이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

안녕하세요, Cecilia Owens 연구실의 Hillary Kemp입니다. 그리고 저는 Cecilia Owens입니다. 저와 Hillary는 시애틀에 위치한 Fred Hutchinson Cancer Research Center의 기초 과학 부문에 소속되어 있습니다.

오늘은 유전적 모자이크라고도 알려진 키메라 제브라피쉬 배아를 만드는 기술을 보여드리겠습니다. 이 절차를 통해 발달 과정 중 유전자 기능의 세포적 기반을 평가할 수 있습니다. 우리는 특정 유전자가 돌연변이 표현형이 나타나는 세포 내에서 기능하는지(세포 자율적 기능), 아니면 해당 세포의 주변 환경 내에서 기능하는지(세포 비자율적 기능)를 확인할 수 있습니다.

포배기 또는 초기 낭배기 단계의 야생형 또는 돌연변이 배아 사이에 세포를 이식하여 이러한 모자이크를 제작합니다. 이후 호스트 환경 내에서 공여 세포 유래 세포의 표현형과 유전자형을 관찰함으로써 유전자 기능을 평가합니다. 그럼 시작하겠습니다.

프로토콜의 이 단계에서는 이식 후 공여 세포 유래 세포들의 운명을 추적할 수 있도록 공여 배아에 계보 염색약을 주입합니다. 이 기술을 사용하여 다양한 종류의 핵산을 주입할 수도 있으나, 배아 작업 전 DNA를 주입하는 경우에는 표지(decoration) 단계를 생략하십시오. 페트리 접시의 가장 넓은 부분에 유리 슬라이드를 45도 각도로 삽입하여 주입용 접시를 준비합니다. 접시의 4분의 3을 1.2% aros 및 pen strep이 포함된 배아 배지로 채웁니다.

agar가 굳은 후 슬라이드를 제거하여 경사진 홈을 만듭니다. 홈을 pen strep 배아 배지로 채웁니다. 이제 단일 세포 단계 배아의 효소 처리를 진행합니다.

1세포기 배아를 0.5 mg/mL Pronase 용액에서 1~5분 동안 배양합니다. 탈피 과정을 면밀히 관찰하십시오.

난황막(chorion)이 눈에 띄게 수축하기 시작하자마자 배아를 시스템 워터(system water)에 담급니다. 이렇게 하면 모든 난황막이 씻겨 내려가고 배아들은 비커 바닥에 가라앉게 됩니다. 배아들이 다시 한번 수면에 닿지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이제 대부분의 배아에서 난황막이 제거되었습니다. 일부는 제거되지 않은 채 겉돌고 있습니다.

여전히 난막(corion)에 둘러싸여 있는 배아가 있다면, 이와 같이 피펫팅하는 과정에서 배아가 밖으로 나와 방출되므로 배아가 수면에 닿지 않게 됩니다. 코팅된 배아를 다룰 때는 가장자리를 매끄럽게 하기 위해 화염 연마(fire polish) 처리된 피펫을 사용하는 것이 중요합니다. 넓은 구경의 화염 연마된 유리 피펫을 사용하여 취약한 DEC 코팅 배아를 주입용 디시의 홈으로 조심스럽게 옮기십시오.

그런 다음 이 트러프에 단일 파일을 로딩합니다. 이제 정밀하게 보정된 파이어-풀드 글라스 주입 피펫과 압력 주입 장치를 사용하여 배아에 계통 마커를 주입할 준비가 되었습니다. 바늘을 부러뜨리기 위해 배아 배지가 가득 담긴 디쉬를 사용하고, 바늘을 보정하기 위해 오일이 가득 담긴 디쉬를 사용할 것입니다.

