Summary
I detta protokoll utarbetades en modell för knäartros med hjälp av den modifierade Videman-metoden, och operationsprocedurerna och försiktighetsåtgärderna för akupotomi är detaljerade. Akupotomins effektivitet har påvisats genom att testa de mekaniska egenskaperna hos quadriceps femoris och senor samt de mekaniska och morfologiska egenskaperna hos brosk.
Abstract
Knäartros (KOA) är en av de vanligaste sjukdomarna på den ortopediska avdelningen, vilket allvarligt minskar livskvaliteten för personer med KOA. Bland flera patogena faktorer är den biomekaniska obalansen i knäleden en av huvudorsakerna till KOA. Akupotomologi anser att återställande av den mekaniska balansen i knäleden är nyckeln till behandling av KOA. Kliniska studier har visat att akupotomi effektivt kan minska smärta och förbättra knärörligheten genom att minska vidhäftning, kontraktur av mjukvävnader och stresskoncentrationspunkter i muskler och senor runt knäleden.
I detta protokoll använde vi den modifierade Videman-metoden för att etablera en KOA-modell genom att immobilisera vänster bakben i en rak position. Vi har beskrivit operationsmetoden och försiktighetsåtgärderna relaterade till akupotomi i detalj och utvärderat effekten av akupotomi i samband med teorin om "Modulering av muskler och senor för att behandla bensjukdomar" genom detektering av de mekaniska egenskaperna hos quadriceps femoris och senor, samt broskmekanik och morfologi. Resultaten visar att akupotomi har en skyddande effekt på brosket genom att justera de mekaniska egenskaperna hos de mjuka vävnaderna runt knäleden, förbättra broskstressmiljön och fördröja broskdegeneration.
Introduction
Knäartros (KOA) är den vanligaste formen av artros, ofta erkänd som en helledssjukdom som kännetecknas av ledbroskdegeneration, som manifesterar sig kliniskt som smärta, svullnad och begränsad rörelse i de drabbade lederna1. Enligt den senaste epidemiologiska statistiken rapporteras KOA ha drabbat 654,1 miljoner individer globalt som var 40 år eller äldre år 2020. Prevalensen och incidensen av KOA ökar med åldern, är högst hos medelålders och äldre vuxna och drabbar fler kvinnor än män. Prevalensen av KOA kommer sannolikt att öka på grund av den åldrande befolkningen och fetmaepidemin över hela världen, vilket utgör ett växande hot mot den globala folkhälsan. Ålder, kön, fetma, trauma och andra komplicerade riskfaktorer i samband med KOA påverkar alla direkt knäinstabilitet, vilket gör en biomekanisk obalans i knälederna till en av de främsta orsakerna till KOA3.
Under normala fysiologiska förhållanden är knäleden i ett tillstånd av mekanisk balans, vilket säkerställer att de mekaniska belastningarna i leden fördelas jämnt på brosket. Varje mekanisk obalans i knäleden kan leda till onormal belastning i brosket, vilket resulterar i broskdegeneration och uppkomsten av KOA4. Muskelsensystemet är det huvudsakliga dynamiska systemet som upprätthåller den mekaniska balansen i knäleden. Den samordnade rörelsen av extensorn och flexormuskel-sensystemet kan jämnt fördela belastningen som genereras av rörelsen på broskytan, vilket undviker den metaboliska obalansen av lokala broskspänningar utöver dess fysiologiska belastning som resulterar i broskförlust5. Minskad muskelstyrka är den främsta orsaken till intramuskulär rörelsestörning och broskskador, som kan uppstå före symtomatisk KOA.
KOA kan också inducera artrogen muskelhämning (AMI), vilket visar sig som muskelsvaghet och minskad muskelstyrka runt knäet6. Bland dessa muskler fungerar quadriceps femoris-gruppen som den enda knästräckaren, en viktig struktur för att upprätthålla knäledens stabilitet. Studier har visat att en minskning av quadriceps tvärsnittsarea och muskelstyrka är signifikant och positivt korrelerad med KOA-progression7. Minskningen av quadricepsstyrkan påverkar gångmönstret, knästabiliteten, rörelsemönstren och många andra funktioner. Dessutom försämrar minskningen av muskelstyrkan senfunktionen, vilket manifesteras som en minskning av senstyvhet, elasticitetsmodul och andra biomekaniska egenskaper8. Vid långvarig töjningsreparation kan förändringar som vidhäftning och kontraktur uppstå i knäledens muskler och senor, vilket skadar deras mekaniska egenskaper, orsakar ledinstabilitet och i slutändan bildar en ond cirkel av patologiska förändringar av KOA. Det är därför avgörande för KOA-behandling att förbättra de mekaniska egenskaperna hos muskel-sensystemet och återställa ledens mekaniska balans.
Bland orsakerna till KOA är biomekanisk obalans den främsta inducerande faktorn för knäsmärta, dysfunktion, inflammatoriska lesioner och broskdegeneration9. Därför är nyckeln till att behandla KOA att återställa den biomekaniska balansen i knäleden. Akupotomologi anser att etiologin och patogenesen av KOA är "mekanisk obalans". När de mekaniska egenskaperna hos de mjuka vävnaderna runt knäet förändras onormalt, förlorar knäleden sin mekaniska balans och den onormala mekaniska stressmiljön i leden påskyndar degenerationen, vilket orsakar inflammatorisk stimulering för att ytterligare förvärra mjukvävnadens sammanväxningar, kontrakturer och ytterligare försämring av ledstabiliteten. Denna onda cirkel utvecklas så småningom till KOA. Genom att lossa sammanväxningar och kontrakturer i mjukvävnad, samt minska stresskoncentrationen i muskler och senor, förbättrar akupotomi i kombination med teorin om "modulering av muskler och senor för att behandla bensjukdomar" mjukdelsmekaniken och "modulerar muskler och senor", vilket balanserar den mekaniska belastningen i leden, effektivt lindrar broskdegeneration och "behandlar bensjukdomar"10. När det gäller val av djurmodell, baserat på syftet med denna studie, förberedde vi KOA-modellen med den modifierade Videman-metoden för immobilisering av vänster bakbensförlängning.
