이온 교환 크로마토그래피
출처: 박사의 실험실.B 질 벤턴 - 버지니아 대학
이온 교환 크로마토그래피는 충전에 따라 문체를 분리하는 크로마토그래피의 한 유형입니다. 이온 교환 수지라고 하는 솔리드 지지대에서 충전된 고정 단계로 채워진 열이 사용됩니다. 강력한 양이온 교환 크로마토그래피는 음전하…
1. 샘플 및 열 준비
- 이 데모에서, 2 단백질의 혼합물은 양이온 교환 컬럼에 분리될 것이다: 헤모글로빈과 사이토크롬 C. 단백질 샘플및 소용돌이에 0.2 mL 평형 버퍼(pH 8.1)를 추가하여 철저히 섞는다. 2 분 동안 원심 분리기는 거품을 제거합니다.
- 수지침이 정착할 수 있도록 5분 동안 시험관에 양이온 교환 컬럼을 놓습니다. 테스트 튜브를 링 스탠드에 컬럼으로 고정하여 똑바로 세워 있는지 확인합니다.
- 열의 위쪽 캡을 열고 아래쪽 캡을 엽니다. 컬럼의 버퍼가 중력 하에서 테스트 튜브로 흘러 내도록 합니다.
- 열 볼륨(이 경우 열 볼륨은 0.3 mL)으로 열을 평형 버퍼로 두 번 세척합니다. 평형 버퍼의 첫 번째 열 부피(0.3 mL)가 두 번째 열 볼륨을 추가하기 전에 폐기물 바이알에 드립하게 합니다. 이 단계를 사용하면 열이 평형 버퍼와 일치할 수 있습니다. 이 단계에서 계피 버퍼를 천천히 추가하여 수지를 방해하지 않습니다.
2. 양이온 교환 컬럼을 통해 단백질 샘플 실행
- "언바운드 1"이라고 표시된 2mL 원심분리기 튜브에 컬럼을 넣습니다. 단백질 샘플의 0.1 mL을 조심스럽게 컬럼 의 상단에 적재합니다.
- 샘플이 컬럼 의 상단에 로드되면 컬럼 상단에 버퍼를 추가하고 끝까지 떨어 뜨릴 수 있도록하여 평형 버퍼0.3mL로 세척하십시오. 이 단계4배(총 5개의 세척용)를 반복하고 별도의 2mL 원심분리기 튜브에서 각 세척을 수집합니다. 튜브를 "언바운드 1-5"로 레이블을 지정합니다.
- 마지막 2 개의 세하의 경우 원심분리기는 1,000 x g에서 10 초 동안 원심분리기를 사용하여 모든 언바운드 종들이 열에서 벗어날 수 있도록 합니다. 열에 바인딩하는 모든 샘플은 이러한 세척에 없어야하지만 바인딩되지 않는 샘플은 유지되지 않고 씻어 내게 됩니다. 원심 분리는 열에서 언바운드 재료를 씻는 데 더 많은 힘을 제공합니다.
- "바운드 1"이라고 표시된 새로운 2mL 원심분리기 수집 튜브에 컬럼을 넣습니다. 0.3mL의 용출 버퍼(높은 소금, pH 5.5)를 열 위에 놓습니다. 원심 분리는 1,000 x g에서 10 s에 대한 결과 용액을 합니다.
- 용출 단계를 2회 더 반복하여 컬럼을 새로운 원심분리기 튜브에 넣고 0.3mL를 추가하고 10초동안 원심분리를 합니다. 이 "바운드 2 및 3"에 레이블을 지정합니다.
- 분수에 대한 색상 변경 또는 관찰을 기록합니다. 헤모글로빈은 붉은 갈색으로 보이는 색의 단백질이며, 사이토크롬 C는 붉은 색입니다.
3. 결과: 헤모글로빈과 사이토크롬 C의 양이온 교환
- 사이토크롬 C는 pI가 10.5이고 헤모글로빈은 6.8의 pI를 가지고 있습니다. 따라서 pH 8.1 평형 버퍼가 사용되는 경우, 헤모글로빈은 음전하되기 때문에 열에 결합하지 않습니다. Cytochrome C는 이 pH에서 양호하게 충전되며 pH가 pI를 < 때문에 열에 바인딩됩니다.
- 헤모글로빈은 열에 바인딩되지 않기 때문에 언바운드 분수에서 관찰됩니다.
- Cytochrome C는 양이온 교환 열에 바인딩되었기 때문에 바운드 된 분획으로 관찰됩니다.
그림 1. 언바운드 분수(헤모글로빈)와 바운드 분수(시토크롬 C)의 그림입니다.
이온 교환 크로마토그래피는 전하를 띤 화합물, 특히 큰 생체 분자의 분리 및 분리에 널리 사용됩니다.
이러한 유형의 액체 크로마토그래피는 레진이라고 하는 패킹된 고정상 비드 컬럼을 사용합니다. 이 기술은 하전된 수지와의 친화도에 따라 분석물을 분리합니다.
