Name: 머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: 학습하세요 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정제 및 체외 확장 방법과 MHC 클래스 II 테트라머를 이용한 시각화 기술을. 이 방법은 면역학 연구에서 T 세포 반응을 정밀하게 분석하는 데 활용됩니다.

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우리는 촬영 및 비디오 제작에서 중요한 역할 딕 폴리와 레이 킴볼 감사드립니다.

1. 주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC) 절연 <ol><li> 혈액 샘플을 구합니다 - 피를 주사기 혹은 혈액 튜브의 수집과 염증을 방지하기 위해 헤파린 (1시 50분 비율)과 함께 안티 coagulated해야합니다. 약 1 × 혈액 ML 당 10 6 PBMC의 수율을 기대 - CD4 양성 (CD4 +) T 세포 될 약 40 % 중. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브, 튜브 당 25 ML로 나누어지는 혈액을. 혈액이 분리된 경우, 부드럽게 플라즈마를 배포하기 전에 aliquoting 믹스 </li><li> , 40 ML과 Ficoll 11 ML을 그림으로써 밑받침으로 전체 볼륨을 가져 혈액 튜브에 삽입하고, 조심스럽게 피펫에서 pipet 보조를 제거, PBS를 추가합니다. ficoll 천천히 튜브의 바닥에 배수됩니다. 수준이 같도록되면 서서히 혈액 튜브에서 피펫을 제거하고 폐기. </li><li> 혈액 튜브를 모자 Aerosolve 용기로 이동합니다. 노 브레이크 - 단단히 900의 용기와 원심 × g 20 분 동안을 닫습니다. 그것은 제동 힘은 세포의 레이어를 방해하므로 아무런 제동이 스핀의 끝에 적용되지 않습니다 것이 중요합니다. </li><li> 스핀 후 PBMCs는 노란색 플라즈마 (위)와 투명 ficoll (아래) 사이에는 뚜렷한 흰색 레이어를 형성한다. 부드럽게 전송 피펫과 새로운 튜브로 전송을 사용하여 백혈구 층을 우유. 일부 플라즈마와 Ficoll이 PBMCs와 그립지만, 붉은 세포 계층의를 그리기 피할 수 있습니다. 일반적으로 2 혈액 튜브는 펠렛의 크기를 증가하려면이 단계에서 한 셀 관에 조합하여 사용할 수 있습니다. </li><li> aerosolve 용기에 낮은 브레이크 - 500 50 ML하고 원심 분리기로 전체 볼륨을 데리고 PBS, × 15 분 동안 g을 추가합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않도록 돌봐, 파스퇴르 피펫을 사용하여 액체를 기음 </li><li> 각각의 튜브에 5-6 ML를 추가하고 부드럽게 대단히 짧은 시간을 제거하는 혼합에 의해 용혈성 버퍼 처리합니다. 더 이상 5 분 이상의 알을 품다. </li><li> 10 분 230 50 ML하고 원심 분리기로 전체 볼륨을 데리고 PBS, × g 추가 - 낮은 브레이크. Aerosolve 용기 이러한 느린 놀이를 위해 더 이상 필요하지 않은 있습니다. </li><li> 두 번 씻으 : 대기음 액체 파스퇴르 피펫을 사용하여 10 분 동안 230 × g에서 PBS와 원심 분리기와 튜브를 입력합니다. </li><li> 전에 최종 세척 단계로, 다시 정지 세포 나누어지는를 제거 trypan과 청색의 희석과 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. 이 셀 개수는 T 세포 분리 단계에서 사용되는 시약 볼륨을 지시합니다. </li></ol> 2. CD4 + T 세포 분리 * <ol><li> 액체를 기음과 10000000 세포 40 UL에 전체 볼륨을 가지고 실행 버퍼를 추가합니다. 보통이 30 버퍼 UL 플러스 잔여 펠렛 볼륨이 필요합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관이 볼륨을 전송합니다. </li><li> 10 분 얼음 10,000,000 세포 당 10 UL, 캡 튜브, 장소 - CD4 격리 키트에서 항체 칵테일 추가 </li><li> , 얼음 튜브를 제거 뚜껑을 제거하고, 10,000,000 세포마다 버퍼를 실행하는 30 UL을 추가 </li><li> CD4 격리 키트에서 자기 구슬을 추가 - 20 10000000 세포 당 UL, 캡 튜브, 그리고 15 분 동안 얼음에 장소 </li><li> 10 분 230 × g에서 세척하고 원심 분리기로의 버퍼를 실행 십 볼륨을 추가합니다. </li><li> 스핀 동안, 당신의 작업 공간에있는 자석 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브를 설정 </li><li> , 세포 펠렛에서 액체를 대기음이 ML 실행 버퍼를 추가하고 전송 피펫을 사용하여 대단히 짧은 시간을 제거 </li><li> 동일한 전송 피펫을 사용하여 15 분 자석에 5 ML 튜브 및 부화에 세포를 