Denna uppsats beskriver etableringen av KOA-modellen med hjälp av den modifierade Videman-metoden för immobilisering av vänster bakbensförlängning och operationsmetoden och försiktighetsåtgärder för akupotomi. Vi demonstrerar effektiviteten av akupotomi genom att testa de mekaniska egenskaperna hos quadriceps femoris och sena och detektera förändringar i ledbroskstress och morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök granskades och godkändes av den djuretiska kommittén vid Beijing University of Chinese Medicine (nr. BUCM-4-2022010101-1097). I detta protokoll hölls 24 6 veckor gamla hankaniner från Nya Zeeland under ett specifikt tillstånd, nämligen 20-25 °C, 50-60 % luftfuktighet och en 12 timmar ljus/12 timmars mörk dygnsrytm, med fri tillgång till en regelbunden chow-diet. Kaninerna sövdes och avlivades genom att kombinera djupbedövning och luftembolisering. Smärta är ett av de typiska patologiska kännetecknen för KOA och är också en av de viktigaste indikatorerna som används för att utvärdera djurmodeller av KOA och interventionsmetoder, så smärtstillande medel används inte under modellberedningen.
1. KOA-kaninmodellen
- Bedöva kaniner med 3 % pentobarbitalnatrium (30 mg/kg) intravenöst vid öronkanten. För att bekräfta lämplig nivå av anestesi, leta efter en signifikant försvagad eller frånvarande hornhinnereflex och frånvaron av smärta vid klämning av huden med hemostatisk pincett. Under narkosen, tillsätt 2-3 droppar glidmedel i kaninernas ögon var 15:e minut för att förhindra att kaninernas ögon torkar ut.
- Efter bedövning fixerar du varje kanin i ryggläge och drar vänster bakben till ett helt utsträckt läge.
- Fäst den vänstra bakbenet på varje kanin i utsträckt läge.
- Som det första lagret, använd medicinsk tejp för att täcka kaninens hud från ljumsken till fotleden.
- Som det andra lagret, linda 36 mm bred, dubbelhäftande skumtejp över den medicinska tejpen och linda sedan ett polymerbandage från ljumsken till fotleden. Se till att knäleden är 180° rak och att fotleden är dorsalflexad 60°.
- Som det tredje lagret, immobilisera lederna med små skenor på fram- och baksidan av knä- och fotlederna och linda stålnät runt det yttersta lagret för att skydda mot bett. Exponera kaninernas tår för att se om blodcirkulationen är normal.
- Immobilisera djuren i 6 veckor för att etablera KOA-modellen (Figur 1).
OBS: 1) Inspektera formarna varannan dag under modellberedningen. Om några formar är lösa eller lossnade, bedöva kaninerna och immobilisera vänster bakben i utsträckt läge. 2) Lägg skyddsmattor på botten av burarna för att förhindra att kaninernas lemmar fastnar och orsakar skada.
2. Akupotomi intervention
OBS: Innan akupotomiinterventionen påbörjas, bedöva kaninerna med 3 % pentobarbitalnatrium (30 mg/kg) genom intravenös injektion med öronmarginal.
- Bestäm behandlingspunkterna.
- Raka av pälsen på knäleden på kaninens vänstra bakben.
- Palpera kaninknäledens mediala lårbensmuskelsenainsättning, rectus lårbensseninsättning, biceps femoris-seninsättning och gåfotsbursa. Markera patologiska indurationer i lokala muskler med en steril hudmarkör. Desinficera knäleden tre gånger med omväxlande omgångar av medicinsk jodofor och 75 % medicinsk alkohol.
- Operationen av akupotomi
- Håll akupotomibladet parallellt med färdriktningen parallellt med senan och extremitetens längsgående axel.
- Använd tummen på vänster hand för att trycka ner huden som kommer in i markörpunkten och flytta i sidled så att blodkärl och nerver separeras på tummens ventrala sida.
- Med akupotomihandtaget i höger hand, tryck ner snabbt med en liten kraft så att akupotomibladet omedelbart passerar genom huden. För långsamt fram akupotomibladet till de lokala muskelindurationerna och gör längsgående snitt och svängningar i sidled.
- När akupotomioperationen är klar, desinficera knäleden igen och sätt på ett plåster.
- Utför denna operation en gång i veckan i 4 veckor (Figur 2).
OBS: 1) Om det inte finns någon induration eller navelsträngsliknande vävnad som vidrörs vid seninsättningen av vastus medialis, vastus lateralis, rectus femoris, biceps femoris eller anserine bursa, ska akupotominålen användas för att frigöra deras seninsättningar direkt. 2) Under akupotomiintervention, immobilisera inte vänster bakben på kaniner i akupotomigruppen och modellgruppen i förlängningsläge.
3. Elastisk modul av quadriceps femoris
OBS: 1) Detta experiment använde ultraljudsdiagnosinstrumentet för skjuvvågselastografi (SWE) i realtid för att mäta elasticitetsmodulen för quadriceps femoris in vivo i varje grupp av kaniner. 2) Testaren bör vara en erfaren sonograf inom ultraljudsdetektion. Vid mätning ska ultraljudssonden försiktigt placeras på hudytan av quadriceps för att undvika lokala muskelspänningar. Mätningar måste göras när djuret är i ett lugnt tillstånd, utan kamp eller aktivitet. Om djuret är aktivt, vänta tills det är lugnt innan du utför testet.
