이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

안녕하세요, 저는 세실리아 오웬스 연구소의 힐러리 켐프입니다. 저는 세실리아 오웬스입니다. 힐러리와 저는 시애틀에 있는 프레드 허친슨 암 연구 센터(Fred Hutchinson Cancer Research Center)의 기초 과학 부서에 있습니다.

오늘 우리는 유전자 모자이크라고도 알려진 키메라 제브라피시 배아를 만드는 기술을 보여줄 것입니다. 이 절차를 통해 발달 중 유전자 기능의 세포 기반을 평가할 수 있습니다. 우리는 주어진 유전자가 세포 자율 기능(cell autonomous function)으로 알려진 돌연변이 표현형을 가진 세포 내에서 기능하는지, 아니면 세포 비자율성(cell non autonomy)으로 알려진 세포 환경 내에서 기능하는지 물어볼 수 있습니다.

우리는 포반(blastula) 또는 초기 위장 단계(early gastro stage)에서 야생형 돌연변이 배아 사이에 세포를 이식하여 이러한 모자이크를 만듭니다. 그 후 숙주 환경에서 공여자 유래 세포의 표현형과 유전자형을 관찰하여 유전자 기능을 평가합니다. 시작하겠습니다.

프로토콜의 이 부분에서는 혈통 염료를 기증자 배아에 주입하여 이식 후 기증자 유래 세포의 운명을 따를 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 다양한 핵산을 주입할 수도 있지만, 배아를 다루기 전에 DNA를 주입할 때 장식 단계를 생략하고, 페트리 접시의 가장 넓은 부분을 가로질러 45도 각도로 유리 슬라이드를 삽입하여 주입 접시를 준비합니다. 3/4은 펜 연쇄상 구균 배아 배지에서 1.2%aros로 가득 차 있습니다.

경사진 홈통을 만들기 위해 어그로가 설정된 후 슬라이드를 제거하십시오. 여물통을 펜 연쇄상구균 배아 배지로 채웁니다. 이제 한 세포기 배아의 효소 장식을 진행하십시오.

한 세포 단계에서 배아를 1-5분 동안 밀리리터당 0.5mg으로 배양합니다. 프로나제 용액. 장식을 면밀히 모니터링하십시오.

코리온이 눈에 띄게 붕괴하기 시작하자마자 배아를 시스템 물에 담그십시오 그리고 이것은 모든 코륨을 쏟아내고 배아는 부리 곡선의 맨 아래에 머물러 있습니다. 그리고 배아가 한 번만 더 물 표면에 부딪히지 않는 것이 정말 중요하며, 대부분의 배아가 코리온을 떼어냅니다. 바깥쪽에는 그렇지 않은 몇 개의

코리온에 여전히 무언가가 남아 있으면 이와 같이 피펫팅하는 행위로 배아를 꺼내고 배아를 방출하여 물 표면에 닿지 않도록 합니다. 코팅된 배아를 가장자리를 매끄럽게 하기 위해 화염 연마된 피펫으로 취급하는 것이 중요합니다. 깨지기 쉬운 dec 코팅된 배아를 넓은 구멍의 방화 광택 유리 피펫을 사용하여 주입 접시의 홈통으로 부드럽게 옮깁니다.

그런 다음 이 트로프에 단일 파일을 로드합니다. 이제 배아는 정밀하게 보정된 파이어, 풀드 글라스 주입 피펫 및 압력 주입 장비를 사용하여 계통 마커를 주입할 준비가 되었습니다. 배아 배지로 가득 찬 접시를 사용하여 바늘을 부수고 기름으로 가득 찬 접시를 사용하여 바늘을 보정할 것입니다.

이것은 일반 표준 실험실 등급 미네랄 오일입니다. 우리는 뾰족한 워치메이커 집게를 가져다가 접안렌즈를 통해 적절한 크기를 결정하면서 바늘 양쪽에 집게를 놓고 칩을 부드럽게 떼어냅니다. 시작하기 전에.

미네랄 오일 접시에서 볼러스 크기를 측정하십시오. 바늘은 1 나노 리터의 덩어리가 마이크로 인젝터의 하나 또는 두 개의 펄스와 함께 전달되도록 끊어져야합니다. 볼루스의 부피는 접안렌즈 마이크로미터로 측정한 직경으로 계산할 수 있습니다.

1-3%의 형광 덱스트란 용액 1나노리터를 1-4 세포 단계 사이의 코팅된 배아의 ylk에 직접 주입합니다. 제가 할 일은 배아를 바늘 바로 아래에 위치시키는 것입니다. 바늘을 노른자 중앙에 부드럽게 찔러넣고 풋 페달을 밟을 것입니다.