전송 </li><li> 조심스럽게 반전 자석에 의해 표시 15 ML 튜브에 + 세포 분율을 CD4을 가만히 따르다 모든하지만 마지막 한 방울까지 비우기 </li><li> 5 ML 튜브에 버퍼를 실행하는 또 다른이 ML을 추가하고 자석에서 제거 </li><li> 부드럽게 튜브의 측면과 표시 15 ML 튜브로 전송 해제 CD4 - 세포를 씻어 </li><li> 각 튜브 2 ML T 세포 매체를 추가, 10 분 동안 230 × g에서 셀 카운팅 및 원심 분리기에 대한 aliquots를 제거합니다. </li><li> trypan과 청색의 세포 aliquots을 희석하고 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. 이러한 세포 카운트는 확장 문화 단계에 사용되는 우물의 수를 지시합니다. </li></ol> 2.11 - * 또는 Mac에서 열 및 구슬 (Miltenyi Biotec), AutoMACS 세포 분리기 (Miltenyi Biotec) 또는 Robosep 전지 세퍼레이터 (줄기 세포 기술) 단계 2.2 대신에 지시를 생산에 따라 사용할 수 있습니다. 3. 체외 확장 문화 <ol><li> CD4에서 액체를 기음 + 및 셀 카운트에 따라 CD4 세포의 산탄하고, 문화 미디어 (일반적으로 3,000,000 CD4 + ML 당 세포 10000000 ML 당 CD4 - 세포가 문화를 설정하는 잘 동작)을 추가합니다. 확장 문화 3-5000000 CD4 - 세포마다 잘과 2-3000000 CD4 + 48 자 문화 플레이트 1 ML 문화 미디어의 총 볼륨에 잘 따라 세포를 필요로합니다. 일반적으로 CD4 + 세포는 제한 인구 아르 </li><li> 원하는 경우, CD4 - 세포 (5,000 래드 비추다 S). 각각 300-500 μL를 추가하여 48 잘 접시에 우물의 해당 번호로 나누어지는의 CD4 세포. 1 시간 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. CD4 세포 자기편은 확장 문화에 항원 제시 세포로 될 것입니다. </li><li> 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 신선한 미디어 500 UL을 추가하고 부드럽게 12-20 시간을 아래 pipetting하고 전송 pipet을 사용하여 액체를 모두 제거하여 우물을 씻으십시오. 이 세차 자기편 항원 제시 세포의 레이어 뒤에 떠날 것입니다. </li><li> 세탁이 완료되면, 각 우물의 바닥 (약 100 UL)에 서부 유럽 표준시에 충분 미디어를 추가합니다 - 그렇지 않으면 자기편 세포 밖으로 건조합니다 </li><li> 각 잘하는 2-3000000 CD4 + 세포를 추가합니다. 필요한 경우 각 물론 최대 1 ML의 전체 볼륨을 가지고 추가 미디어를 추가할 수 있습니다. </li><li> 각 잘하기 원하는 펩타이드를 추가합니다. 자극에 대한 전형적인 농도는 10 UG / ML 최종 수 있습니다. </li><li> 7 일 동안 37 ° C 배양기에 넣어 판. </li><li> 칠일 후에 Hemogen 50 UL을 추가 IL - 2 (또는 재조합 IL - 2, 10 IU / ML으로 이에 상응하는 금액) 각각 잘 수 있습니다. </li><li> 이후의 각 날, 현미경을 사용하여 세포 성장을 모니터링합니다. 신선한 미디어와 IL - 2의 50 UL을 추가, 아직 미디어의 절반을 제거하여 합류하지 우물 피드. , 세포를 resuspending 빈 잘하는 세포의 절반을 이동, 신선한 미디어와 IL - 2의 50 UL 추가하여 합류 우물을 분할. 인큐베이터로 세포를 반환합니다. </li><li> 확대 세포는 문화의 13-15일 후 tetramer 준비가 완료됩니다. </li></ol> 4. tetramer의 얼룩에 의해 T 세포를 떠올리 <ol><li> 구입하거나 자극 CD4 + T 세포를 (tetramer 시약의 출처에 대한 논의를 참조)과 일치하는 펩타이드 / MHC 조합에 맞게 tetramers 조립. Tetramers는 ~ 0.5 MG / ML 솔루션해야합니다. </li><li> 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다 </li><li> 조심스럽게 각 우물에서 미디어의 절반을하다 </li><li> 5 ML의 폴리스티렌 외과 튜브로 - 일반적으로 75 μL 또는 약 50,000 세포 - 각 우물에서 세포의 나누어지는를 전송 </li><li> 50 μL 총 부피 당 일반적으로 1 μL - - 및 37 자리 1~2시간에 대한 ° C 배양기 tetramer를 추가합니다. 대조군으로 일치하지 않는 tetramer 각 우물에서 세포의 두 번째 나누어지는를 얼룩 또한 것이 좋습니다입니다. </li><li> 각 항체의 3-10 μL를 추가하여 안티 - 인 경우에는 3 번 CD, 안티 - CD4, 및 안티 CD25 항체와 레이블 셀. 추가 또는 대체 항체 마커를 사용할 수 있습니다. 