- Raka pälsen för att exponera huden i quadriceps-regionen på vänster bakben.
- Använd konventionellt tvådimensionellt ultraljud för att lokalisera quadriceps muskulo-buk och bestämma intresseområdet (ROI), inställt på ett djup av 1-2 cm.
- Starta SWE-läget för inspektion.
- Ställ in intresseområdet jämnt till ett cirkulärt område med en diameter på 2 mm och intresseområdet till ~0,5-1 cm djupt från hudens yta.
- Använd det ultraljudsdiagnostiska instrumentet för att generera en akustisk strålningskraftimpuls för att stimulera muskelvävnaden och få vävnadselastografi.
- Vänta i 2-3 s tills bilden stabiliseras och frys sedan bilden. Aktivera instrumentets Q-BOX-funktion för att mäta Youngs modul i quadricepsmuskeln.
- Vänta tills systemet automatiskt beräknar maximala, lägsta och genomsnittliga värden (enhet: KPa) för Youngs ROI-modul. Välj tre ROI:er på samma djup för tre mätningar och ta medelvärdet för statistisk analys.
OBS: Testaren bör vara en erfaren sonograf inom ultraljudsdetektion. Vid mätning ska ultraljudssonden försiktigt placeras på hudytan av quadriceps för att undvika lokala muskelspänningar. Mätningar måste göras när djuret är i ett lugnt tillstånd, utan kamp eller aktivitet. Om djuret är aktivt, vänta tills det är lugnt innan du utför testet.
4. Mätning av sammandragningskraften för quadriceps femoris
OBS: Efter mätning av sammandragningskraften hos quadriceps femoris avlivades kaninerna genom luftemboli under narkos.
- Bedöva kaninerna med 3 % pentobarbitalnatrium (30 mg/kg) intravenöst vid öronkanten. För att bekräfta att lämplig nivå av anestesi har uppnåtts, leta efter en signifikant försvagad eller frånvarande hornhinnereflex och frånvaron av smärta vid klämning av huden med hemostatisk pincett. Under narkosen, tillsätt 2-3 droppar glidmedel i kaninernas ögon var 15:e minut för att förhindra att kaninernas ögon torkar ut.
- Exponera quadricepsmusklerna och fäst spänningsgivaren.
- Skär huden under knäskålen, längs extremitetens längsgående axel uppåt till lårbasen, och fortsätt att skära huden uppåt med 3-4 cm. Skala försiktigt av huden och fascian och exponera muskeln. Klipp av patellaligamentet och separera försiktigt quadriceps från höftbensförbindelsen, håll quadriceps i anslutning till iliacium.
- Ligate de kirurgiska suturerna vid senförbindelsen mellan knäskålen och quadricepsmuskeln. Sträck ut muskeln till sin fulla längd i sitt naturliga tillstånd och fäst den sedan på spänningsgivaren. Håll ligeringslinjen på muskeln i en rak linje med ligeringslinjen på kraftgivaren.
- Fäst spänningsgivaren på fästet. Anslut signalinsamlingsledningen på spänningsgivaren till biosignalinsamlingssystemets processor.
- Mät quadricepsmuskelns kontraktila prestanda.
- Sätt in elektroderna parallellt med quadricepsbuken och undvik kontakt mellan elektroderna.
- Tryck på oscilloskopknappen. Justera kraftgivarens position på fästet för att hålla baslinjen på noll. Välj stimuleringsparametrar för stimulatorn med en vågbredd på 5 ms och en fördröjning på 10 ms.
- Använd en enda stimulus först och justera gradvis stimulusintensiteten från noll med en ökning på 0.1 V varje gång. Observera förändringarna i muskelkontraktionskurvan och kontraktionsamplituden tills den maximala enskilda kontraktionsamplituden (Pt) för quadriceps har bestämts. Anteckna det för efterföljande statistik.
- Använd en klusterstimulus och använd stimulusamplituden som inducerar den maximala enskilda kontraktionsamplituden som baslinje för att kontinuerligt stimulera muskeln och gradvis öka stimulusfrekvensen. Observera förändringarna i muskelkontraktionskurvan tills den maximala kontraktionsamplituden (Pt) för quadriceps har bestämts. Anteckna det för efterföljande statistik.
OBS: 1) Efter varje muskelsammandragning bör muskeln ges 30 s för att slappna av med muskelbuffertlösningen som droppas kontinuerligt på muskeln. 2) Under operationen, bedöm anestesistatusen genom att övervaka kaninernas ögonlocksreflex, andningsrytm, muskelavslappning och hudklämningsrespons.
5. Den mekaniska prestandan hos quadricepssenan
- Förbehandling: På testdagen, mät längden, bredden och tjockleken på quadricepssenan med ett skjutmått och installera en speciell halkskyddsklämma i utmattningstestmaskinen. Upprepa lastning och lossning 15 gånger för förbehandling.
- Stressrelaxationstest: Använd sensorn från 0 N till 100 N, sträck den med en hastighet av 5 mm/min tills den når önskad längd och börja sedan samla in data. Ställ in datorns datainsamlingstid från t (0) och samla in data var 0,1:e sekund och varar i 1 800 sekunder. Efter att ha nått den inställda tiden, registrera data och kurvor.
- Dragprov: Använd sensorn från 0 N till 100 N och sträck den med en hastighet av 5 mm/min till maximal belastning tills provet dras isär. Efter testet, beräkna provets maximala förskjutning, slutliga belastning och styvhet.