이것은 일반적인 표준 실험실 등급의 미네랄 오일입니다. 끝을 날카롭게 다듬은 시계 제작용 핀셋을 준비하고, 접안렌즈를 통해 적절한 크기를 확인하면서 바늘의 양옆에 핀셋을 위치시킨 뒤, 칩을 조심스럽게 떼어냅니다. 이는 육안으로 확인하지 않고는 수행할 수 없는 작업입니다. 시작하기 전, 주입될 염료 또는 리보뉴클레오티드의 부피를 결정합니다.

미네랄 오일이 담긴 접시에서 볼루스 크기를 측정합니다. 마이크로 인젝터의 1~2회 펄스로 1 nanoliter의 볼루스가 전달될 수 있도록 바늘 끝을 적절히 절단해야 합니다. 볼루스의 부피는 접안마이크로미터로 측정한 직경을 통해 계산할 수 있습니다.

1~3% 농도의 형광 덱스트란 용액 1 nanoliter를 1~4세포기 사이의 코팅된 배아 난황에 직접 주입합니다. 배아를 바늘 바로 아래에 위치시킨 후, 바늘을 난황 중앙에 부드럽게 찌르고 풋 페달을 누릅니다.

주입 시, 염색약이 세포 내로 운반될 수 있도록 난황 흐름(yolk streams)에 주입하는 것이 중요합니다. 이 정도의 주입량이면 발생 과정 중 수일 동안 키메라 배아의 세포를 추적하기에 충분합니다. 이상적으로는 세포가 4세포기에 도달하기 전에 이 과정을 수행합니다. 주입된 배아는 신선한 pen strep 배아가 채워진 코팅된 페트리 접시에서 낮은 밀도로 배양하십시오.

주입된 배아는 발달 속도가 약간 느려지는 경향이 있으므로, 배아를 25, 28, 31 °C의 서로 다른 온도에서 배양하여 발달 시기를 조절함으로써 이식을 수행할 수 있는 시간적 여유를 최대화하십시오. 제브라피쉬 포배기 세포 이식에 사용되는 장치는 3방향 콕(three-way stop cock)으로 미네랄 오일 저장소 및 유연한 튜브로 연결된 마이크로 피펫 홀더에 부착된 해밀턴 시린지(Hamilton syringe) 구동 장치로 구성됩니다. 시스템 내의 모든 기포를 제거하십시오. 기포가 있으면 흡입 및 압력 조절 능력이 저하됩니다.

최소 DX 배율 이상의 고성능 광학계를 갖춘 실체 현미경을 사용하십시오. 마이크로 피펫 홀더와 니들의 위치를 제어하기 위해 NARA shige 수동 마이크로 매니퓰레이터 사용을 권장합니다. 진동이 이식 부위로 전달되는 것을 방지하기 위해 마그네틱 베이스를 사용하여 벤치에 단단히 고정하십시오.

이식용 바늘은 전극 폴러에서 완만하게 테이퍼지도록 뽑아낸 유리 모세관 피펫으로 제작합니다. 해부 현미경 하에서 피펫을 뽑는 자세한 방법은 Miriam Goodman 연구실의 JoVE 프로토콜을 참조하고, 뽑아낸 바늘의 끝부분을 제거하십시오. 포배기(blastula stage) 이식의 경우 바늘의 외경은 약 50 to 60 microns여야 하며, 낭배기(gastro stage) 이식의 경우에는 30 to 40 microns여야 합니다.

침투력을 높이기 위한 위장 단계 전이를 위해, 먼저 마이크로 포지(micro forge)를 사용하여 바늘 끝에 날카로운 미늘(barb)을 만들어야 합니다. 바늘 끝을 마이크로 포지의 필라멘트에 가까이 가져가 끝부분을 매끄럽게 다듬습니다. 그 다음, 베벨(bevel)의 앞쪽 가장자리가 필라멘트에 접촉할 수 있도록 바늘을 돌립니다. 바늘의 앞쪽 가장자리가 필라멘트에 접촉하면, 이를 빠르게 당겨 미늘을 생성합니다.

