머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

Teer 분석법의 정말 독특한 점은 항원 특이적 T 세포를 직접 시각화할 수 있다는 것입니다. te, 즉 teer는 우리 분석의 가장 독특한 특징입니다. 여기에 증폭 단계가 함께 적용됩니다.

우리는 T 세포를 분리한 후, 관심 있는 T 세포 샘플을 풍부하게 만드는 환경에서 배양합니다. 그 다음에는 해당 세포들만 특이적으로 표지하고 유세포계에 시각화할 수 있습니다. 그래서 수십 년간 사용되어 온 CSFE나 증식 검사 같은 이전 검사들은 전체 T 세포 집단에서 일어나는 일종의 대량 측정을 얻는 것입니다.

하지만 몸에는 수백만 개의 T 세포가 있고, 이들은 다양한 패턴을 봅니다. 운이 좋다면, 샘플 내 세포의 2/2에서 300,000 세포 중 하나가 바로 당신이 보고 있는 세포일 것입니다. 그래서 이 분석법은 농축 단계를 수행합니다.

그리고 테스트 수치를 사용하면, 직접 염색하기 때문에 배경에서 떨어진 전체 세포 수의 1% 미만인 집단을 시각화할 수 있습니다. 그래서 아주 미세한 차이도 볼 수 있고, 그 혈액 샘플에 포함된 T세포 수를 꽤 정확히 세어볼 수 있습니다. 그 개체 안에 있는 T세포 수가 당신의 관심 패턴을 인식하고 있습니다. 하지만 여기서 끝나지 않아, 테터는 T 세포를 표지할 뿐만 아니라 분리해 추가 분석을 할 수도 있게 해줍니다.

그리고 여러분이 사용하는 테터는 실제로 BRI에서 제작된 거죠? 네. 우리는 전국에서 2급 테터를 성공적으로 달성한 극소수의 연구실 중 하나입니다. 저희는 이 시약들을 이 기술을 수입하려는 모든 실험실에 비용을 지불하여 배포할 계획입니다.

이 분석법을 다른 실험실에서 재현할 때 가장 어렵거나 도전적인 점은 무엇이라고 생각하시나요? 생각해보니, 사실 두 가지가 있어요, T 세포의 성장입니다. 정말 일종의 예술이에요.

여러분은 세포가 추가 영양분이 필요한지 아니면 성장할 공간이 더 필요한지 거의 매일 결정해야 합니다. 그리고 두 번째로, 경험이 부족한 운영자에게 아마도 가장 어려운 부분은 사실 데이터 분석입니다. 어떤 신호가 진짜 긍정적인 반응인지, 어떤 부분이 물리학과 인력에 내재된 것인지 파악하는 과정이죠.

그리고 모든 것이 어느 정도 끈적임을 가지고 있다는 사실도 많은 경험이 필요한 부분이고, 특히 전반적인 반응이 다소 약할 수 있는 맥락에서는 더욱 그렇습니다. 이 분석법으로 얻는 정보가 현재 환자들에게 어떤 도움이 될 잠재력이 있나요? 자가면역 환자에게서 가장 먼저 나타나는 특징 중 하나는 그 질병에 특이적인 항체들의 군집입니다.

면역학의 기본 원리에서 항체 반응이 있는 곳에는 항상 먼저 T세포 반응이 있다는 것을 알고 있습니다. 따라서 위험군에 있는 개인들을 살펴보고 항체 형성에 앞서 T세포 활성이 급증하는 현상을 볼 수 있다면, 이는 개인들이 자가항체를 갖는 새로운 수준의 위험을 정의하는 데 도움이 될 것입니다. 이는 개입 치료의 창을 열어줄 수 있기를 바랍니다. 이 절차는 항원 특이적 CD 4개의 양성 T 세포를 정제 및 증식하며, 테터스 시약과 장비 클래스 2 라미나 플로우 생물안전 캐비닛을 사용해 이를 시각화합니다.