6. Ledkontaktytans tryck och tryck per ytenhet av brosket
- Fixera lårbens- och skenbensproverna på båda sidor i rakt läge på fixturen och utför ett förspänningstest. Mät knäledens ungefärliga räckvidd, skär det tryckkänsliga papperet i samma form och försegla det med plastfolie.
- Placera det förseglade tryckkänsliga papperet mellan skenbenet och lårbenet och utför ett trycktest på knäleden med ett tryck på 5 mm/min och ett maximalt tryck på 50 N. Håll trycket i 2 minuter tills det når 50 N när det tryckkänsliga papperet är stabilt färgat.
- Efter 2 minuter tar du bort det tryckkänsliga papperet, fixerar den färgade ytan på ett A4-papper och tar bilder med skalan avsatt.
- Ladda upp bilden till datorn. Använd den refererade programvaran för areamätning och flersegmentsmätning för oregelbundna siffror. Mät trycket på insidan och utsidan av lederna i lårbenet och skenbenet och registrera resultaten.
7. Safranin O/Fast Green färgning av knäledsbrosket
- Efter avslutad akupotomiintervention, ta brosk-subkondrala benkomplexvävnader och bädda in dem i paraffin. Skär de förberedda vävnadsvaxblocken och förbered objektglasen. Avparaffinisera de preparerade vävnadsglasen med miljöavvaxningslösning (I) och miljöavvaxningslösning (II) i 15 minuter vardera; doppa dem sedan successivt i xylen och vattenfri etanol (1:1), vattenfri etanol (I), 95 % etanol, 85 % etanol och 75 % etanol, 2-5 min varje steg; Blötlägg dem slutligen i destillerat vatten i 15 minuter.
- Utför färgning.
- Färga objektglasen med Fast Green-lösning i 1 min. Under denna process, ta ut objektglasen ur lösningen och observera dem under mikroskopet tills vävnaden färgas mörkgrön.
- Färgseparation: Skölj överskottet av Fast Green-lösningen med ultrarent vatten. Blötlägg objektglasen snabbt i 1% ättiksyralösning i 5 - 10 sekunder. Skölj rutschkanan igen med ultrarent vatten.
- Färga objektglasen i Safranin O-lösning i 10-15 minuter tills brosket färgats rött.
- Torka ut och rensa vävnaden, försegla glasglasen och observera dem under mikroskopet.
- Blötlägg objektglasen i 75 % etanol, 85 % etanol, 95 % etanol och 100 % etanol i 3 - 5 sekunder i följd.
- Doppa objektglasen i miljöavvaxningslösning (I) och miljöavvaxningslösning (II) i 10 minuter i följd. Ta ut objektglasen och släpp det neutrala hartsartade mediet på framsidan av objektglasen, undvik vävnaden. Placera kanten på täckglaset på objektglaset och lägg sedan långsamt ner det för att täcka den neutrala balsamen. Ta bort luften och undvik luftbubblor. Torka bort överflödig xylen och neutral balsam och låt den stå över natten i rumstemperatur.
- Observera objektglasen under mikroskopet och ta bilder. För varje grupp, välj sex prover av kaninknäbrosk och välj slumpmässigt fyra olika visningsfält för varje prov för utvärdering. Poängsätt broskhistologin för varje grupp enligt Mankin-metoden (tabell 1).
8. Statistisk analys
- Uttryck data som medelvärde ± standardavvikelse (
± s). - Utföra envägsanalys av varians (ANOVA) och LSD:s test för att bestämma den statistiska signifikansen av multipla gruppjämförelser.
- Betrakta skillnader som statistiskt signifikanta när P < 0,05.
± s).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimentella resultat av mekaniska egenskaper hos quadriceps femoris och sena
För att utvärdera effekten av akupotomologi på de mekaniska egenskaperna hos quadriceps femoris hos kaniner med KOA använde vi skjuvvågselastisk ultraljudsavbildning i realtid respektive en muskelspänningsgivare. Jämfört med kontrollgruppen minskade Youngs modul av quadriceps femoris i KOA-gruppen (P < 0,05). Jämfört med KOA-gruppen ökade Youngs modul i akupotomigruppen (P < 0,05, Figur 3A). När det gäller kontraktionsförmågan hos quadriceps femoris, jämfört med kontrollgruppen, minskade enkelkontraktionsamplituden och tetanisk kontraktionsamplituden hos quadriceps femoris signifikant i KOA-gruppen (P < 0,05, P < 0,01). Jämfört med KOA-gruppen ökade amplituden för enkel kontraktion och tetanisk kontraktionsamplitud för quadriceps femoris i akupotomigruppen signifikant (P < 0,05, P < 0,01, Figur 3B,C). Dessa resultat visar att akupotomi kan förbättra Youngs modul och muskelkontraktilitet hos quadriceps femoris hos kaniner med KOA.
För att utvärdera effekten av akupotomi på de mekaniska egenskaperna hos quadricepssenan hos kaniner med KOA genomförde vi ett dragtest och ett stressrelaxationstest på quadricepssenan. När det gäller quadricepssenans dragegenskaper, jämfört med kontrollgruppen, minskade den slutliga belastningen och den maximala förskjutningen av quadricepssenan i KOA-gruppen signifikant (P < 0,01, P < 0,01), medan styvheten hos quadricepssenan i KOA-gruppen visade en nedåtgående trend (P > 0,05). Jämfört med KOA-gruppen minskade den slutliga belastningen och den maximala förskjutningen av quadricepssenan i akupotomigruppen signifikant (P < 0,01, P < 0,01), och styvheten i quadricepssenan i akupotomigruppen visade en uppåtgående trend (P > 0,05, Figur 4A-C). När det gäller stressrelaxationsfrekvensen, jämfört med kontrollgruppen, minskade stressrelaxationshastigheten för quadricepssenan i KOA-gruppen (P < 0,05). Jämfört med KOA-gruppen ökade stressrelaxationsgraden för quadricepssenan i akupotomigruppen (P < 0,05, Figur 4D). Dessa resultat visar att akupotomi kan förbättra drag- och spänningsrelaxationsegenskaperna hos quadricepssenan hos kaniner med KOA.