세포 손상을 방지하려면 바브(barb)가 곧아야 하며 바늘 끝이 휘어져서는 안 됩니다. 리그와 이식용 바늘이 준비되면 키메라 배아를 만들 준비가 된 것입니다. 포배 이식은 정밀한 운명 지도 정보가 필요하지 않을 때 배아 간에 세포를 이식하는 데 사용됩니다. 원시 생식 세포를 제외하고, 대부분의 세포는 일반적으로 이 단계에서 운명이 결정되지 않은 상태입니다.

포배기의 운명 지도는 외배엽이 될 세포와 중배엽이 될 세포를 구분할 수 있게 해줍니다. 중배엽 및 내배엽 전구세포는 포배기 배아의 가장자리 근처에 위치하는 반면, 신경계와 표피가 될 피부 전구세포는 배아의 가장자리에서 더 멀리 떨어져 위치합니다. 따라서 포배기 배아에 세포를 이식할 때, 해당 세포들을 presumptive mesoderm(추정 중배엽) 또는 presumptive ectoderm(추정 외배엽) 영역으로 표적화하여 이식할 수 있습니다.

하지만 우리는 배아의 배측이 어디인지 알 수 없기 때문에, 외배엽이나 중배엽의 특정 영역으로 세포를 표적화할 수 없습니다. 포배기 단계에서, 배아 배양액이 절반 정도 채워진 페트리 접시에 쐐기 모양의 돌출부가 쌍으로 배열된 플라스틱 몰드를 띄워 주입용 접시를 미리 준비합니다. 1.2% agrose가 응고되면 템플릿을 제거하여, 배아 하나를 담기에 충분한 크기의 삼각형 웰 열만 남깁니다.

이식용 몰드를 pen strep 배아 배지로 채우고, 화염 연마한 유리 피펫을 사용하여 포배기 배아를 각 웰에 개별적으로 분주합니다. 이제 배아를 이식 웰로 옮긴 후 처음에는 옆으로 눕혀 둡니다. 공여체 배아는 한 열에, 수용체 배아는 인접한 열에 배치되도록 배아를 배열합니다.

이식 바늘이 배아에 진입할 때 바늘이 배아를 웰의 뒷벽 쪽으로 밀어내도록 스테이지 위에 디쉬를 배치합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 이식 바늘을 상당히 가파른 각도로 디쉬 안으로 내립니다. 이상적으로는 이식 바늘이 약 45도 각도로 배아에 진입해야 합니다.

바늘 끝이 배아 배지의 표면 아래로 내려가면, Hamilton 시린지를 제어하는 마이크로미터 드라이브를 돌려 소량의 배아 배지를 바늘 안으로 흡입합니다. 가장 정밀하게 제어하려면 미네랄 오일과 배아 배지의 계면이 바늘 끝에 너무 가깝지 않게, 바늘의 가늘어지는 부분에 유지되어야 합니다. 바늘을 이용해 공여 배아의 위치를 조심스럽게 잡은 다음, 바늘을 뒤로 뺐다가 원하는 위치의 배아 포배기 캡(blastula cap)으로 진입시킵니다.

빠르고 강하게 찌르면 배아가 구르지 않고 관통됩니다. 세포의 전단 응력을 방지하기 위해 공여 세포를 바늘 속으로 천천히 주의 깊게 흡입하십시오. 원하는 수의 세포를 흡입한 후에는 바늘에 난황이 들어가지 않도록 주의하십시오.

압력을 약간 반전시켜 흡입을 멈추고, 바늘을 제거하여 호스트 배아를 적절한 위치로 가져옵니다. 이식 접시를 이동시키면, 난황에 닿지 않도록 주의하면서 이식 바늘을 이용해 살짝 돌려 호스트 배아의 위치를 미세하게 조정할 수 있습니다. 도너 세포를 호스트 배아로 배출할 때, 난황이 배아 내부로 함께 들어가지 않도록 주의하십시오. 이는 도너 세포를 손상시켜 사멸시킬 수 있습니다. 세포 전이가 완료된 후, 단일 도너 배아로부터 얻은 세포를 여러 호스트에 이식할 수 있습니다.

