2.14: 박테리아 성장 곡선 분석 및 환경 응용

1. 세균 문화 알리쿼트 컬렉션

1. 성장 시간 포인트의 수집 하루 전에, 대장균을가진 50 mL 플라스크에서 트립티 케이스 콩 국물 (TSB) 배지의 20 mL을 접종.
2. 27 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 이 비교적 긴 잠복기는 대략 10⁹ CFU/mL의 야생 형 대장균의 고정된 상 인구 에 초래됩니다.
3. 다음 날, 준비된 배양의 100 μL을 사용하여 TSB의 250mL(500mL 플라스크)를 접종하십시오. 완전히 섞으세요.  5mL 알리쿼트를 제거하고 4°C에서 즉시 냉장 보관하십시오. 이것은 T = 0 또는 T₀ 시간 지점이며 약 4 x 10⁵ CFU / mL을 포함해야합니다.
4. 나머지 대장균(245mL)의 플라스크를 37°C 쉐이킹 인큐베이터에 놓습니다. 매시간 최대 8시간 동안 5mL 의 문화 알리쿼트를 제거하십시오. 각 알리쿼트를 4°C에 저장합니다. T 1부터 T_8까지이러한 알리쿼트_T를 지정합니다.

2. 직렬 희석

1. 냉장고에서 대장균의 알리쿼트를 제거하고 얼음 위에 놓아 운반하십시오. 모든 문화를 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
2. 각 대장균 배양(도3)의다양한 희석을 얻기 위해 일련의 희석 튜브를 설정합니다. 마이크로퍼지 튜브는 이 기능에 편리합니다. 각 희석 관에는 희석 액(멸균 식염수)의 900 μL이 있어야 합니다. 각 대장균 배양(T₀ ~T_8);에대해 희석 시리즈가 필요합니다. 표 2에따라 각 튜브에 레이블을 지정합니다.
   
   그림 3. 대장균도금시술을 보여주는 회로도.
3. _T0의 10-1 희석인 튜브 A에 T 0(초기 대장균 배양)으로 표시된 튜브로부터 대장균의 100 μL을 첨가하여 희석을 시작한다. 5 초 튜브를 소용돌이.
4. 이어서,_T0의^10-2 희석인 식염수, 튜브 B의 다음 튜브에 튜브 A의 100 μL을 추가한다. 각 시간 점 알리쿼트에 대해 필요한 희석 계열을 계속합니다. 전송하기 전에 각 튜브를 소용돌이해야합니다. 각 전송에 새 파이펫 팁을 사용하는 것도 중요합니다.

표 2. 각 대장균 배양에 필요한 희석 계열.

3. 도금

1. 표 3에따르면 각 대장균 배양 시간점에 대한 3개의 희석이 도금됩니다. 시점을 가진 라벨 플레이트(T₁ ~T_8),희석 계수 및 부피가 추가됩니다. 각 희석에 트리플리케이트 플레이트를 사용합니다.
2. 각 희석의 100 μL을 한천판의 중앙에 배관하여 접시에 100 μL을 추가한다(도3). 화염 살균 "L" 모양의 유리 막대를 사용하여 즉시 알리쿼트를 퍼뜨리는 행위. 알리쿼트가 즉시 퍼지지 않으면 접시에 앉아 서초기 접종 지점에서 세균과 자라납니다.
3. 시간 점 T_1에서 T_8까지각 희석 계열에 대한 도금을 반복합니다. 플레이트 사이와 특히 다른 희석 사이에 막대를 살균하는 것을 기억하십시오.
4. 접시가 몇 분 동안 건조되면, 반전하고 하룻밤 37 °C 인큐베이터에 배치합니다. 판을 반전시키는 것은 천판에 떨어지는 결점을 배제합니다. 하룻밤 동안 잠복한 다음, 접시를 냉장고에 보관해야합니다.

^* 낮은 희석제는 사망 단계로 인해 더 낮은 인구를 고려합니다.

표 3. 대장균 배양을 위한 도금 프로토콜.