이곳이 시술의 주요 작업 공간이 될 것입니다. 50밀리리터 원뿔 튜브, PBMC 절연용 1차 튜브, XPBS 1개. 이 팩은 칼슘과 마그네슘이 없는 FOL 팩에 호일로 감싸져 가벼운 드럼 피펫 보조기, CoStar 10밀 피펫 에어로졸 캔, 그리고 원심분리기 혈액 오염을 방지하기 위해 사용되는 50밀 인서트가 필요합니다.

GS 6개의 R 원심분리기 이송 피펫, 8.3그램/리터 함유의 파스퇴르 피펫 용혈 완충제. 염화암모늄 1.0그램/리터. PBS 헤모 사이토미터 15밀리리터 원뿔형 튜브 버퍼 15밀리리터 원뿔형 튜브 러닝 버퍼에 PBS 혈액 중소나트륨 0.04그램 DI 중소탄산나트륨 3.2% 0.2% 액액, 혈액 세포계 15밀리리터 원뿔형 튜브 러닝 버퍼, PBS 포함 2밀리몰라 EDTA와 리터당 5그램 보충제.

BSA 맥스 CD 4 격리 키트 2, Milin biotech EP 자석 블록, Stem cell Technologies에서 구매. 다른 자기 전지 농축 플랫폼도 동등한 효과를 사용할 수 있습니다. 5밀리리터 폴리프로필렌 튜브 RPMI 1640에 25밀리몰라 히피 튜브를 보충하여 T세포 배지를 만들고, T세포 배지를 보완하는 인체 혈청, T세포 배지를 보충하기 위한 펜 스트립, 0.22마이크론 병 상단 필터, 멸균 48웰 플레이트(시험관 내 배양용), 37도 CO2 인큐베이터, 관심 에피토프 포함 합성 펩타이드 용액 20밀리그램/밀리리터.

5밀리리터 폴리스티렌 팩스 튜브 펩타이드 주재 클래스 2 티어가 항원 특이 T 세포를 시각화하는 데 사용되었으며, 항원 특이 T 세포 코팅에 사용되는 항 CD 3, 항 CD 4, 항 CD 25 항체를 사용했습니다. 절차를 시작하기 전에 팩스로 구경 유세포계 또는 동등한 장비를 사용하세요. 작업 공간에 모든 자재와 장비를 조립하세요.

다음 시연에서는 다음 단계를 다룰 것입니다. PBMC 분리, CD 4 양성 T세포 분리, 시험관 내 증식 배양, T 세포 시각화 및 염색. 1단계: PBMC 격리.

혈액 샘플을 채취하세요. 혈액은 주사기나 혈관에 담겨 1:50 비율로 헤파린으로 항응고하여 응고를 예방해야 하며, 혈액 밀리리터당 약 100만 PBMC 수량을 기대합니다. 그 중 약 40%는 CD 4개의 양성 T 세포입니다.

혈액을 50밀리리터 원뿔 튜브에 분할 담아. 튜브당 25밀리리터의 혈액. ALI 응고 전에 혈액을 부드럽게 섞어 혈장을 분배하세요.

PBS를 추가하여 총 부피를 40밀리리터로 만들고, 피펫 보조제를 조심스럽게 제거하여 11밀리리터의 피알을 건조시켜 혈액 튜브에 삽입하고 피펫 보조제를 조심스럽게 제거합니다. 피알은 천천히 튜브 바닥으로 배수됩니다. 수치가 평형이 되면, 피펫을 천천히 혈액 튜브에서 분리하고 혈액 튜브를 덮은 후 캐니스터의 에어로졸 안으로 이동하세요.

캔스터를 단단히 닫고 원심분리기를 900 G 속도로 20분 동안 중단 없이 유지하세요. 이 회전 끝에는 절개가 가해지지 않는 것이 중요한데, 이는 회전 후 세포층을 교란시키기 때문입니다. PBMC는 위의 노란 혈장과 아래의 투명 섬유 사이에 뚜렷한 흰색 층을 형성해야 합니다.