공여체 및 수용체 쌍을 코팅된 24웰 플레이트의 웰로 옮겨 배양을 계속합니다. 포배기 단계에서 세포들이 특정 운명으로 결정되지 않는다는 규칙의 유일한 예외는 원시 생식 세포입니다. 원시 생식 세포는 발달 초기 단계에서 매우 빠르게 지정되며, 원시 생식 세포 상태의 운명으로 결정됩니다.

매우 초기 단계부터 원시 생식세포는 포배기 및 낭배기 배아의 가장자리 근처에 위치합니다. 따라서 이식 실험의 목적이 원시 생식세포를 이식하는 것이라면, 공여 배아의 어느 위치에서 세포를 가져오는지가 매우 중요하며, 숙주 배아의 어느 위치로 세포가 이동하는지는 중요하지 않습니다. 반면, 체세포의 경우 숙주 배아 내에서 어느 위치로 이동하느냐가 세포의 운명을 결정하므로 이동 위치가 중요합니다.

원시 생식 세포의 경우, 이들의 운명이 이미 결정되어 있기 때문에 공여 배아의 어느 부위에서 유래했는지가 중요합니다. 원시 생식 세포를 이식하는 것이 목적이라면, 공여 배아의 hope 가장자리에서 세포를 채취해야 합니다. 이 세포들은 이 시트 단계, 즉 구형 단계(sphere stage) 또는 초기 발달 단계에서 배아 가장자리 근처에 각각 3~4개의 세포로 이루어진 4개의 작은 클러스터 형태로 위치하고 있습니다. 이때 난황을 실수로 흡입하지 않도록 매우 조심스럽게 채취해야 합니다.

좋습니다, 여기까지 진행했으며, 이제 숙주 배아로 옮기겠습니다. 원시 생식 세포는 어떤 배아에 있든 생식능선(genital ridge) 부위로 스스로 이동할 것입니다. 따라서 이 원시 생식 세포들을 가장자리에 이식할 필요는 없으며, 세포들이 스스로 그곳에 도달하게 됩니다.

따라서 저는 단순히 세포들을 포스트 엠브리오(post embryo)의 아무 곳에나 다시 이식하고 있습니다. 다른 종류의 이식과는 완전히 반대로, 생식세포 이식에서 핵심은 공여 세포가 어디에서 유래했느냐 하는 점입니다. 가스트룰라 단계의 호스트에 세포를 이식하면, 실험자는 배아 쉴드(embryonic shield)가 나타날 때 형성되는 제브라피쉬 운명 지도(fate map)를 활용할 수 있습니다.

다양한 조직 유형뿐만 아니라 추정 중앙신경계 내의 도메인을 구분하는 것이 가능해집니다. 가스트룰라 단계의 배아 간에 세포를 이식할 때 프로토콜에 일부 차이가 있을 수 있으나, 일반적인 절차는 배반포를 사용하여 가스트룰라를 고정하는 과정과 유사합니다. 먼저 유리 오목 슬라이드(depression slide)의 오목한 부분에 메틸셀룰로오스(Methylcellulose)를 수직 띠 모양으로 펴 바른 다음, 화염 연마된 피펫을 사용하여 pen strep 배지(embryo media)를 충분히 채웁니다.

공여체 하나와 쉴드기(shield stage)의 숙주 셋을 함몰 슬라이드로 옮깁니다. 숙주보다 약간 어린 공여체 배아를 선택하십시오. 가스트룰 접착제(gastros glue)를 조작하기 위해 새로운 도구가 필요한데, 이는 2파운드 테스트 낚시줄의 끝부분을 모세관 튜브 끝에 끼워 만든 것입니다.