4. 식민지 를 계산하고 평균 세대 시간을 계산

1. 식민지의 균일성과 오염의 부족에 대한 플레이트를 검사합니다.
2. 각 시간 지점(T₀ ~T_8)에대해 30~300개의 콜로니를 포함하는 희석을 선택하고 삼중판수를 계산합니다.
3. 희석 계수를 사용하여, T0~T8을 통해 시간 지점에서 원래 배양의mL당 셀 수를 백계산한다. 예를 들어^10-4 희석으로 인한 콜로니 수가 30, 28 및 32인 경우:
   식민지의 평균 수 = 30 식민지
   이는^10-4 희석의 0.1mL에서 발생했습니다.
   mL 당 콜로니 수 = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. 플롯 로그₁₀ CFU/mL 대 시간(시간).
5. 그래프에서 기하급수적 성장 단계를 식별합니다. 지수 성장 단계 내에서 2시간 점과 매번 해당 셀 수를 사용하여 평균 생성 시간을 계산합니다.

박테리아의 성장률을 측정하는 것은 기본적인 미생물 학적 기술이며 기초 연구뿐만 아니라 농업 및 산업 응용 분야에서 널리 사용됩니다.

박테리아는 지구상에서 가장 풍부한 생명체 중 하나이며 인체를 포함한 모든 생태계에 존재합니다. 특정 박테리아 종은 또한 유전적으로 다루기 쉬우며 연구 모델로 활용되거나 산업 규모에서 천연 또는 합성 제품을 생산하는 데 활용되었습니다. 그러나 모든 박테리아 종을 실험실에서 배양할 수 있는 것은 아닙니다. 할 수 있는 사람들에게 중요한 특징은 곱셈 속도 또는 "성장 역학"입니다.

박테리아 배양의 성장 속도를 측정하면 과학자들에게 박테리아의 생리학적 및 대사 기능에 대해 알릴 수 있으며, 다운스트림 응용 분야에서 박테리아의 정확한 세포 수를 얻는 데에도 유용합니다.

이 동영상은 박테리아 성장률 분석의 원리를 소개하고, "성장 곡선"으로 성장률을 특성화하는 프로토콜을 시연하며, 마지막으로 박테리아 성장 역학을 측정하기 위한 여러 환경 과학 응용 분야를 살펴봅니다.

박테리아는 일반적으로 무성 생식을 하며, 하나의 부모 세포가 두 개의 동일한 딸 세포로 분열하는 간단한 이진 분열로 증식합니다. 영양분을 풍부하게 이용할 수 있고 온도와 같은 환경적 요인이 모두 성장에 도움이 되는 유리한 성장 조건에서는 번식 속도가 사멸률을 훨씬 초과합니다. 그 결과 기하급수적인 성장이 이루어집니다.

배양액에 포함된 박테리아의 양을 시간의 함수로 측정하여 성장 곡선을 얻을 수 있습니다. 최적의 조건에서 액체 배양액에서 박테리아를 성장시키면 다양한 단계로 나눌 수 있는 특징적인 모양의 성장 곡선이 생성됩니다. 곡선은 박테리아가 배양 조건에 적응하는 동안 성장이 느린 "지연 단계"로 시작됩니다. 다음은 박테리아가 기하급수적으로 성장하는 "로그" 또는 "지수 단계"입니다. 영양소가 고갈되고 노폐물이 쌓이면 결국 성장이 멈춰 "정지 단계"가 됩니다. 마지막으로, 증식 속도가 세포 사멸 속도보다 추월되면 배양은 "사멸 단계"에 들어갑니다.

성장 곡선을 구성하기 위해 액체 배양 플라스크의 박테리아 수는 특정 배양 기간 동안 다른 시점에서 계산됩니다. 박테리아 수는 여러 가지 방법으로 얻을 수 있습니다. 한 가지 일반적인 접근 방식은 600nm의 파장에서 박테리아 용액의 광 흡수도인 광학 밀도 또는 "OD" 600을 측정하는 것입니다.

또 다른 방법은 배양물의 밀리리터당 "CFU" 또는 집락 형성 단위를 결정하는 것입니다. 박테리아 성장의 클론 특성으로 인해 배양액의 한 박테리아는 이론적으로 한천 플레이트에서 관찰 가능한 하나의 군체로 확장될 수 있습니다. 박테리아 배양액을 일련의 희석액으로 도금하여 개별적인 개별 콜로니를 관찰할 수 있는 박테리아 농도에 도달함으로써("연속 희석 도금"이라는 방법) 콜로니 수를 사용하여 mL당 CFU로 박테리아 농도를 역계산할 수 있습니다.