Experimentella resultat av tryck och tryck per ytenhet på broskets kontaktyta och broskmorfologi
När det gäller det maximala trycket på broskkontaktytan, jämfört med kontrollgruppen, fanns det ingen signifikant skillnad i det maximala trycket på broskkontaktytan i KOA-gruppen (P > 0,05), men det fanns en nedåtgående trend. Jämfört med KOA-gruppen fanns det ingen signifikant skillnad i det maximala trycket på broskkontaktytan i akupotomigruppen (P > 0,05), men det fanns en uppåtgående trend (Figur 5A). När det gäller trycket per ytenhet av broskkontaktytan, jämfört med kontrollgruppen, fanns det ingen signifikant skillnad i det maximala trycket per ytenhet i KOA-gruppen (P > 0,05), men det fanns en nedåtgående trend. Jämfört med kontrollgruppen fanns det ingen signifikant skillnad i maximalt tryck per ytenhet i akupotomigruppen (P > 0,05), men det fanns en uppåtgående trend (Figur 5B). Dessa resultat visar att akupotomiinterventionen hade en tendens att öka det maximala trycket och trycket per ytenhet av broskkontaktytan, vilket indikerar positiva effekter på broskstressmiljön.
För att utvärdera effekten av akupotomi på broskmorfologi använde vi Safranin O-Fast Green-färgning. I kontrollgruppen var broskytan slät; kondrocyterna i alla lager var ordnade snyggt och ordnat; de ytliga kondrocyterna var ordnade i en spindelform; de mellersta och djupa lagren av kondrocyter var ordnade i ett kolonnarrangemang; Tidvattenlinjen var klar och fullständig; och det fanns ingen pannusbildning (Figur 6A). I KOA-gruppen var broskets yta grov eller så fanns det skalningsdefekter; antalet ytliga kondrocyter minskade; kondrocythierarkin och arrangemanget var oordnade; det mellersta lagrets kondrocyter visade tecken på uttorkning, sammandragning och nekros; kondrocytkluster observerades; tidvattenlinjer suddades ut eller en förvrängd spricka sågs; Upprepade tidvattenlinjer kunde ses i vissa områden; Blodkärl kan ha passerat genom tidvattenlinjen in i det icke-förkalkade broskskiktet. eller så bildades pannus (figur 6B). I akupotomigruppen var broskets ytskikt relativt slätt; kondrocyternas struktur var normal; arrangemanget av kondrocyter i alla lager var relativt snyggt; tidvattenlinjen var klar eller ibland upprepades tidvattenlinjerna; Det fanns ingen pannusbildning (figur 6C). När det gäller broskmorfologiska poäng, jämfört med kontrollgruppen, ökade broskmarkinpoängen i KOA-gruppen signifikant (P < 0,01). Jämfört med KOA-gruppen var brosk-Markin-poängen i akupotomigruppen signifikant reducerad (P < 0,01, Figur 6D). Dessa resultat visar att broskintegriteten hos kaniner med KOA var skadad, och att akupotomiintervention kunde fördröja nedbrytningen av brosk och ha en skyddande effekt på brosket.
Figur 1: Modifierad Videman-metod för att etablera en modell av knäartros. (A) Material som krävs för att fastställa KOA-modellen. (B) Använd medicinsk tryckkänslig tejp för att täcka kaninens vänstra bakben. C) Linda polymerbandage runt kaninens vänstra bakben. (D,E) Använd skenor för att immobilisera kaninens knä- och fotleder. (F) Linda in ståltrådsnät för att förhindra att kaninerna gnager. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Operationsmetod för akupotomiintervention. A) Hudpreparering vid knäleden på kaninens vänstra bakben. (B) Välj insättningspunkter och använd en kirurgisk hudmarkör för att markera positionerna. (C) Använd medicinsk jodfor för att desinficera. (D) Trycksätt och separera för att undvika nerver och blodkärl. (E) Stick hål i akupotomin och operera. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mekaniska egenskaper hos quadriceps femoris. (A) Analys av Youngs modul av quadriceps femoris; B) Analys av amplituden för enkel kontraktion av quadriceps femoris. (C) Analys av tetanisk kontraktionsamplitud för quadriceps femoris. Värdena är medelvärden ± SD. N = 6 per grupp. Jämfört med motsvarande kontrollgrupp: *P < 0,05 och **P < 0,01; jämfört med motsvarande modellgrupp: #P < 0,05 och ##P < 0,01. Förkortning: KOA = knäartros. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Mekaniska egenskaper hos quadricepssenan. A) Analys av den slutliga belastningen av quadricepssenan. B) Analys av quadricepssenans maximala förskjutning. C) Analys av quadricepssenans styvhet. (D) spänningsrelaxation av quadricepssenan. Värdena är medelvärden ± SD. N = 6 per grupp. Jämfört med motsvarande kontrollgrupp: *P < 0,05 och **P < 0,01; jämfört med motsvarande modellgrupp: #P < 0,05 och ##P < 0,01. Förkortning: KOA = knäartros. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Tryck på broskets kontaktyta. A) Analys av det maximala trycket på broskets kontaktyta. B) Analys av trycket per ytenhet på broskkontaktytan. Värdena är medelvärden ± SD. N = 6 per grupp. Förkortning: KOA = knäartros. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Färgning av brosk med Safranin O-Fast grön och markinpoäng för brosket. (A) kontrollgrupp, (B) modellgrupp, (C) akupotomigrupp, (D) analys av markinpoäng för brosket. Värdena är medelvärden ± SD. N = 6 per grupp. Jämfört med motsvarande kontrollgrupp: **P < 0,01; jämfört med motsvarande modellgrupp: ##P < 0,01. Skalstaplar = 50 μm (A-C). Förkortning: KOA = knäartros. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Jag. Struktur | III. Färgning | ||