전이용 피펫으로 백혈구층을 부드럽게 제거한 후 새 튜브로 옮기세요. 일부 혈장과 피알은 PBMC로 채취할 수 있으나, 적혈구 층은 채취하지 마세요. 일반적으로 이 단계에서 두 개의 혈관을 하나의 세포관으로 결합할 수 있습니다.

펠릿 크기를 늘리려면 PBS를 추가해 전체 부피를 15밀리리터로 만들고, 500배 G에서 15분간 저폭 상태로 원심분리기로 가열하며, 캔의 에어로졸을 이용해 페이스트 피펫으로 액체를 흡입합니다. 펠릿을 손상시키지 않도록 주의하세요. 각 튜브에 5에서 6밀리리터를 넣고 부드럽게 섞어 뭉치를 제거하여 용혈 완충제를 사용하세요. 5분 이상 잠시 부양하세요.

PBS를 추가해 총 부피를 50밀리리터로 만들고, 230배 G로 10분간 원심분리합니다. 저 브레이크에서는 에어로졸 캔이 더 이상 필요 없고, 이 느린 회전에는 더 이상 필요하지 않습니다. 최종 세척 단계 전 230 G 원심분리기로 목초지에 담긴 피펫 튜브와 원심분리기로 2회 흡입액을 세척하고, 재현탁된 세포 한 조각을 제거한 후 트리안 블루로 희석한 후 혈액세포계를 이용해 세합니다.

이 셀 수는 T-셀 분리에 사용되는 시약 부피를 결정합니다. 2단계, CD4 양성 T세포 분리, 흡입 후 주행 완충제를 추가하여 총 부피를 1,000만 세포당 40마이크로리터로 끌어올립니다. 보통 이 과정에는 30마이크로리터의 버퍼와 잔류 펠릿 부피가 필요합니다.

이 부피를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기세요. CD 4 분리 키트에서 10마이크로리터/10 마이크로리터 캡 튜브를 추가하고 얼음에 10분간 보관하세요. 얼음에서 튜브를 제거하고, 캡을 제거한 후 1,000만 세포당 30마이크로리터의 러닝 버퍼를 추가하세요.

CD 4 절연 키트에서 자석 비즈를 추가하세요. 1,000만 세포당 20마이크로리터를 캡 튜브에 넣고 얼음 위에 15분간 보관하세요. 10용량의 구동 버퍼를 추가해 세척하고 230 g 원심분리기에서 10분간 가열합니다.

스핀 중에는 작업 공간에 자석과 5밀리리터 폴리프로필렌 튜브를 설치하세요. 세포 펠릿에서 액체를 흡입하세요. 버퍼 2밀리리터를 추가하고 이송 피펫으로 뭉치를 제거하세요.

동일한 전이용 피펫을 사용해 5밀리리터 튜브에 옮겨 자석에서 15분간 인큐베이션합니다. CD 4의 양성 T셀 분획을 자석을 뒤집어 표시된 15밀 튜브에 조심스럽게 디캔트하여 마지막 방울만 남기고 모두 비워버립니다. 5밀리리터 튜브에 2밀리리터 더 버퍼를 추가한 후 자석에서 분리하세요.

CD 4개의 음성 세포를 튜브 옆면에서 부드럽게 헹구고 표시된 15밀 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 2밀리리터의 T-셀 배지를 추가하세요. 세포 세기를 위해 알리쿼트를 제거하고 230 곱 G에서 10분간 원심분리합니다.

혈액 세포계를 이용해 트리안 블루와 희석 세포 분할 비율을 측정하세요. 이 세포 수는 확장 배양에 사용되는 웰 수를 결정합니다. 3단계.

시험관 내 확장 배양은 세포 수에 따라 CD 4의 양성 세포 펠릿과 4명의 음성 세포 펠릿에서 흡인액을 추출합니다. CD에 양성 셀 4개를 추가해 볼륨을 밀당 300만 셀로 조정하세요. CD에 네 개의 음수 셀을 추가하여 볼륨을 밀당 1,000만 셀로 조정하세요.