이 채널은 tetramers을 위해 예약되어 있어야합니다 때문에 그러나, PE 라벨이 항체를 사용하지 마십시오. 추가 전지를 사용하는이 시점에서, 또한 라벨 단일 색상이나 isotype 제어합니다. </li><li> 얼음이나 4 15~30분에 대한 품어 항체 라벨 세포 ° C. </li><li> 0.5-2 ML 10 분 동안 230 × g에서 버퍼와 원심 분리기를 실행하는 각 튜브를 씻으십시오. </li><li> 외과 튜브에서 조심스럽게 가만히 따르다 액체. 이후 외과 분석을위한 대상 컨테이너 (선호 얼음) 모든 튜브를 저장합니다. </li></ol> 5. 흐름 Cytometer 수집 및 분석 <ol><li> 참조 비즈를 사용하여 흐름 Cytometer를 보정합니다. </li><li> 악기 설정을 확인합니다 : <ol><li> 흠없는 제어 셀 또는 isotype 컨트롤을 사용하여 가능한 림프구 게이트 (FSC 대 SSC)의 위치를​​ 조정합니다. 각 축의 첫 번째 decade 아래의 인구 (게인 설정을 변경하여)을 중심으로하여 모든 채널에서 자동 형광을 제거합니다. </li><li> 단일 색상 제어 튜브, 각 단일 색상에 대한 올바른 quadrants 내에 센터 이벤트 (보정 설정을 변경하여)를 사용. </li><li> 없는 tetramer 물들일 튜브를 사용하여 악기 설정의 미세한 조절을 마십시오. tetramers 자주 항체 컨트롤보다 밝은 얼룩 때문에 PE 채널에 대한 특정 설정에서 조정이 필요할 수 있습니다. 없는 tetramer는 CD4의 &lt;0.5 % + 세포를 얼룩해야합니다. </li></ol></li><li> 각각의 튜브에 대한 데이터를 수집 <ol><li> 각 샘플 튜브와 대조군 튜브에 대한 이벤트를 수집 </li><li> analysys 최소한 20000 이벤트를 수집 및 저장 </li></ol></li><li> 데이터 분석 <ol><li> 가져오기 데이터 파일 외과 분석 소프트웨어 (예 : CellQuest 소프트웨어, WinMDI 또는 FlowJo)로. 없는 tetramer를 사용하여 튜브 스테인드를 사용하여 분석을 시작합니다. </li><li> 플롯 FSC 대 SSC하고 라이브 lymphocytes (그림 1, 왼쪽 상단 패널) 주위에 게이트를 그립니다. </li><li> 플롯 CD4 대 인 경우에는 3 번 CD에 들어 있고 인 경우에는 3 번 CD +와 CD4 주변 성문을 그릴 (오직 lymphocytes을 보여 게이 티드) + 인구 (그림 1 오른쪽 상단 패널). </li><li> 플롯 CD4 대 Tetramer (단 인 경우에는 3 번 CD +의 lymphocytes을 보여주 게이 티드) 및 사분면의 경계를 설정할 수 있도록 CD4 + Tetramer + 인구는 0.5 % 이하 (그림 1 왼쪽 아래 패널)입니다. </li><li> 플롯 CD25 대 Tetramer 및 CD25 + Tetramer + 인구는 0.5 % 이하 (그림 1 오른쪽 하단 패널)가되도록 사분면의 경계를 설정 (CD4 + lymphocytes만을 보여주 게이 티드). </li><li> 성문을 변경하지 않고 샘플 튜브를 모두 분석할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>1167/JOVE %의 20FIGURE의 % 201.png "고도 ="그림 1 "너비 ="600 "높이 ="342 "/&gt; 그림 1. 대표 대조군의 tetramer의 얼룩 결과. 왼쪽 상단 패널은 앞으로 스캐터 구절 사이드 분산 및 림프구 크기 게이트 (R1)을 보여줍니다. 오른쪽 상단 패널은 R1에 대한 문이 있으며, 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 있고 인 경우에는 3 번 CD + (R2)와 CD4 + (R3) 게이츠 대 개미 - CD4를 보여줍니다. 왼쪽 하단 패널은 R2에 대한 문이 있으며, tetramer 대 안티 CD4를 보여줍니다. 오른쪽 아래 패널 R3에 대한 문이하고 안티 CD25 대 tetramer를 보여줍니다. 두 tetramer의 플롯에 대한 quadrants은 0.5 %로 설정했다. 6. 대표 결과 <ol><li> tetramer 긍정적인 세포는 CD4 + 세포를 확장합니다 (그림 2) 사이에 뚜렷한 인구해야합니다. </li><li> Tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 CD25 아르 +와 CD4 종종 높은. </li><li> 어떤 경우에는 MHC / 펩타이드 결합 배경 얼룩을 (종종 가난한 용해도와 펩타이드에 의한) 제공할 수 있습니다. "거짓 긍정적인"세포 Tetramer 또는 CD25 대 Tetramer의 플롯 (그림 3) 대 CD4 중 하나에 하나의 뚜렷한 인구하지 않기 때문에 이러한 배경 얼룩은 진정한 긍정에서 차별화된 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362"> 그림 2. 대표 긍정적인 tetramer의 얼룩 결과. 패널 레이아웃 및 게이팅 전략 1 그림과 동일합니다. tetramer 긍정적인 세포가 백신 CD25 대 tetramer 패널에 tetramer 패널과 별개의 CD25 + 인구 대 안티 - CD4에 뚜렷한 CD4 높은 인구로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="그림 3" width="600" height="336"> 그림 3. 대표 "거짓 긍정"tetramer의 얼룩 결과. 패널 레이아웃 및 게이팅 전략 1 그림과 동일합니다. tetramer 패널 대 안티 CD4는 뚜렷하지 "mounded"얼룩을 보여줍니다. 안티 CD25 대 tetramer 또한 CD25 +되는 방향으로 알 수없는 추세 "mounded"얼룩을 보여줍니다.