| a. Normal | 0 | a. Normal | 0 |
| b. Ojämnheter i ytan | 1 | b. Liten minskning | 1 |
| c. Pannus och ojämnheter i ytan | 2 | c. Måttlig minskning | 2 |
| d. Spalt: till övergångszon. | 3 | d. Kraftig minskning | 3 |
| e. Kluven till radiell zon | 4 | e. Inget färgämne noterat | 4 |
| f. Kluvna till förkalkade zoner | 5 | ||
| g. Fullständig oordning | 6 | ||
| II. Celler | IV. Tidemarks integritet | ||
| a. Normal | 0 | a. Intakt | 0 |
| b. Diffus hypercellularitet | 1 | b. Korsas av blodkärl | 1 |
| c.Kloning | 2 | ||
| d. Hypocellularitet | 3 | ||
Tabell 1: Modifierad Mankin-poäng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En lämplig djurmodell är en av de viktigaste faktorerna för att uppnå experimentella mål och klargöra en specifik vetenskaplig fråga. Denna studie baserades på teorierna om "Zongjin kontrollerar ben och smörjer leder" och "mekanisk obalans" inom akupotomologi, i syfte att förklara den vetenskapliga konnotationen bakom behandlingen av KOA genom att "modulera muskler och senor för att behandla bensjukdomar" i akupotomiterapi. Med andra ord förbättrar akupotomi den onormala mekaniska miljön i brosket genom att reglera de mekaniska egenskaperna hos de mjuka vävnaderna runt knäet för att fördröja degenerationen och skydda brosket. KOA-djurmodeller klassificeras i allmänhet i två kategorier: spontana och inducerade modeller. Spontana KOA-modeller används mindre på grund av relativt lång modelleringstid och större begränsningar. Inducerade KOA-modeller kan etableras genom kirurgiska metoder (t.ex. modifierad Hulth-metod, meniskektomi, ruptur av det främre korsbandet, intraartikulär injektion och ledimmobilisering). Kirurgiska metoder, inklusive skärning av det mediala kollateralligamentet, främre korsbandet, avlägsnande av den mediala menisken och andra strukturer, används för att destabilisera knäleden, vilket kommer att leda till inre mekanisk obalans och direkt friktion mellan ledytorna, vilket inducerar KOA11. Denna typ av modell är mer lämplig för studier av traumatisk artrit. Den intraartikulära injektionen levererar medicin till knäledshålan för att inducera inflammation, metaboliska störningar i kondrocyter och toxiska reaktioner av kondrocyter i ledhålan, vilket utvecklar KOA samtidigt som den har liten effekt på ledstress12. Ledimmobilisering utvecklar och förvärrar ledbroskdegeneration genom att begränsa knäledens rörelse och orsaka atrofi av musklerna och ligamenten runt knäet, vilket resulterar i förändringar i ledspänningen, vilket etablerar en KOA-modell12.
Den modifierade Videman-metoden är en ledimmobiliseringsmetod, som är mer i linje med den patologiska processen av KOA orsakad av svaghet i de mänskliga knämusklerna, som ses vid atrofi av knämusklerna och ligamenten genom att immobilisera knäet i en översträckt position, vilket resulterar i förändringar i ledstress och broskdegeneration. Jämfört med kirurgiska metoder som orsakar ledinstabilitet som resulterar i KOA, är den modifierade Videman-metoden mer i linje med den naturliga patogenesen av KOA där senskada är den första fasen, följt av sen- och bensjukdomen; Det är därför mer lämpligt för denna studie13. Eftersom effekten av akupotomi vid behandling av KOA i tidigt eller mellersta stadium är mer uppenbar, är formningstiden 6 veckor, vilket överensstämmer med de patologiska förändringarna av KOA i mellanstadiet. I processen för modellinduktion kan långvarig översträckningsbromsning leda till att musklerna runt knäleden inte används, och obehaget i vänster bakben får ofta kaniner att gnaga på modellapparater. Eftersom modellapparater kan vara lösa är det nödvändigt att regelbundet kontrollera att enheten av kanintyp är tät och förstärka dem i tid. Dessutom är det nödvändigt att alltid vara uppmärksam på kaninens blodtillförsel i lemmar, svullnad, hudskador och symtom från matsmältningskanalen, och ta bort modellapparaterna vid behov. Eftersom kaninerna är i ett tillstånd av anestesi under denna process är det nödvändigt att hålla kaninerna varma och uppmärksamma kaninernas tillstånd i realtid tills kaninerna vaknar.
