항체 생성: 융합 세포를 사용한 단일 클론 항체 생성

참고: 멸균 세포 배양 기술은 항체 정화 단계까지 혼성종 세포 및 미디어를 멸균 방식으로(예를 들어, 생물안전 캐비닛에서)로 처리할 때 유지되어야 한다.

1. 동결 된 혼종 세포를 해동

1. 37°C 수조에서 냉동 혼종 세포를 함유한 바이알을 해동(약 2분)까지 배양합니다.
2. 해동 된 세포를 완전한 RPMI10 mL (RPMI는 10 % 태아 소 세럼, 100 U /mL 페니실린, 100 μg /mL 연쇄 상감, 1mM 나트륨 pyruvate, 1x 비 필수 아미노산, 50 μ-10 μm)를 포함하는 15 mL 원추형 튜브에 추가하십시오.
3. 1200 RPM에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 오염된 동결 매체를 씻어낼 수 있습니다.
4. 원심 분리 후 액체 상체를 버리고 5mL의 신선한 완전 RPMI로 셀 펠릿을 다시 분리하십시오. 이어서, 15mL 완전 RPMI를 함유하는 T75 조직 배양 플라스크에 세포를 추가한다(RPMI의 최종 부피는 20mL이다).
5. 표준 인큐베이터에서 5% CO_2로세포를 37°C에서 성장시면 됩니다. 세포는 배양에 있는 동안 비 신봉입니다.

2. 하이브리드종 확장

1. 플라스크가 ~80% 컨실수 될 때까지 세포가 약 3일 동안 팽창하도록 합니다.
   참고: 이 시간의 양은 세포의 시작 수에 따라 다를 수 있습니다., 다른 세포의 성장 속도에 내재 된 차이 뿐만 아니라. 세포가 기하급수적 성장 단계에 있는 것이 중요합니다.
2. 초기 플라스크가 ~80%의 합류에 도달하면, 이 초기 T75 플라스크에서 세포를 제거하고 원추형 원심분리기 튜브에 넣고 스핀(1200 RPM for 5분)을 사용하여 세포를 펠릿합니다.
3. 완전한 RPMI의 6mL에서 세포를 다시 중단한 다음 셀 서스펜션을 3개의 새로운 T75 플라스크(18mL RPMI를 함유한 2mL/플라스크)로 분배한다. 이 세 개의 T75 플라스크를 37°C에서 5% CO_2로 배양하여 ~80% 컨할 때까지 배양합니다(약 3일이 소요됩니다).

3. 세럼이 없는 매체의 항체 생산

참고: 이 시점에서, 세포는 혼종 세포주의 성장을 위해 설계된 혈청없는 매체에서 그들의 성장을 계속할 준비가 되어 있습니다. 이 프로토콜에서는 HB101 보충 제품을 포함하는 즉시 사용 가능한 HB 기저 액체 매체를 사용합니다.

1. 3개의 T75 플라스크(~80% 수렴)의 각각의 세포가 수집되고 원심분리(5분 동안 1200RPM).
2. 각 T75 플라스크의 셀 펠릿은 10mL보충 HB101 세럼 프리 배지로 재주중단된 다음, 2개의 T225 플라스크보충 HB101 세럼 프리 배지(즉, 5mL 셀 서스펜션각각 ~220-240 mL HB101)를 함유하고 있다.
3. 3주 동안 5%_CO2로 T225 플라스크 및 HB101 미디어에서 세포를 계속 성장시키고, 세포가 죽기 시작할 때까지 계속 성장한다. 세포는 이 3 주 도중 mAb를 생성하고 배양 배지로 분비하고 있습니다. 세포가 죽기 시작하면 더 이상 mAb를 생성하지 않습니다.

4. 항체 정화 - 1일차

참고: 이 시점에서, 멸균은 유지될 필요가 없으므로 멸균 방식으로 미디어를 취급할 필요가 없습니다(예를 들어, 생물안전 캐비닛에서)는 필요하지 않다. 또한, hybridomas는 "BSL2 수준" 에이전트로 간주되지 않습니다.