이 기술에는 두 가지 주요 유형이 있습니다. 양이온 교환 크로마토그래피에서는 음전하를 띤 수지를 사용하여 양전하를 띤 분석물을 결합합니다. 마찬가지로, 음이온 교환에서 음전하를 띤 분석물은 양전하를 띤 수지에 결합합니다. 결합되지 않은 화합물은 컬럼을 통해 세척되고 분석물은 별도의 용기에 수집될 수 있습니다.
이 동영상은 이온 교환 크로마토그래피의 기초를 소개하고 실험실에서 단백질 혼합물을 분리하여 기술을 시연합니다.
고정상은 성공적인 분리를 위한 핵심 구성 요소입니다. 강한 양이온 교환 수지는 일반적으로 설폰산과 같은 강산 작용기를 특징으로 합니다. 약한 양이온 교환 수지는 카르복실산과 같은 약한 그룹을 특징으로 합니다.
마찬가지로, 강한 음이온 교환 수지는 4차 아민과 같은 강한 염기를 사용하는 반면 약한 음이온 교환 수지는 2차 또는 3차 아민을 사용합니다. 수지의 선택은 샘플 혼합물의 특성과 관심 분석물에 따라 달라집니다.
통칭하여 이동상(mobile phase)이라고 하는 사용되는 완충액은 특히 pH 측면에서 분리에 중요합니다. 단백질의 경우 pH는 등전점 또는 pI를 기준으로 선택됩니다. 단백질의 pI와 동일한 pH에서 단백질은 중성입니다. pI 위에서는 순 음전하를 띠고 pI 아래에서는 순 양전하를 띱니다. 완충액 pH를 선택하여 단백질이 적절하게 충전되고 고정상에 결합할 수 있도록 해야 합니다.
이온 교환 크로마토그래피는 일반적으로 4단계 공정입니다. 먼저, 음이온 또는 양이온 교환 수지를 포함하는 패킹된 컬럼을 완충액을 사용하여 평형화합니다. 음이온 교환 컬럼의 경우, 여기에는 수지를 양성자화하여 양전하를 띠도록 하는 작업이 포함됩니다.
다음으로, 샘플이 열에 로드됩니다. 완충액은 전도성이 낮아야 하는데, 하전된 종이 수지와의 상호 작용을 위해 샘플과 경쟁할 수 있기 때문입니다. 반대 전하의 화합물이 수지에 결합합니다. 전하를 띠지 않았거나 동일한 전하를 띤 분자는 결합되지 않은 상태로 남아 있습니다.
세 번째 단계에서는 열을 추가 버퍼로 세척하여 열에서 바인딩되지 않은 구성 요소를 제거하고 바인딩을 남겨 둡니다.
마지막으로, 네 번째 단계는 결합된 분석물을 용리하는 것입니다. 이는 염 농도가 점진적으로 증가하는 염 구배를 사용하거나 높은 염 용리 완충액을 사용하여 수행됩니다.
약하게 결합된 분자는 먼저 용리되는데, 이는 저염이 수지에 대한 이온 결합을 가장 쉽게 방해하기 때문입니다. 더 강하게 결합된 화합물은 더 높은 염 농도로 용리됩니다.
이제 이온 교환 크로마토그래피의 기본 사항을 설명했으므로 두 단백질을 분리하는 데 사용되는 방법을 살펴보겠습니다.
먼저 단백질 혼합물을 분리하기 위해 0.2mL의 결합 완충액을 넣고 와류를 완전히 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 원심 분리하여 거품을 제거합니다. 양이온 교환 컬럼을 준비하려면 링 스탠드에 수직으로 고정하고 수지가 가라앉도록 합니다.
기둥의 위쪽 캡을 연 다음 아래쪽을 엽니다. 버퍼가 중력에 의해 아래의 튜브로 떨어지도록 합니다.
컬럼을 준비하려면 완충액의 컬럼 부피(이 경우 0.3mL)를 로드하여 평형을 이룹니다. 버퍼가 컬럼에서 폐기물 바이알로 떨어지도록 합니다. 버퍼의 열 볼륨이 종료된 후 평형 단계를 반복합니다.
실험을 실행하려면 "Unbound 1"이라고 표시된 2mL 원심분리 튜브를 컬럼 아래에 놓습니다. 단백질 샘플 0.1mL를 컬럼 상단에 조심스럽게 로드합니다.
샘플이 로드되면 컬럼 부피의 버퍼로 세척하고 끝까지 흐르도록 합니다. 총 5회 세탁을 반복합니다. "Unbound 1"에서 "5"까지 레이블이 지정된 자체 튜브에 각 세척을 수집합니다.? 마지막 2회 세척의 경우 컬럼을 10초 동안 원심분리하여 결합되지 않은 모든 종이 컬럼에서 씻겨 나왔는지 확인합니다. 컬럼을 새 2mL 원심분리 수집 튜브에 넣고 "Bound 1"이라는 레이블을 지정합니다.? 용리 버퍼의 1 column-volume을 컬럼 위에 로드합니다. 1,000 x g에서 10초 동안 원심분리기.
용리 단계를 2회 더 반복하여 결합된 분석물을 수집합니다. 튜브에 "Bound 2" 및 "3"이라는 레이블을 지정합니다.? 분수에 대한 색상 변화 또는 관찰 사항을 기록합니다.