Akupotomi innebär en skalpellfunktion utöver den befintliga akupunkturnålen, med hjälp av begreppet akupunktur för att tränga in i kroppen, med skärande och separerande effekter överlägsna en akupunkturnål samtidigt som den ger mycket mindre trauma till människokroppen än en skalpell14. Akupotomologi tror att grundorsaken till KOA är den mekaniska obalansen på grund av mjukdelsskador runt knäleden. Därför är nyckeln till att behandla KOA med akupotomi att återställa den mekaniska balansen i knäleden. När det gäller valet av behandlingspunkter är akupotomi å ena sidan baserad på teorin om meridianer och senor och tar smärtsam lokalitet som akupunkt. Å andra sidan styrs akupotomi av modern anatomi och biomekanik och tror att mjukvävnadsskador runt knäleden orsakar vidhäftning och sammandragning, vilket förstör den mekaniska balansen i knäleden och producerar höga stresspunkter i leden. Därför tas ofta vävnadsvidhäftning, sammandragning och högstresspunkter som behandlingspunkter15,16.
Den biomekaniska analysen av mjukvävnader visar att fästpunkterna för senor och ben oftast är där mjukdelsspänningar koncentreras, även kallad stresskoncentration, och där patologiska produkter som sammanväxningar, kontrakturer och navelsträngsliknande knölar lätt produceras17. Dessutom har klinisk praxis visat att de ömma punkter som hittas vid palpation ofta överlappar med fästpunkterna för senor och ben. Därför valde denna studie seninsättning av vastus medialis, vastus lateralis, rectus femoris, biceps femoris och anserine bursa. Även om akupotomi orsakar mindre trauma på vävnaderna är det fortfarande en metod för invasiva ingrepp. Under ingreppet är det nödvändigt att strikt följa akupotomins fyrstegsprocedur: plats, riktning, pressning-frigörande och punktering. Dessutom måste användarna vara försiktiga med graden av avslappning och behandlingsfrekvensen för varje ingrepp. Det är lämpligt att släppa varje behandlingspunkt 2-3 gånger en gång i veckan för att förhindra överdriven skada på vävnaderna. Efter att akupotomiinterventionen är klar desinficeras knäleden på kaninens vänstra bakben igen och plåster appliceras på akupotomins ingångspunkt.
Stabila knäleder är en förutsättning för att upprätthålla mekanisk balans och utföra normala fysiologiska rörelser18. Muskler och senor - viktiga faktorer för att upprätthålla knäledens stabilitet - är viskoelastiska vävnadsstrukturer som bestämmer musklernas olika mekaniska egenskaper vid sammandragning och passivt drag, som är viktiga komponenter i musklernas mekaniska egenskaper och säkerställer musklernas normala motoriska funktion. Elasticitetsmodulen, en indikator på de mekaniska egenskaperna hos mjuka vävnader, är positivt korrelerad med förändringar i den mekaniska funktionen hos quadriceps femoris19. Fysiologiskt sett innehåller skelettmuskelkontraktion två former: enkel sammandragning och tetanisk sammandragning. Den förstnämnda är den grundläggande enheten för muskelaktivitet, medan den senare huvudsakligen ger smidig rörelse av skelettmusklerna. Därför används den maximala amplituden för enkel och tetanisk kontraktion ofta för att utvärdera muskelkontraktil funktion.
Att inte använda skelettmuskelatrofi leder till minskad tetanisk sammandragning och maximal frivillig kontraktion, vilket indikerar en minskning av muskelkontraktil förmåga20. Nedgången i muskelstyrka kan skada senornas funktion, vilket manifesteras som en minskning av senans viskoelasticitet och en minskning av senornas förmåga att motstå deformation8. Under patologiska tillstånd kan spänningsavslappning och senornas dragegenskaper minska, vilket gör att knäleden tappar balansen och påskyndar utvecklingen av KOA. Därför, i denna studie, valdes elasticitetsmodulen, amplituden för enkel kontraktion, amplituden för tetanisk sammandragning av quadricepssenan, dragegenskaperna hos quadricepssenan såsom ultimat belastning, maximal förskjutning, styvhet, samt spänningsavslappningen av quadricepssenan för att utvärdera effekten av akupotomi på quadricepsens mekaniska egenskaper. Stress- och trycktestet av broskets bärande område och Safranin O/Fast Green-färgningen av knäledsbrosket användes för att utvärdera om akupotomiterapi förbättrade de mekaniska egenskaperna hos quadriceps femoris och utövade en skyddande effekt på brosket. De experimentella resultaten visar att akupotomi i kombination med teorin om att "modulera muskler och senor för att behandla bensjukdomar" kan förbättra stressmiljön i brosk, fördröja broskdegeneration och ha en skyddande effekt på brosket genom att modulera de mekaniska egenskaperna hos muskler och senor i quadriceps.
Det finns vissa begränsningar för det här experimentet. Å ena sidan utvärderade vi inte knäfelställning och dess effekt på biomekaniska obalanser i knäna. Å andra sidan valde denna studie den modifierade Videman-metoden för immobilisering av vänster bakbensförlängning för KOA-modellering för att belysa akupotomins roll för att fördröja broskdegeneration genom att modulera de mekaniska egenskaperna hos mjuka vävnader runt knäet. Akupotomins roll vid knäartros orsakad av traumatiska faktorer, såsom ligament- och meniskskador, har dock inte undersökts. Dessutom är akupotomiintervention en slags sluten, minimalt invasiv kirurgi. I denna studie utfördes både palpations- och akupotomiinterventioner utan att exponera den sjuka vävnaden vid icke-direkta synförhållanden. För att minska subjektiva faktorers inverkan på de experimentella resultaten utfördes både palpation och akupotomiintervention av samma personal. Således, även om det finns vissa begränsningar, påverkar de inte tillförlitligheten i slutsatserna i denna studie.