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

면역의 CD4의 역할 + T 세포를 이해하는 것이 근본적으로 중요하다. 그러나, 특정 항원 CD4 + T 세포가 감지하고 전통적인 방법을 사용하여 분리하기가 어려울 수 있습니다. 대조적으로, MHC 클래스 II의 tetramers 원하는 항원 특이성과 CD4 + T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다. 이 동영상은 고립, 정화하고, CD4 + T 세포와 tetramers를 사용하여 후속 시각화의 체외 증폭에을 보여줍니다. 클래스 II의 Tetramers은 가용성 biotinylated 클래스 II α / 형광 표시 streptavidin 코어 (그림 4) 주변에 복합 β dimers 구성된 형광 단백질 conjugates 있습니다. 이 동영상에 사용되는 tetramers은 곤충 세포 배양 (1)를 사용하여 Benaroya 연구소에서 Teramer 코어 연구소에 의해 생산되었다. 이러한 tetramers는 0.5 MG / ML 솔루션으로 준비하고 6-18개월 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 동결 - 해동의 스트레스가 stept...

<table><tbody><tr><td>2등급 층류 생물안전작업대</td><td>장비</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>50 mL 원추형 튜브</td><td>장비</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>1X PBS (Ca/Mg free)</td><td>시약</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>차광을 위해 알루미늄 호일로 감쌈</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP</td><td>장비</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>10 mL 피펫</td><td>장비</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>Aerosolve 캐니스터</td><td>장비</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>50 mL 인서트 포함</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>장비</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>전송 피펫</td><td>장비</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>장비</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>용혈 버퍼</td><td>시약</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>PBS 내 0.2%</td></tr><tr><td>혈구계수기</td><td>장비</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 튜브</td><td>장비</td><td>VWR international</td><td>05-527-90</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>런닝 버퍼</td><td>시약</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td></tr><tr><td>MACS CD4+ T 세포 분리 키트 II</td><td>시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>EasySep&amp;#174; 자석</td><td>장비</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 폴리프로필렌 튜브</td><td>장비</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>25 mM HEPES 포함</td></tr><tr><td>혼합 인체 