확장 배양에는 웰당 300만 개의 CD와 4개의 음성 세포, 200만에서 300만 개의 CD, 4개의 양성 세포가 필요합니다. 일반적으로 CD 4 양성 세포가 제한 개체군입니다. 48웰 플레이트 위에 적절한 수의 웰에 네 개의 음수 셀을 분할 배치합니다.

각 인큐베이터에 300마이크로리터를 추가하여 37도 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 플레이트와 인큐베이터를 제거하고, 500마이크로리터의 신선한 배지를 추가한 후 트랜스퍼 피펫으로 12에서 20번 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 모든 액체를 제거하세요. 이 세척은 부착 항원 제시 세포층을 남깁니다.

세척이 끝나면, 각 매체 바닥을 적실 만큼만 적실 만큼, 대략 100마이크로리터 정도 넣으세요. 그렇지 않으면 A 부착 세포가 건조해집니다. 필요하다면 각 우물에 200만에서 300만 개의 CD, 양성 세포 4개를 추가하세요.

각 웰의 총 부피를 1밀리리터까지 늘리기 위해 추가 매체를 추가하세요. 각 각각에 원하는 펩타이드를 첨가하세요. 잘. 자극의 일반적인 농도는 10 마이크로그램/밀리리터입니다.

최종 식탁 접시는 37도 인큐베이터에 7일간 보관했습니다. 7일 후에. 다음 날마다 각 웰에 각각 2회씩 50마이크로리터의 헤모 IL을 추가하세요.

아직 융합되지 않은 현미경 공급 웰을 이용해 세포 성장을 모니터링하는데, 배지의 절반을 제거하고 신선한 배지와 IL 50마이크로리터를 추가하여 세포를 부유시키고 세포의 절반을 빈 웰로 옮겨 두 개의 합류관을 분리합니다. 신선한 배지와 IL 50마이크로리터를 추가하여 두 개의 리턴 셀을 인큐베이터에 넣습니다. 확장되는 세포는 13일에서 15일 배양 후 티어 염색 준비가 됩니다.

네 번째 단계, 티어 염색을 통해 T세포를 시각화하고, 펩타이드와 일치하도록 테터를 구매하거나 조립하세요. CD 4개의 양성 T 세포를 자극하는 데 사용된 MHC 조합. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하세요.

각 매체의 절반을 신중하게 빼내세요. 각 웰에서 약 75마이크로리터 또는 약 50,000개의 세포를 5밀리리터 폴스티렌 팩스 튜브에 이송하고, 총 부피 50마이크로리터당 보통 1마이크로리터를 추가한 후 37도 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 또한 각 웰의 두 번째 알리코트를 불일치 티어로 음성 대조 표지 세포로 염색하여 항 CD 3, 항 CD 4, 항 CD 25를 사용하는 것이 권장됩니다.

추가적이거나 대체적인 항체 표지자를 사용할 수 있습니다. 단, PE 표지된 항체는 현재 teem을 위해 예약되어야 하므로 사용하지 마십시오. 또한, 단일 색상이나 아이소타입 컨트롤은 추가 셀로 표시하세요.

항체 표지된 세포를 4도에서 15분에서 30분 동안 인큐베이팅합니다. 각 튜브를 0.5에서 1밀리리터 정도의 버퍼로 세척하고, 원심분리기를 230배 G로 10분간 세척하세요. 팩스 튜브에서 액체를 조심스럽게 디캔트하고, 기준 비드, 단색 제어 튜브, 아이소타입 제어 등을 사용하여 플로우 사이토미터를 보정합니다.

유동 세포계를 사용해 각 튜브를 분석하세요. 테트라 양성 세포는 확장된 CD 4개의 양성 T 세포 중에서 별도의 집단이어야 합니다. 테트라 양성 세포는 보통 CD 25 양성이며 종종 CD4 고I입니다.