이렇게 하여 작은 루프를 만듭니다. 루프를 사용하여 공여 배아와 수용 배아를 Methylcellulose 스트립 위로 조심스럽게 굴려 올린 다음, 고정될 때까지 Methylcellulose 속으로 밀어 넣습니다. 표적 부위가 위쪽을 향하도록 위치를 조정하며 굴립니다.

이식 과정 중 바늘이 난황막(ylk)을 손상시키지 않고 공여 세포를 전달하기 위해 배아에 접선 방향으로 진입하게 됩니다. 위장 단계(Gastro stage) 이식은 고정 배율의 복합 현미경에서 수행하는 것이 가장 좋습니다. 마이크로 매니퓰레이터의 조절 장치를 사용하여 이식 바늘의 끝단이 초점에 맞도록 조정하십시오.

마이크로 피펫 홀더와 바늘을 매우 얕은 각도로 배치하여, 슬라이드 위의 오목한 가장자리가 허용하는 한 바늘이 최대한 수평에 가깝게 위치하도록 합니다. 다음으로 공여 배아를 뚫습니다. 배아가 적절하게 고정되었다면, 배아가 너무 오래되어 바늘이 쉽게 관통되지 않는 경우가 아닐 때 이식 바늘이 들어갈 때 굴러가지 않을 것입니다.

난황을 찌르는 것을 방지하기 위해, 바늘은 EDL보다 약간 더 깊은 초점 평면에서 배아로 진입해야 합니다. 일단 천자되면, 공여체로부터 다량의 세포를 추출하여 최대 3회의 수용 세포 주입에 사용할 수 있습니다. 세포를 흡입할 때, 필요한 경우 바늘을 움직여 가며 난황이 함께 빨려 들어가지 않도록 주의하십시오.

세포를 호스트에 주입하기 전, 동일한 바늘을 사용하여 더 많은 세포를 얻기 위해 추가 배아를 수집할 수 있습니다. 세포를 호스트 배아로 주입할 때는 세포를 한 덩어리로 뭉쳐서 넣지 말고, 바늘을 표적 영역을 통해 끌어당기면서 세포를 배출하십시오. 이렇게 하면 공여 세포가 원하는 조직에 기여할 가능성이 높아집니다. 세포 전송이 완료되면 슬라이드 전체를 페트리 접시에 넣고 pen strep 배아 배지로 조심스럽게 채우십시오.

다음 몇 시간 동안 메틸셀룰로오스가 용해되면서 배아가 방출됩니다. 이식되는 세포 수는 실험의 구체적인 목적에 따라 달라집니다. 단일 공여자의 세포는 이식 다음 날 아침에 3~4마리의 수용체에 이식될 수 있습니다.

공여 세포 타겟팅이 성공적이었는지 확인하기 위해 숙주를 검사할 수 있습니다. 포배기 단계의 원시 생식 세포가 성공적으로 이식되면, ylk와 ylk 연장 부위의 접합부 근처의 복측에 형광 표지된 세포들이 위치하게 됩니다. 지금까지 가스트룰라 및 포배기 단계의 이식 방법을 살펴보았습니다.

이 기술을 수행할 때는 세포로 표적화하고자 하는 대상 조직에 적합한 이식 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 세포가 내배엽으로 가는지 외배엽으로 가는지 결정하기 위해서는 포배기 이식만으로도 충분합니다. 또한, 이 기술을 사용하여 원시 생식 세포를 표적화할 수도 있습니다.

더 정밀한 매핑을 원하신다면, 등쪽(dorsal side)이 이미 결정된 gastros 연령의 이식체를 사용하는 것이 좋습니다. 이 기술을 통해 신경계의 다양한 부위, 특히 전뇌, 중뇌, 후뇌 및 척수의 세포를 표적할 수 있습니다. 이것으로 모두 설명드렸습니다.

시청해주셔서 감사합니다. 모든 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.