혈청</td><td>시약</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>건강한 기증자로부터 채취, 열 불활성화 및 여과됨</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>500mL 0.22 micron 병 상단 필터</td><td>장비</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>48-웰 플레이트</td><td>장비</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 배양기</td><td>장비</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>20 mg/mL 합성 펩타이드</td><td>시약</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>임의의 펩타이드 공급업체에서 맞춤 합성</td></tr><tr><td>5 mL FACS 튜브</td><td>장비</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>폴리스티렌</td></tr><tr><td>펩타이드 로딩 class II 테트라머 (설명된 바와 같음)</td><td>시약</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>BRI 테트라머 코어에서 준비함</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>시약</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>Anti-CD25</td><td>시약</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>Facs Calibur 유세포 분석기</td><td>장비</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>또는 동등 제품</td></tr></tbody></table>

머릿속 항원 특정 cd4 + mhc 클래스 ii tetramers를 사용하여 t 세포

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

주요 histocompatibility 복합 (MHC) 클래스 II의 tetramers은 항원 특정 CD4의 직접적인 시각화 + 유동세포계측법에 의해 T 세포 수 있습니다. 이 방법은 펩타이드로드 MHC와 해당 T - 세포 수용체 사이의 매우 구체적인 상호 작용에 의존합니다. 하나 MHC / 펩티드 분자의 친화력이 낮은 반면, 교차 연결 streptavidin과 MHC / 펩타이드 단지하면 ​​시약을 얼룩로서 사용할 수 있도록, 상호 작용의 욕망을 증가시킵니다. 때문에 CD4 + T 세포 (단일 특이성을위한 300,000의 ~ 1)의 상대적으로 낮은 주파수의 분석은 검출 자사의 한계를 높이기 위해 체외 증폭 단계에서을 활용합니다. Mononuclear 전지는 Ficoll의 밑받침에 의해 말초 혈액 정화됩니다. CD4 + 세포는 다음 biotinylated 항체 칵테일 및 안티 - 비오틴 분류 자​​석 구슬을 사용하여 부정적인 선택으로 구분됩니다. 항원은 세포, CD4 + T 세포가 antigenic의 펩타이드와 IL - 2를 추가하여 미디어 확장된다 제시로 CD4 세포 분획에서 자기편 세포를 사용합니다. 확대 세포 한 시간 동안 37 C의 잠복기와 이후 스테인드 같은 안티 - CD4, 안티 인 경우에는 3 번 CD, 및 안티 CD25와 같은 표면 항체를 사용하여 해당 클래스 II tetramer 물들일 수 있습니다. 라벨 후, 세포를 직접 유동세포계측법으로 분석하실 수 있습니다. tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 확장된 CD4 + 세포들 사이에 뚜렷한 인구를 형성합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 CD25 아르 +와 CD4 종종 높은. 배경 tetramer의 얼룩의 수준이 다를 수 있기 때문에, 긍정적인 얼룩 결과는 항상없는 tetramer와 같은 세포의 얼룩에 비해해야합니다. 이 기본 분석의 여러 변형이 가능합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 더욱 phenotypic 분석, ELISPOT 또는 확산 assays에 포함 또는 기타 보조 assays에 대한 정렬 수 있습니다. 몇몇 그룹은 또한 tetramers 및 안티 시토킨 또는 방지 FoxP3 항체 중 하나를 사용하여 공동 얼룩을 증명하고있다.

이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II 테트라머를 사용하면 유세포 분석법을 통해 항원 특이적 CD4+ T 세포를 직접 시각화할 수 있습니다. 이 방법은...