일단 주입하면 염료가 세포로 운반되도록 난황 스트림에 주입하는 것이 중요합니다. 이 주입은 며칠의 발달 기간 동안 키메라 배아의 세포를 추적하기에 충분할 것입니다. 이상적으로는 세포가 4개의 세포 단계에 도달하기 전에 이 작업을 수행하고, 주입된 배아를 새로운 펜 연쇄상구균 배아로 채워진 코팅된 페트리 접시에 저밀도로 들어 올립니다. 보통.

주입된 배아는 발달 속도가 약간 느린 경향이 있으며, 섭씨 25도, 28도, 31도의 다른 온도에서 배아를 배양하여 발달을 지연시키고 이식을 수행할 수 있는 기간을 최대화합니다. 제브라 피쉬 포반의 세포 이식에 사용되는 장치는 3방향 스톱 콕으로 부착된 구동 제어 해밀턴 주사기로 구성되며, 미네랄 오일 저장소와 긴 길이의 유연한 튜브를 통해 마이크로 피펫 홀더에 부착됩니다. 흡입과 압력을 제어하는 능력을 망칠 수 있으므로 시스템에서 모든 기포를 제거하십시오.

최소한 DX 배율의 고품질 광학 장치를 갖춘 실체 현미경을 사용하십시오. 마이크로 피펫 홀더와 바늘의 위치를 제어하기 위해 NARA shige 수동 마이크로 매니퓰레이터를 제안합니다. 진동이 이식으로 전달되는 것을 방지하기 위해 마그네틱베이스를 사용하여 벤치에 고정되어 있는지 확인하십시오.

바늘 이식 바늘은 전극 극성의 부드러운 테이퍼로 당겨진 유리 모세관 피펫으로 만들어집니다. 해부 현미경으로 피펫을 당기고 당겨진 바늘의 끝을 끊는 방법에 대한 자세한 내용은 Miriam Goodman 실험실의 JoVE 프로토콜을 참조하십시오. 포반기 이식의 경우, 바늘의 외경은 약 50-60미크론 또는 위장 단계 이식의 경우 30-40미크론을 측정해야 합니다.

침투를 개선하기 위해 위장 단계 이동을 위해서는 먼저 마이크로 사료를 사용하여 바늘 끝을 날카로운 미늘로 당기고 바늘 끝을 마이크로 단조의 필라멘트에 가깝게 가져와 매끄럽게 해야 합니다. 그런 다음 베벨의 앞쪽 가장자리가 필라멘트와 접촉할 수 있도록 바늘을 돌립니다. 바늘의 앞쪽 가장자리가 필라멘트에 닿으면 빠르게 당겨 미늘을 만듭니다.

세포 손상을 방지하려면 미늘이 직선이어야 하고 바늘 끝이 구부러지지 않아야 합니다.리그와 이식 바늘이 준비되면 키메라 배아를 만들 준비가 된 것입니다. 포세포 이식은 미세한 운명 지도 정보가 필요하지 않을 때 배아 사이에 세포를 이식하는 데 사용됩니다. 원시 생식 세포를 제외하고, 대부분의 세포는 일반적으로 이 단계에서 운명에 맡겨져 있지 않습니다.

포배엽의 운명 지도는 외배엽을 발생시킬 세포와 중배엽을 생성할 세포를 구별할 수 있는 것입니다. 중배엽(mesodermal)과 내배엽(endodermal)은 배반기(blastula stage embryo)의 가장자리 근처에 있는 반면, 신경계(nervous system)와 표면 진피(surface derm)를 발생시킬 진피 전구세포(dermal progenitors)는 배아의 가장자리에서 더 멀리 떨어져 있습니다. 따라서 세포를 포반기 배아에 이식할 때, 해당 세포를 추정 중배엽 또는 추정 외배엽으로 표적으로 삼을 수 있습니다.

그러나 우리는 알지 못하기 때문에 외배엽이나 중배엽의 특정 영역에 세포를 표적으로 삼을 수 없습니다. 배아의 등쪽이 있는 포반 단계에서, 배아 배지에서 용융된 1.2%aros로 절반을 채워진 페트리 접시에 쐐기 모양의 돌출부가 한 쌍으로 된 플라스틱 주형을 띄워 주입 접시를 미리 준비합니다. 아로스가 굳어지면, 주형을 제거하고, 각각 하나의 배아를 담을 수 있을 만큼의 크기의 삼각형 모양의 우물 열을 남겨둔다.

이식 주형에 펜 연쇄상구균 배아 배지를 채우고, 불에 광택을 낸 유리 피펫을 사용하여 모세포기 배아를 각 웰에 개별적으로 로드합니다. 이제 배아를 이식 우물로 옮기고 처음에는 배아를 옆으로 눕히십시오. 배아를 배열하여 기증자 배아가 한 열 아래에 배치되고 숙주 배아가 인접한 열 아래에 배치되도록 합니다.