1. 고정 각도 로터를 위해 플라스크에서 미디어를 튜브에 붓습니다. 원심분리기에서 10,000 RPM의 고정 각도 로터로 튜브를 8분간 회전시합니다. 이 단계는 문화 상수에서 세포 이물질을 제거하도록 설계되었습니다.
   참고: 튜브 크기는 사용되는 로터에 따라 다를 수 있습니다. 기억해야 할 중요한 것은 원심분리 전에 로터가 제대로 균형을 이루도록 튜브에 동일한 부피를 갖는 것입니다. 미디어의 전체 볼륨이 한 번에 원심분리기에 맞지 않을 가능성이 높습니다. 나머지 미디어는 동일한 튜브를 사용하여 나중에 원심 분리됩니다 (단계 4.5).
2. 얼음으로 둘러싸인 양동이에 스티어 바가 있는 2L 플라스틱 비커를 준비합니다. 교반 접시에 놓습니다.
3. 1L 병에 500mL 필터 탑을 부착합니다. 적절한 튜브를 통해 진공을 수용하기 위해 병 상단 필터 장치를 부착하십시오.
4. 4.1 단계 (여전히 하이브리드 종 세포에 의해 생성 된 mAb를 포함하는) 에서 상체를 필터 상단에 붓습니다.
5. 동일한 튜브 세트를 사용하여 미디어에서 세포 이물질을 펠릿으로 계속 사용하십시오(펠릿은 계속 빌드됩니다). 필터 상단이 가득 차서 또 다른 상복부 배치가 쏟아질 준비가 될 때까지 진공을 실행하십시오. 필터를 건조시키거나 필터링이 매우 느려지게 하지 마십시오.
6. 1L 병이 가득 차면 필터 상단을 제거하고 4.2 단계에서 준비된 2L 비커에 슈퍼나탄을 붓습니다. 필터 상단을 다시 연결합니다. 볼륨을 추적합니다.
7. 모든 미디어가 처리될 때까지 원심분리 및 여과 단계를 반복합니다.
8. 수집된 여과된 수퍼나탈의 1L당 295g의 황산암모늄을 측정합니다. 교반하는 동안, 앞으로 몇 시간(~25g마다 15분마다)에 걸쳐 상체에 황산암모늄을 천천히 추가하여 원치 않는 단백질이 침전될 수 있는 황산염의 국부화된 고농도를 방지합니다.
9. 모든 암모늄 황산염이 추가되면 비커를 호일로 덮고 교반 판으로 4 °C (예 : 대형 냉장고 또는 차가운 방)로 이동하십시오. 하룻밤 저어주세요. 용액의 일정한 교반은 소금을 용해시키는 데 필요하지만, 장기간교반교는 표면/공기 인터페이스에서 용액에서 단백질의 저하로 이어질 수 있다.
10. 고정 각도 로터를 사용하여 튜브를 세척합니다.

5. 항체 정화 - 2일차

1. 2L 비커에서 상체가 함유된 암모늄-황산염을 튜브에 부어 고정 각도 로터를 넣습니다. 6500 RPM에서 6500 RPM의 고정 각도 로터로 원심분리기에서 브레이크 없이 20분 간 회전합니다.
2. 진공 청소기는 부드러울 때 펠릿을 빨아들이지 않도록 주의하여 슈퍼에 흡인합니다. 동일한 튜브 세트를 사용하여 상체가 함유된 암모늄 황산염으로부터 펠릿을 수집합니다.
3. 마지막 포부 후, 각 펠릿 (항체포함)을 ~1 ml PBS로 재보습하십시오.
4. 많은 양의 PBS에 대한 투석에 의해 침전 된 mAb 용액에서 황산 암모늄을 제거하십시오. 이를 위해 먼저 mAb 솔루션의 각 mL에 대해 약 1인치의 투석 튜브(예: Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 달튼 컷오프 셀룰로오스 투석 튜브)를 잘라냅니다. 튜브를 dH₂O. 튜브의 한쪽 끝에 매듭을 묶고 dH₂O로 채우기하여 매듭이 누출되지 않는지 확인합니다. 튜브에서 빈 dH₂O.
5. 파이펫 PBS/항체 용액을 튜브에 넣습니다. 0.25ml의 추가 로 튜브를 헹구고 튜브로 옮김합니다.
6. 주황색 투석 클립으로 가능한 한 용액에 가깝게 튜브 상단을 고정합니다.
7. 튜브 의 상단을 4L 비커의 외부 상단에 테이프. 튜브의 채워진 부분이 비커에 매달려 있도록 합니다. 비커를 PBS로 채우고 스터디 바를 추가합니다.
8. 4°C에서 ~8시간 동안 밤새 저어줍니다.
9. 비커의 PBS를 신선한 PBS로 교체하고 ~8시간 2회 더 저어줍니다.
10. 항체를 튜브에서 15ml 또는 50ml 원문 튜브로 이송합니다. 1200 RPM에서 5분 동안 원심분리기는 형성되었을 수 있는 침전을 제거합니다. 상체를 신선한 튜브로 옮기.
11. PBS (5 μl 항체 + 95 μl PBS)로 항체 1:20의 알리쿼트희석. 280 nm에서 분광계(PBS를 가진 공백)로 항체 농도를 양수합니다. 1.43의 소멸 계수(ε)를 사용하십시오. 농도는
    
    
12. 항체를 나사 캡 바이알에 알리쿼트와 -80°C에 보관합니다.