이제 박테리아 성장을 분석하는 방법을 이해했으므로 연속 희석 도금 방법을 사용하여 잘 정립된 박테리아 모델인 대장균의 순수 배양에 대한 성장 곡선 분석을 수행하기 위한 프로토콜을 살펴보겠습니다.

시점 채취 하루 전, 50mL 플라스크에 사전 멸균된 트립티아제 소이 육수 또는 TSB 배지 20mL를 단일 대장균 콜로니와 함께 접종합니다.

37세에 하룻밤 사이에 문화를 배양하십시오. C를 흔들어 줍니다. E. coli의 경우 이로 인해 약 109 CFU/mL의 고정상 집단이 발생합니다.

다음날, 100명을 접종하라 ? L을 500mL 플라스크에 250mL의 TSB로 하룻밤 배양합니다. 철저히 섞는다. 이는 약 4 x 105 CFU/mL의 희석 배양액을 생성합니다. 이 희석된 배양액 5mL를 배양 튜브에 보관합니다. 이것은 시점 0 또는 T0의 부분 표본입니다. 4 °C에서 즉시 냉장 보관하십시오.

배양의 남은 부피를 37 °C에서 배양하십시오. C를 흔들어 줍니다. 이후 최대 8시간 동안 매시간 배양물에서 5mL 부분 표본을 수집합니다. 이 샘플을 T1에서 T8로 지정하고 모두 4 ? C를 사용할 때까지.

실험 당일, 냉장고에서 대장균 시점 분취 표본을 꺼내 얼음 위에 보관합니다. 각각 900개가 있는 멸균 마이크로분리관 사용 ? L의 멸균 식염수, 다음 표에 따라 각 부분 표본에 대한 희석 시리즈를 설정합니다.

부드럽게 와류로 T0 배양을 잘 섞은 다음 100을 추가합니까? L을 희석 시리즈의 튜브 A에 연결하여 1/10 또는 10-1 희석을 만듭니다. Vortex Tube A를 혼합하고 새 피펫 팁을 사용하여 100을 추가합니까? 튜브 A의 L을 튜브 B로 변환하여 1/100 또는 10-2 희석을 만듭니다.

각 배양 부분 표본에 대해 이 과정을 반복하고 표 2에 따라 적절한 희석 시리즈를 만듭니다. 모든 시점 샘플에 대한 희석 시리즈가 만들어지면 박테리아 도금을 위해 적절한 수의 멸균 트립티아제 대두 한천 플레이트를 준비하십시오.

각 시점 문화의 3회 희석액은 다음 표에 따라 3회로 도금됩니다. 그에 따라 플레이트에 레이블을 지정합니다. 그런 다음 피펫 100 ? 각각의 한천 플레이트의 중앙에 적절하게 희석 된 배양물을 각각 L. "L"자형 유리 막대를 화염 살균하고 막대를 접종물에서 멀리 떨어진 한천에 닿혀 식힌 다음 즉시 한천 표면에 액체를 펴 바릅니다. 확산이 지연되면 접종 부위에서 박테리아가 과도하게 증식할 수 있습니다.

9개의 시점 배양 모두에 대해 각 희석 시리즈를 계속 도금하고 각 희석 시리즈 사이의 유리 확산 막대를 화염 살균합니다.

플레이트가 몇 분 동안 건조되면 뒤집어서 37 ? 하룻밤 동안 C 인큐베이터. 이 성장 기간이 지나면 플레이트를 4 °C에서 보관할 수 있습니다.

희석 플레이트를 하룻밤 동안 배양한 후 오염 및 콜로니의 균일성을 검사합니다. 각 시점 배양에 대해 플레이트당 30-300개의 콜로니가 있는 희석액을 선택합니다. 그 희석을 위해 각 삼중 플레이트에 있는 콜로니의 수를 세십시오.