Sammanfattningsvis beskriver denna uppsats i detalj KOA-modellens induktion med den modifierade Videman-metoden (vänster bakbensextensionsimmobilisering) och akupotomiinterventionen. Den visar också analysen av mekanismen för akupotomibehandling för KOA genom experiment på quadriceps elasticitetsmodul och kontraktila funktion, de mekaniska egenskaperna hos quadricepssenan, kraften och trycket i ledbroskets lagerområde och Safranin O/Fast Green-färgningen av knäledsbrosket. Att studera akupotomins mekanism för att förbättra de biomekaniska egenskaperna hos mjukvävnader kan ge nya insikter om behandling av KOA och andra idrottsrelaterade systemiska skador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (No.82074523,82104996).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acupotomy | Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd. | 0.4 x 40 mm | |
| Connect Cast Orthopedic Casting Tape | Suzhou Connect Medical Technology Co.,Ltd. | KCP06 | 15.0 cm x 360 cm |
| Double-sided Foam Tape | Deli Group Co.,Ltd. | NO.30416 | 36 mm x 5 yard x 2.5 mm |
| Environmental Dewaxing Solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1128 | |
| Ethanol absolute | Beijing Hengkangda Medicine Co., Ltd. | ||
| Fast Green solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1031 | |
| Fast grenn FCF | Sigma,America | 2353-45-9 | |
| Fatigue testing machine | BOSE, America | Bose Electro Force 3300 | |
| Four-channel physiological recorder | Chengdu Instrumeny Frctory | RM-6420 | |
| FPD-305E | Fuji, Japan | ||
| FPD-306E | Fuji, Japan | ||
| Hematoxylin solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1005 | |
| Medical iodophor disinfectant | Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Medical Tape | Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd. | 200402 | 1.5 x 500 cm |
| Muscle tension transducer | Chengdu Instrumeny Frctory | JH-2204005, 50 g | |
| Prescale | Fuji, Japan | ||
| Real-time SWE ultrasound diagnostic instrument | SuperSonic Imagine SA,France | SuperSonic Imagine AixPlorer | |
| Rhamsan gum | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | WG10004160 | |
| Safranine O | Sigma,America | 477-73-6 | |
| Safranine O solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1015 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) | IBM, America |
References
- Roseti, L., Desando, G., Cavallo, C., Petretta, M., Grigolo, B.
- Cui, A. Y., et al. Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies. EClinicalMedicine. 29-30, 100587 (2020).
- Miyauchi, A., et al. Alleviation of murine osteoarthritis by deletion of the focal adhesion mechanosensitive adapter, Hic-5. Sci Rep. 9 (1), 15770 (2019).
- Wright, T. Biomechanical factors in osteoarthritis: the effects of joint instability. HSS J. 8 (1), 15-17 (2012).
- Patsika, G., Kellis, E., Kofotolis, N., Salonikidis, K., Amiridis, I. G. Synergetic and antagonist muscle strength and activity in women with knee osteoarthritis. J Geriatr Phys Ther. 37 (1), 17-23 (2014).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J. X.
- Henriksen, M., Christensen, R., Danneskiold-Samsøe, B., Bliddal, H. Changes in lower extremity muscle mass and muscle strength after weight loss in obese patients with knee osteoarthritis: a prospective cohort study. Arthritis Rheum. 64 (2), 438-442 (2012).
- Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55 (1), 44-51 (2013).
- Felson, D. T. Osteoarthritis as a disease of mechanics. Osteoarthr Cartil. 21 (1), 10-15 (2013).
- Ma, S. N., et al. Effect of acupotomy on FAK-PI3K signaling pathways in KOA rabbit articular cartilages. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4535326 (2017).
- Yu, P., et al. Research progress of experimental animal models of knee osteoarthritis. China Medical Herald. 16 (27), 41-44 (2019).
- Li, L. H., et al. Research progress of rabbit knee osteoarthritis model. Journal of Jiangxi University of Chinese Medicine. 31 (4), 108-113 (2019).
- Zhang, W., Gao, Y., Guo, C. Q., Khattab, I. Z. A., Mokhtari, F. Effect of acupotomy versus electroacupuncture on ethology and morphology in a rabbit model of knee osteoarthritis. J Tradit Chin Med. 39 (2), 229-236 (2019).
- An, X. Y., et al. Chondroprotective effects of combination therapy of acupotomy and human adipose mesenchymal stem cells in knee osteoarthritis rabbits via the GSK3 beta-cyclin D1-CDK4/CDK6 signaling pathway. Aging Dis. 11 (5), 1116-1132 (2020).
- Guo, C. Q., Liu, N. G. Analysis on the distribution features of Ashi points in Jingjin disorders. Journal of Basic Chinese Medicine. 17 (8), 899-900 (2011).
- Guo, C. Q., et al. Effects of acupotomy therapy on tenderness point around knee joint in patients with knee osteoarthritis: a randomized controlled clinical trial. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. 33 (3), 3-5 (2010).
- Zhao, Y., Dong, F. H., Zhang, K. Analysis of soft tissues mechanical changes and treatment of meridian tendon pain. Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. (9), 705-707 (2008).
- Zhang, L. P., Cheng, F., Liu, D. Y., Zhu, L. G. Application progress of biomechanics in knee osteoarthritis. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 34 (7), 1644-1647 (2016).
- Thomas, A. C., Sowers, M., Karvonen-Gutierrez, C., Palmieri-Smith, R. M. Lack of quadriceps dysfunction in women with early knee osteoarthritis. J Orthop Res. 28 (5), 595-599 (2010).
- Li, L., et al. Effects of unloaded muscle atrophy on contractile characteristics of hind-limb skeletal muscles in mice. Space Med Med Eng. 25 (5), 322-325 (2012).