접시를 무대에 올려 놓아 이식 바늘이 배아에 들어갈 때 바늘이 배아를 우물의 뒤쪽 벽으로 밀어 넣도록 합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 이식 바늘을 상당히 가파른 각도로 접시에 내립니다. 이상적으로는 이식 바늘이 약 45도 각도로 배아에 들어가야 합니다.

바늘 끝이 배아 배지의 표면 아래에 있으면 Hamilton 주사기를 제어하는 마이크로미터 드라이브를 비틀어 소량의 배아 배지를 바늘로 끌어들입니다. 가장 정확한 제어를 위해 광유와 배아 배지 사이의 계면은 바늘의 얇고 가늘어진 부분에 남아 있어야 하며 끝에 너무 가깝지 않아야 합니다. 기증자 배아를 바늘로 부드럽게 배치한 다음 바늘을 다시 당겨 원하는 위치에서 배아의 포반 캡으로 들어갑니다.

빠르고 세게 타격하면 배아가 굴러가지 않고 배아를 관통할 것입니다. 세포가 깎이지 않도록 기증자 세포를 천천히 조심스럽게 바늘로 빨아냅니다. 원하는 수의 세포를 흡수한 후 노른자를 바늘로 가져가지 마십시오.

압력을 약간 반대로 하여 흡입을 중지하고 숙주 배아를 제자리로 가져오려는 바늘을 제거합니다. 이식 접시를 움직여서, 난황을 만지지 않도록 주의하는 한 이식 바늘을 사용하여 부드럽게 돌려 숙주 배아의 위치를 약간 조정할 수 있습니다. 기증자 세포를 숙주 배아로 배출할 때, ylk를 배아로 흡수하면 단일 기증자 배아의 기증자 세포가 손상되고 죽을 수 있으므로 피하십시오. 세포 이식이 완료된 후 여러 숙주에 이식할 수 있습니다.

공여체 숙주 쌍을 24웰 플레이트의 코팅된 웰로 옮겨 개발을 계속합니다. 세포가 포반 단계에서 특정 운명에 맡겨지지 않는 규칙의 한 가지 예외는 원시 생식 세포입니다. 원시 생식 세포 세포는 발달 초기에 지정되며 원시 생식 세포 상태의 운명에 전념합니다.

아주 초기 단계부터, 원시 생식 세포는 포반(blastula)과 가스 단계 배아(gast stage embryo)의 가장자리 근처에 있습니다. 따라서 이식 실험의 목표가 원시 생식 세포를 이식하는 것이라면, 세포가 기증자 배아에서 어디에서 왔는지가 매우 중요하며 숙주 배아에서 세포가 어디로 가는지는 중요하지 않습니다. 따라서 규칙은 체세포의 경우, 숙주 배아에서 어디로 가느냐가 그들의 운명을 결정하는 것이 중요하다는 것입니다.

원시 생식 세포의 경우, 그들의 운명이 이미 결정되어 있기 때문에 기증자 배아에서 어디에서 왔는지가 중요합니다. 만약 목표가 원시 생식 세포를 이식하는 것이라면, 이 세포는 기증자 배아의 희망의 가장자리에서 채취되어야 하며, 이 세포는 이 시트, 이 창 단계 또는 높은 발달 단계에서 각각 3개 또는 4개의 세포로 구성된 4개의 작은 클러스터로 배아의 가장자리 바로 근처에 위치합니다. 그리고 실수로 노른자를 빨기 시작하지 않도록 아주 조심스럽게 집어야 합니다.

자, 그래서 저는 거기서 그렇게 했고, 이제 저는 숙주 배아로 이동하고 있습니다. 이제 원시 생식 세포는 그들이 속한 배아가 무엇이든 간에 생식기 융기 영역으로 갈아붙을 것입니다. 따라서 이 원시 생식 세포를 스스로 얻을 수 있는 가장자리에 이식할 필요가 없습니다.

그래서 저는 그것들을 예전의 어떤 장소에나 다시 이식해서 배아 후의 배아에 다시 이식하고 있습니다. 다른 종류의 이식과는 정반대인 생식 세포 이식의 핵심은 기증자 세포가 어디에서 왔는지가 중요하다는 것입니다. 세포를 위장 단계 숙주에 이식하면 실험자는 배아 보호막이 보일 때 나타나는 얼룩말 제브라피시 운명 지도를 활용할 수 있습니다.

