área de sustentação da cartilagem articular e a coloração Safranin O/Fast Green da cartilagem articular do joelho. O estudo do mecanismo da acupotomia para melhorar as propriedades biomecânicas dos tecidos moles pode fornecer uma nova visão sobre o tratamento da OA e de outras lesões sistêmicas relacionadas ao esporte.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.82074523,82104996).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acupotomy | Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd. | 0.4 x 40 mm | |
| Connect Cast Orthopedic Casting Tape | Suzhou Connect Medical Technology Co.,Ltd. | KCP06 | 15.0 cm x 360 cm |
| Double-sided Foam Tape | Deli Group Co.,Ltd. | NO.30416 | 36 mm x 5 yard x 2.5 mm |
| Environmental Dewaxing Solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1128 | |
| Ethanol absolute | Beijing Hengkangda Medicine Co., Ltd. | ||
| Fast Green solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1031 | |
| Fast grenn FCF | Sigma,America | 2353-45-9 | |
| Fatigue testing machine | BOSE, America | Bose Electro Force 3300 | |
| Four-channel physiological recorder | Chengdu Instrumeny Frctory | RM-6420 | |
| FPD-305E | Fuji, Japan | ||
| FPD-306E | Fuji, Japan | ||
| Hematoxylin solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1005 | |
| Medical iodophor disinfectant | Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Medical Tape | Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd. | 200402 | 1.5 x 500 cm |
| Muscle tension transducer | Chengdu Instrumeny Frctory | JH-2204005, 50 g | |
| Prescale | Fuji, Japan | ||
| Real-time SWE ultrasound diagnostic instrument | SuperSonic Imagine SA,France | SuperSonic Imagine AixPlorer | |
| Rhamsan gum | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | WG10004160 | |
| Safranine O | Sigma,America | 477-73-6 | |
| Safranine O solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1015 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) | IBM, America |
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