이 예에서는 헤모글로빈과 시토크롬 C가 분리되었습니다. 헤모글로빈의 pI는 6.8이고 시토크롬 C의 pI는 10.5입니다. pH 8.1 완충액에서 헤모글로빈은 음전하를 띠며 컬럼에 결합하지 않습니다. 반대로, 시토크롬 C는 pH 8.1에서 양전하를 띠고 컬럼에 결합합니다.
갈색을 띤 단백질인 헤모글로빈(hemoglobin)이 결합되지 않은 분획에서 발견되었으며, 붉은색을 띤 단백질인 시토크롬 C(cytochrome C)가 결합되지 않은 분획에서 관찰되었습니다.
액체 크로마토그래피에는 여러 가지 형태가 있으며, 각 형태는 혼합물의 구성 요소를 분리하는 능력이 다릅니다.
이 예에서는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 단일 및 이중 가닥 DNA의 혼합물을 분리했습니다. 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HA)는 양전하를 띤 칼슘 이온으로 인해 고정상으로 일반적으로 사용되는 인산칼슘의 결정 형태입니다. 이 경우 HA 컬럼은 DNA의 음전하를 띤 백본에 결합할 수 있으므로 DNA 분리에 이상적이었습니다.
단백질을 분리하는 데 자주 사용되는 또 다른 형태의 컬럼 크로마토그래피는 고정 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)입니다. IMAC에서 고정상은 금속 이온이 있는 리간드를 가지고 있으며, 이 리간드는 관심 단백질의 히스티딘 태그에 결합합니다.
혼합물의 다른 모든 성분은 컬럼을 빠져 나옵니다. 그런 다음 단백질은 히스티딘과 유사한 구조를 가지며 금속 이온과 더 강하게 결합하는 이미다졸 용액으로 용출됩니다.
컬럼 크로마토그래피의 일반적인 응용 분야는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)입니다. HPLC는 혼합물에서 생물학적 및 비생물학적 화합물의 식별 및 분리를 위해 분석 화학에서 널리 사용됩니다.
HPLC는 자동화되어 있고 매우 높은 압력에서 작동된다는 점을 제외하고는 이 동영상에서 시연된 컬럼 크로마토그래피와 유사합니다. 이를 통해 더 높은 표면적 대 부피 비율을 가진 더 작은 고정상 비드를 사용할 수 있습니다. 따라서, 이동상에서 고정상과 성분 사이의 개선된 상호 작용이 가능합니다.
방금 JoVE의 이온 교환 크로마토그래피에 대한 소개를 시청하셨습니다. 이제 그 이면의 개념, 관련된 4단계 및 몇 가지 관련 기술을 이해해야 합니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
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Q1: What is the difference between cation-exchange and anion-exchange chromatography?
Cation-exchange chromatography uses negatively-charged resin to bind positively-charged analytes, while anion-exchange chromatography uses positively-charged resin to bind negatively-charged analytes. The choice depends on the charge properties of your sample mixture and the analyte of interest. Selection of the appropriate resin type is critical for successful separation.
Q2: How does pH affect protein binding in ion-exchange chromatography?
Protein charge depends on pH relative to its isoelectric point (pI). At pH equal to the pI, the protein is neutral and won't bind. Above the pI, proteins are negatively charged; below it, they are positively charged. Buffer pH must be selected so the protein has the correct charge to bind to the resin effectively.
Q3: What are the four main steps in an ion-exchange chromatography procedure?
First, equilibrate the column with buffer to charge the resin. Second, load the sample in low-conductivity buffer so analytes bind based on charge. Third, wash with buffer to remove unbound components. Fourth, elute bound analytes using a salt gradient or high-salt buffer to recover the purified sample.
Q4: Why does salt concentration matter during elution in ion-exchange chromatography?
Salt ions compete with analytes for binding sites on the resin. Weakly bound molecules elute first at low salt concentrations, while strongly bound compounds require higher salt concentrations to disrupt ionic interactions and elute from the column. This allows selective recovery of analytes based on binding strength.
Q5: What types of resin are used in strong versus weak ion-exchange chromatography?
Strong cation-exchange resins feature sulfonic acid groups, while weak cation-exchange resins use carboxylic acids. Strong anion-exchange resins utilize quaternary amines, and weak anion-exchange resins use secondary or tertiary amines. Selection depends on sample properties and the desired separation outcome for your analyte.
Q6: How does ion-exchange chromatography compare to other separation techniques?
Ion-exchange chromatography separates based on charge and is more general than affinity chromatography, which requires specific antibodies for each analyte. Unlike high-performance liquid chromatography, which operates at high pressures with automated systems, ion-exchange uses gravity-driven flow and can be adapted for many proteins with different eluting conditions.
Q7: What is the role of buffer conductivity when loading samples onto an ion-exchange column?
Low-conductivity buffer is essential during sample loading because high salt concentrations cause charged species to compete with the sample for interactions with the resin. This competition reduces binding efficiency and separation quality, so the loading buffer must have minimal salt content to maximize analyte capture on the column.