서로 다른 조직 유형뿐만 아니라 추정되는 중추 신경계 내의 도메인을 구별하는 것이 가능해집니다. 위장 목록 단계에서 배아 간에 세포를 이식할 때 프로토콜에 약간의 변형이 있지만 일반적인 절차는 배반구를 사용하여 위장을 장착하는 것과 유사합니다. 먼저 유리 함몰 슬라이드의 움푹 들어간 곳에 메틸셀룰로오스의 수직 줄무늬를 바르고, 그런 다음 불로 닦은 피펫 전사를 사용하여 넉넉한 양의 펜 연쇄상구균 배아 배지를 붓습니다.

1명의 기증자와 3개의 방패 단계가 우울증 슬라이드에 숙주를 이룹니다. 숙주보다 약간 어린 기증자 배아를 선택합니다. 위장 접착제를 조작하려면 새로운 도구가 필요하며, 짧은 길이의 2 파운드 테스트 낚싯줄의 끝을 모세관 끝으로 밀어 넣습니다.

따라서 작은 루프를 만듭니다. 고리를 사용하여 기증자와 숙주 배아를 메틸셀룰로오스 스트립 위로 부드럽게 굴려 올리고 고정될 때까지 메틸셀룰로오스에 넣습니다. 대상 영역이 가장 위에 오도록 위치로 굴립니다.

이식하는 동안 바늘은 ylk를 손상시키지 않고 기증자 세포를 전달하기 위해 접선으로 배아에 들어가기 때문입니다. 위장 단계 이식은 고정 스테이지 복합 현미경에서 가장 잘 수행됩니다. 마이크로 매니퓰레이터의 컨트롤을 사용하여 이식 바늘 끝에 초점을 맞춥니다.

마이크로 피펫 홀더와 바늘을 상당히 얕은 각도로 배치하여 바늘이 슬라이드의 움푹 들어간 부분의 가장자리가 허용하는 한 수평에 가깝도록 합니다. 다음으로 기증자 배아를 뚫습니다. 제대로 장착하면 배아가 너무 늙어서 바늘이 쉽게 침투할 수 없는 경우를 제외하고는 이식 바늘이 들어갈 때 굴러가지 않습니다.

ylk를 뚫지 않으려면 바늘이 EDL보다 약간 더 깊은 초점면에서 배아로 들어가야 합니다. 일단 뚫리면 최대 3번의 숙주 세포 주입을 위해 공여자로부터 많은 수의 세포를 제거할 수 있습니다. 세포를 끌어낼 때 원하는 경우 세포를 흡수할 때 바늘을 움직여 노른자를 빨아들이지 마십시오.

세포를 숙주로 방출하기 전에 동일한 바늘을 사용하여 더 많은 세포를 얻기 위해 추가 배아를 수확할 수 있으며, 세포가 숙주로 방출되는 동안 세포를 방출하는 동안 세포를 단일 덩어리로 침착하는 대신 표적 부위를 통해 바늘을 뽑아내는 동안 세포를 배출합니다. 이것은 기증자 세포가 원하는 조직에 기여할 가능성을 증가시킬 것입니다. 세포 전달이 완료되면 전체 슬라이드를 페트리 접시에 넣고 펜 연쇄상구균 배아를 조심스럽게 주입합니다. 보통.

앞으로 몇 시간 동안 메틸셀룰로오스가 용해되어 배아가 방출됩니다. 이식되는 세포의 수는 실험의 특정 목적에 따라 다릅니다. 한 명의 기증자로부터 얻은 세포는 이식 후 아침에 3개 또는 4개의 숙주에 이식될 수 있습니다.

숙주를 검사하여 공여자 세포 표적화가 성공적이었는지 확인할 수 있습니다. 포세포 시대의 원시 생식 세포를 성공적으로 이식하면 형광 표지 세포가 생성되어 ylk와 ylk 확장 사이의 접합부 근처에 복부로 위치합니다. 지금까지 가스트룰라와 포반기 이식을 하는 방법을 보여드렸습니다.

이 기술을 수행할 때 세포를 표적으로 삼고자 하는 표적 조직에 적합한 유형의 이식 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 따라서 포배엽 단계 이식은 세포가 진피와 외배엽으로 이동하는지 결정하기에 충분합니다. 또한 이 기술을 사용하여 원시 생식 세포를 표적으로 삼을 수도 있습니다.

더 세밀한 매핑을 하고 싶다면 등쪽이 이미 결정된 위장 연령 이식을 사용하는 것이 좋습니다. 따라서 이 기술을 사용하면 신경계의 다양한 부분, 특히 전뇌, 중뇌, 뒷뇌 및 척수에 있는 세포를 표적으로 삼을 수 있습니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 모든 실험에 행운을 빕니다.