각 희석액에 대한 평균 콜로니 수와 희석 계수를 사용하여 각 시점에서 원래 배양액의 박테리아 농도를 CFU/mL 단위로 계산합니다. 예를 들어, 0.1mL의 10-4 또는 1/10,000 희석액에서 얻은 삼중 플레이트 세트에서 평균 30개의 콜로니가 있는 경우 30을 0.1mL로 나눈 값에 10,000을 곱한 값, 즉 300만 CFU/mL가 됩니다.

각 시점에 대해 계산된 박테리아 농도를 사용하여 시간 단위(시간)에 대한 박테리아 농도의 base-10 로그(CFU/mL) 그래프를 플로팅합니다. 그래프에서 원래 박테리아 배양의 성장 로그 단계를 식별하고 로그 단계 내에서 두 개의 시점을 선택하여 이 중 첫 번째 시점을 t = 0으로 지정합니다. 방정식 X가 2에 n의 거듭제곱에 X0를 곱한 값을 사용하여 평균 생성 시간을 계산하며, 여기서 X는 시간 t에서의 박테리아 농도, X0는 t = 0에서의 초기 농도, n은 두 시간 지점 사이에 경과한 세대 수입니다.

예를 들어, X0가 1,000CFU/mL이고 t = 6h에서 농도가 16,000CFU/mL라고 가정합니다. 방정식을 사용하여 4개의 세대가 6시간 이내에 발생했음을 알 수 있으며, 이는 6의 세대 시간을 세대당 4 또는 1.5시간으로 나눈 값을 제공합니다.

박테리아 성장 역학의 측정은 연구, 농업 또는 생명 공학 목적을 위한 많은 응용 분야의 기본입니다.

박테리아 성장 속도를 알기 위한 한 가지 용도는 다른 배양물 또는 배지를 접종하기 위해 정확한 양의 박테리아 배양액을 얻을 수 있도록 하는 것입니다. 예를 들어, 콩과 식물과 같은 특정 작물은 식물의 뿌리에 서식하여 혹을 형성하고 질소를 "고정"하여 대기 중 질소를 식물이 사용할 수 있는 암모니아로 변환하는 리조비아(rhizobia)로 알려진 공생 박테리아와 함께 재배해야 합니다. 농업 응용 분야의 경우, 알려진 양의 rhizobia를 이탄 기반 탄소 배지에 첨가한 다음 콩과 식물 씨앗을 접종하여 식물-박테리아 공생을 확립하는 데 사용합니다.

성장 분석은 산업 폐기물을 분해하고 귀중한 부산물을 생성할 수 있는 박테리아 종을 식별하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 예에서 연구원들은 목재 펄프 및 제지 생산에서 발생하는 폐기물인 흑액이 보충된 성장 배지가 환경 미생물 분리물의 성장에 어떤 영향을 미치는지 조사했습니다.

박테리아는 흑액으로 향상된 성장을 보여주었을 뿐만 아니라 흑액에 박테리아가 대사할 수 있는 하나 이상의 탄소원이 존재함을 나타내는 "이형성" 성장 패턴을 보여주었습니다. 그런 다음 보다 자세한 성장 분석을 위해 흑액의 개별 성분을 추출할 수 있었습니다.

마지막으로, 성장률 측정은 기름 오염 개선과 같은 특정 산업 목적을 위해 설계된 박테리아를 특성화하는 데에도 유용합니다. 여기서 과학자들은 석유의 탄화수소 성분을 분해하는 효소를 포함하는 유전자 조작 박테리아 균주를 만들었습니다. 예를 들어, 독성 탄화수소가 존재할 때 조작된 박테리아가 정상 박테리아보다 성장률이 증가하여 조작된 박테리아가 오염 정화 기능을 수행할 수 있도록 내성이 향상되었음을 확인하기 위해 성장 분석을 수행했습니다.

성장 곡선을 사용하여 박테리아 성장률을 분석하는 방법에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 이제 박테리아 배양의 다양한 성장 단계, 시점 수집 및 연속 희석 도금을 사용하여 성장 곡선을 얻기 위한 실험을 수행하는 방법, 성장 분석을 연구 및 산업 목적에 적용하는 방법을 이해해야 합니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!