Teer 분석의 정말 독특한 점은 항원 특이적 T 세포를 직접 시각화할 수 있다는 것입니다. Teer은 우리 분석법의 핵심적인 독특한 측면이며, 이는 우리가 수행하는 증폭 단계와 결합되어 있습니다.보시는 바와 같이, T 세포를 분리한 다음 우리가 관심 있는 T 세포가 샘플 내에서 농축될 수 있는 환경에서 배양합니다. 그러면 특정 세포들만 선택적으로 표지하여 유세포 분석기로 시각화할 수 있습니다. 수십 년 동안 사용되어 온 CFSE나 증식 분석과 같은 기존의 분석법으로는 전체 T 세포 집단에서 일어나는 현상에 대한 전반적인 벌크 측정값만 얻을 수 있었습니다.하지만 신체 내에는 수백만 개의 T 세포가 있으며, 이들은 매우 다양하고 광범위한 패턴을 인식합니다. 운이 좋다면 샘플 내 세포 중 200,000개에서 300,000개당 하나 정도가 찾고 있는 세포일 것입니다. 그렇기 때문에 이 분석법에서는 농축 단계를 수행하는 것입니다.그런 다음 테스트 번호를 통해, 직접 염색을 수행하므로 전체 세포 수의 1% 미만인 집단도 배경 신호와 구분하여 실제로 시각화할 수 있습니다. 따라서 매우 작은 차이까지 확인할 수 있으며, 해당 혈액 샘플 내에서, 즉 관심 패턴을 인식하는 해당 개인의 T 세포 수를 상당히 정밀하게 측정할 수 있습니다. 하지만 여기서 끝이 아닙니다. tetramer를 사용하면 이러한 T cells를 라벨링할 수 있을 뿐만 아니라, 추가 분석을 위해 이들을 분리할 수도 있습니다.그리고 사용하시는 teter는 실제로 이곳 BRI에서 제작하신 것이 맞습니까? 네. 저희는 클래스 2 teter를 성공적으로 제작한 국내의 극소수 실험실 중 하나입니다. 저희의 의도는 이 기술을 도입하고자 하는 모든 실험실에 이러한 시약을 원가에 제공하는 것입니다.다른 실험실에서 이 분석법을 재현할 때 가장 어렵거나 까다로운 점은 무엇이라고 생각하십니까? 음, 생각해보니 두 가지가 있는데, 바로 T 세포의 배양입니다. 이것은 정말로 어느 정도의 숙련된 기술이 필요한 작업입니다.여러분은 세포에 추가 영양분이 필요한지 또는 성장을 위한 추가 공간이 필요한지에 대해 거의 매일 결정을 내려야 합니다. 그리고 제가 생각하기에 초보 운영자에게 가장 어려운 두 번째 부분은 실제 데이터 분석입니다. 신호의 어느 부분이 정말 긍정적인 반응인지, 아니면 단순히 물리적 특성과 인력에 의한 것인지를 파악하는 과정입니다.또한 모든 것에 어느 정도의 점착성이 있다는 사실은 다시 한번 많은 경험을 필요로 하는 부분이며, 특히 전반적인 반응이 다소 약하게 나타나는 상황에서 더욱 그러합니다. 이 분석법으로 생성한 정보가 현재 시점에서 환자들에게 어떤 잠재적 이점을 줄 수 있을까요? 모든 자가면역 질환 환자에게서 나타나는 첫 번째 특징 중 하나는 해당 질병에 특이적인 항체들의 집합체라고 할 수 있습니다.면역학의 기본 원리에 따르면 항체 반응이 일어나는 곳에는 항상 T세포 반응이 먼저 일어납니다. 따라서 고위험군 개인을 관찰하여 항체 형성보다 앞서 발생하는 T세포 활성도의 급증을 확인할 수 있다면, 이는 해당 개인이 자가항체를 형성하게 될 새로운 위험 수준을 정의하는 데 도움이 될 것이며, 결과적으로 중재 치료의 기회를 제공할 수 있을 것입니다. 본 절차에서는 항원 특이적 CD4 양성 T세포를 정제 및 확장하고, teters 시약과 장비 및 2급 층류 생물안전 작업대(class two laminar flow biosafety cabinets)를 사용하여 이를 시각화합니다.이곳이 실험 절차의 기본 작업 공간이 될 것입니다. PBMC 분리를 위한 50 milliliter 원추형 튜브, primary tube, 그리고 XPBS가 필요합니다. XPBS는 칼슘과 마그네슘이 없어야 하며, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감싼 fol pack plus가 필요합니다. drummed pipette aid, CoStar 10 mil pipette, 그리고 원심분리기 내의 혈액 오염을 방지하는 데 사용되는 50 mil 인서트가 포함된 에어로졸 캐니스터를 준비하십시오.GS six R 원심분리용 트랜스퍼 피펫, 파스퇴르 피펫, 8.3 g/L의 염화암모늄, 1.0 g/L의 탄산수소나트륨, 0.04 g/L의 DI sodium EDTA를 포함하는 용혈 버퍼, PBS 내의 0.2% 트라이판 블루 용액, hemo CYTOMETER, 15 mL 원뿔형 튜브, 2 mM EDTA와 5 g/L를 첨가한 PBS를 포함하는 러닝 버퍼.Milin biotech에서 구매한 BSA max CD four isolation kit two, stem cell technologies에서 구매한 EP magnet block. 다른 자기 세포 농축 플랫폼도 동일한 효율로 사용할 수 있습니다. 5 mL 폴리프로필렌 튜브, T세포 배지 제조를 위해 25 mM HEPES가 첨가된 RPMI 1640, T세포 배지 보충용 혼합 인간 혈청, T세포 배지 보충용 pen strip, 500 mL 0.22 µm bottle top filter, in vitro 증식 배양을 위한 멸균 48-well plate, 37 °C CO2 인큐베이터, 관심 에피토프를 포함하는 합성 펩타이드의 20 mg/mL 용액.항원 특이적 T 세포를 시각화하기 위해 펩타이드가 로딩된 2클래스 TEER용 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브를 사용하였습니다. 항원 특이적 T 세포의 코팅에는 anti-CD3, anti-CD4 및 anti-CD25 항체를 사용하였습니다. 절차를 시작하기 전 FACS Caliber 유세포 분석기 또는 그와 동등한 장비를 준비하십시오. 작업 공간에 모든 재료와 장비를 배치하십시오.다음 시연에서는 다음 단계들을 다룹니다. PBMC 분리, CD4 양성 T 세포 분리, 인비트로(in vitro) 확장 배양, 그리고 TEM 또는 염색을 통한 T 세포 시각화입니다. 1단계: PBMC 분리.혈액 샘플을 준비합니다. 혈액은 주사기나 혈액 채취관에 수집해야 하며, 혈액 응고를 방지하기 위해 헤파린을 1:50 비율로 첨가하여 항응고 처리합니다. 혈액 1mL당 약 100만 개의 PBMC가 얻어질 것으로 예상되며, 그 중 약 40%는 CD4 양성 T 세포일 것입니다.혈액을 50 mL 원뿔형 튜브에 분주합니다. 튜브당 25 mL의 혈액을 넣습니다. 혈장 성분이 고르게 분포되도록 ALI 응고 전 혈액을 부드럽게 혼합합니다.PBS를 추가하여 총 부피를 40 milliliters로 맞추고, 11 milliliters의 fial을 혈액 튜브에 삽입한 후 피펫 에이드를 피펫에서 조심스럽게 제거하여 하단에 배치합니다. fial의 내용물이 튜브 바닥으로 천천히 배출될 것입니다. 수위가 일정해지면 혈액 튜브에서 피펫을 천천히 제거하고, 혈액 튜브의 캡을 닫아 폐기한 후 에어로졸 캐니스터로 옮깁니다.캐니스터를 단단히 닫고 브레이크 없이 900 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 종료 시 브레이크를 사용하면 제동력으로 인해 원심분리 후의 세포층이 흐트러질 수 있으므로 브레이크를 적용하지 않는 것이 매우 중요합니다. PBMC는 상단의 노란색 혈장과 하단의 투명한 층 사이에 뚜렷한 흰색 층을 형성해야 합니다.전이 피펫을 사용하여 백혈구 층을 조심스럽게 걷어내어 새 튜브로 옮깁니다. PBMC와 함께 일부 혈장과 피브린이 흡입될 수 있으나, 적혈구 층이 흡입되지 않도록 주의하십시오. 일반적으로 이 단계에서 두 개의 혈액 튜브를 하나의 세포 튜브로 합칠 수 있습니다.펠릿 크기를 키우기 위해, 총 부피가 15 milliliters가 되도록 PBS를 추가하고 low break 및 aerosol 캔니스터 설정으로 500 times G에서 15분 동안 원심분리합니다. 페이스트 피펫을 사용하여 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 액체를 흡입하여 제거합니다. 각 튜브에 용혈 버퍼를 5~6 milliliters 추가하고 가볍게 섞어 덩어리를 제거하여 처리합니다. 5분 이내로 인큐베이션합니다.PBS를 추가하여 총 부피를 50 milliliters로 맞추고 230 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 저속 브레이크 설정 시, 이러한 저속 회전 단계에서는 더 이상 에어로졸 캔니스터가 필요하지 않습니다. PBS로 채운 튜브를 사용하여 파스퇴르 피펫으로 액체를 흡입하여 두 번 세척하고, 최종 세척 단계 전 230 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 재부유된 세포의 일부를 취해 트라이판 블루로 희석한 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.이 세포 수는 T 세포 분리에 사용될 시약 부피를 결정합니다. 두 번째 단계인 CD4 양성 T 세포 분리에서는, 액체를 흡입하고 런닝 버퍼를 추가하여 10 million cells당 총 부피가 40 µL가 되도록 맞춥니다. 일반적으로 이는 30 µL의 버퍼와 잔류 펠릿 부피를 합쳐 조절합니다.이 부피의 용액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. CD4 분리 키트의 항체 칵테일을 세포 10 million 개당 10 µL씩 튜브에 추가하고 10분 동안 얼음에 보관합니다. 튜브를 얼음에서 꺼내 캡을 열고, 세포 10 million 개당 30 µL의 러닝 버퍼를 추가합니다.CD4 분리 키트의 자기 비드를 추가합니다. 세포 1,000만 개당 20 µL를 넣고 튜브 캡을 닫은 후 얼음 위에서 15분 동안 둡니다. 세척을 위해 런닝 버퍼를 10배 부피로 추가하고 230 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.원심 분리 중에 자석과 5 mL 폴리프로필렌 튜브를 작업 공간에 준비합니다. 세포 펠렛에서 액체를 흡입하여 제거합니다. 2 mL의 러닝 버퍼를 추가하고 트랜스퍼 피펫을 사용하여 덩어리를 제거합니다.동일한 전이 피펫을 사용하여 세포를 5 mL 튜브로 옮기고 자석에서 15분 동안 배양합니다. 자석을 뒤집어 마지막 한 방울을 제외한 모든 액체를 비워냄으로써 CD4 양성 T세포 분획을 표시된 15 mL 튜브에 조심스럽게 따라냅니다. 5 mL 튜브에 러닝 버퍼 2 mL를 추가로 넣고 자석에서 제거합니다.튜브 벽면에 붙은 CD4 음성 세포를 부드럽게 헹구어 표시된 15 mL 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 T 세포 배지 2 mL를 첨가합니다. 세포 수 측정을 위해 일부 분주액을 취한 후, 230 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.세포 분주액을 트라이판 블루로 희석하고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 이 세포 수 측정값에 따라 확장 배양에 사용할 웰의 수가 결정됩니다. 3단계입니다.in vitro 확장을 위해, 세포 수를 기준으로 CD4 양성 및 CD4 음성 세포 펠릿에서 흡입액을 제거합니다. CD4 양성 세포에 배지를 추가하여 부피를 1mL당 300만 세포로 조정합니다. CD4 음성 세포에 배지를 추가하여 부피를 1mL당 1,000만 세포로 조정합니다.확장 배양에는 웰당 300만 개의 CD4 음성 세포와 200만에서 300만 개의 CD4 양성 세포가 필요합니다. 일반적으로 CD4 양성 세포가 제한적인 세포군이 됩니다. CD4 음성 세포를 48웰 플레이트의 적절한 수의 웰에 분주하십시오.각 웰에 300 µL를 추가한 후, 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 1시간 동안 보관합니다. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어, 500 µL의 신선한 배지를 추가하고 전이 피펫을 사용하여 12~20회 부드럽게 파이펫팅한 후 모든 액체를 제거하여 웰을 세척합니다. 이 세척 과정을 통해 부착된 항원 제시 세포 층이 남게 됩니다.세척이 완료되면 각 웰의 바닥을 적실 정도의 배지(약 100 µL)를 첨가합니다. 그렇지 않으면 부착 세포가 건조해질 수 있습니다. 필요한 경우, 각 웰에 200만에서 300만 개의 CD4 양성 세포를 첨가합니다.각 웰의 총 부피가 1 mL가 되도록 배지를 추가합니다. 각 웰에 원하는 펩타이드를 첨가합니다. 자극을 위한 일반적인 농도는 10 µg/mL입니다.마지막으로 플레이트를 37°C 인큐베이터에 7일 동안 배양합니다. 7일 후부터는 매일 각 웰에 50 µL의 hemo IL two를 첨가합니다.현미경을 사용하여 세포 성장을 관찰하고, 아직 합류(confluent)되지 않은 웰은 배지의 절반을 제거한 후 신선한 배지와 50 µL의 IL-2를 첨가합니다. 합류된 웰은 세포를 재현탁하여 세포의 절반을 빈 웰로 옮긴 후, 신선한 배지와 50 µL의 IL-2를 첨가하여 분할(split)합니다. 세포를 배양기에 넣습니다. 확장된 세포는 배양 13~15일 후에 TEER 염색 준비가 완료됩니다.4단계, 테트라머(tetramer) 염색을 통한 T세포 시각화 과정입니다. CD4 양성 T세포를 자극하는 데 사용된 펩타이드-MHC 조합에 맞는 테트라머를 구입하거나 조립하십시오. 배양기에서 플레이트를 꺼냅니다.각 웰에서 배지의 절반을 조심스럽게 뽑아냅니다. 각 웰에서 일반적으로 75 µL 또는 약 50,000 cells에 해당하는 세포 분량을 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브로 옮깁니다. 일반적으로 총 부피 50 µL당 1 µL의 tetramer를 추가하고 37 °C 인큐베이터에 1시간 동안 둡니다. 음성 대조군으로서 각 웰의 두 번째 분량을 mismatch tetramer로 염색하는 것이 권장됩니다. 세포를 anti-CD3, anti-CD4 및 anti-CD25 항체로 라벨링합니다.추가 또는 대체 항체 마커를 사용할 수 있습니다. 다만, 현재 이 채널은 teems를 위해 예약되어 있으므로 PE 표지 항체는 사용하지 마십시오. 또한, 모든 단일 색상 또는 이소타입 대조군은 추가 세포를 사용하여 표지하십시오.항체 표지된 세포를 4°C에서 15~30분 동안 배양합니다. 각 튜브를 0.5~1 mL의 running buffer로 세척하고 230 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. FACS 튜브에서 액체를 조심스럽게 따라내고, 참조 비드, 단색 대조군 튜브, 아이소타입 대조군 등을 사용하여 유세포 분석기를 교정합니다.유세포 분석기를 사용하여 각 튜브를 분석합니다. Tetra 양성 세포는 확장된 CD4 양성 T 세포들 사이에서 뚜렷한 군집으로 나타나야 합니다. Tetra 양성 세포는 보통 CD25 양성이며, 흔히 CD4 high 특성을 보입니다.

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

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