Name: 이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-17T16:04:00.000+00:00
Duration: 21 min 1 s
Description: 배우세요 Danio rerio의 배아 이식을 통한 키메라 제브라피쉬 생성 기법. 발생 단계에서 유전자 기능의 세포적 기초를 평가하고 세포 자율적 및 비자율적 기능을 구분하는 방법을 익혀보세요.

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이 문서의 작성 중에 도움이 입력을위한 Moens 연구실의 구성원 감사합니다. HK는 NIH / NICHD 부여 # 5R01HD037909 - 08에 의해 지원 박사후 사람입니다. CBM은 하워드 휴즈 의학 연구소와 수사관이다.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+developmental+potential+of+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo.</a> Trends Genet. 4, 68-74 (1988).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
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<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124, 3157-3165 (1997).</li>
<li>Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+nanos-related+gene+is+essential+for+the+development+of+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells.</a> Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).</li>
<li>Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissues+and+patterning+events+required+for+distinct+steps+in+early+migration+of+zebrafish+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells.</a> Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+by+attraction+towards+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target.</a> Development. 129 (1), 25-36 (2002).</li>
<li>Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).</li>
<li>Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+zebrafish+pbx+proteins+reveals+a+hindbrain+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state.</a> Dev Cell. 3, 723-733 (2002).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).</li>
<li>Blaser, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
</ol>

이식이 타겟 chimeras를 생산하는 데 사용할 수있는 용이성은 척추 모델로 zebrafish의 위대한 능력 중의 하나입니다. 위에서 설명하지 않은이 프로토콜의 수정 접합자의 개발에 필수적인 역할과 함께 유전자에 대한 모성 유전자 기능의 분석을 수 있습니다. 이러한 돌연변이 물고기가 성인까지 생존 수 있기 때문에 돌연변이 세포의 &#39;germline의 클론 &quot;을 작성, 기타 야생 형 호스트 배아에 돌연변이 germline을 전송하는 것이 필요합니다. 생성 germline 모자이크는 야생 형 호스트 배아에 돌연변이 기증자로부터 이식 원시 배아 세포를 포함한다. 배아에있는 다른 모든 세포 lineages 달리 배아 세포 계보 (Lineage)는 산모 determinants 5,6의 상속에 의해 초기 개발에 지정됩니다. 따라서 germline의 모자이크 만들기의 첫 번째 도전은 기증자의 배아에 원시 배아 세포 (PGCs)를 식별합니다. midblastula 단계에서 PGCs 그렇게 혈통 - 표시 기...

시약 :이 절차에 사용되는 시약의 많은 조리법이에서 전체 온라인에서 사용할 수 있습니다 Zebrafish 도서에서 발견되는 <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> . 조리법은 생선 물, 엠브료 매체로의 준비와 항생제, dechorionating, 형광등 dextrans에 대한 pronase 및 메틸 셀룰로스없이이 제공됩니다.

이식에 의해 키메라 zebrafish의 배아를 생성

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

복잡한 개발 프로세스에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나는 키메라 배아의 분석이다. 키메라는 하나 이상의 동물에서 세포를 포함하는 유기체로 정의되며 모자이크는 하나 이상의 유전자형의 세포는 일반적으로 야생 - 타입과 돌연변이 혼합되어있는 키메라의 한 종류입니다. zebrafish에서 chimeras은 즉시 적절한 배아 단계에서 호스트 배아에 기증자의 배아에서 세포 이식에 의해 만들 수 있습니다. 표시 기증자 세포는 한 세포 단계의 배아로 같은 형광 염료로 혈통 마커,의 주사에 의해 생성됩니다. 표시 기증자 세포는 기증자의 배아에서 제거하고 화합물 또는 해부 현미경 중 하나에 장착된 오일 제어 유리 피펫을 사용하여 레이블이 지정되지 않은 호스트 배아에 도입하고 있습니다. 기증자 세포가 어떤 경우에는 잘 설립 운명의지도에 따라 호스트 배아에 이식 사이트를 선택하여 개발 blastula 또는 gastrula 무대 호스트 배아의 특정 지역 또는 조직을 대상으로 수 있습니다.

blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

복잡한 발달 과정에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나는 키메라 배아 분석입니다. 키메라는 ...로 정의됩니다.

안녕하세요, Cecilia Owens 연구실의 Hillary Kemp입니다. 그리고 저는 Cecilia Owens입니다. Hillary와 저는 시애틀에 위치한 Fred Hutchinson Cancer Research Center의 기초과학 부문에 소속되어 있습니다.오늘은 유전적 모자이크라고도 알려진 키메라 제브라피쉬 배아를 만드는 기술을 보여드리겠습니다. 이 절차를 통해 우리는 발달 과정 중 유전자 기능의 세포적 기초를 평가할 수 있습니다. 특정 유전자가 돌연변이 표현형을 나타내는 세포 내에서 기능하는지(세포 자율적 기능), 아니면 해당 세포의 주변 환경 내에서 기능하는지(세포 비자율적 기능)를 확인할 수 있습니다.우리는 blastula 단계 또는 초기 gastro 단계의 야생형 배아와 돌연변이 배아 사이에 세포를 이식하여 이러한 모자이크를 제작합니다. 이후 숙주 환경 내에서 공여체 유래 세포의 표현형과 유전형을 관찰함으로써 유전자 기능을 평가합니다. 그럼 시작하겠습니다.프로토콜의 이 단계에서는 이식 후 공여자 유래 세포의 운명을 추적할 수 있도록 공여자 배아에 계보 염료(lineage dye)를 주입합니다. 이 기술을 사용하여 다양한 핵산을 주입할 수도 있으나, 배아 작업 전 DNA를 주입할 때는 표지(decoration) 단계를 생략하십시오. 페트리 접시의 가장 넓은 부분에 유리 슬라이드를 45도 각도로 삽입하여 주입용 접시를 준비합니다. 1.2% aros 및 pen strep이 포함된 배아 배지를 접시의 4분의 3 정도까지 채웁니다.아가로스가 굳은 후 슬라이드를 제거하여 경사 진 홈을 만듭니다. 홈을 pen strep 배아 배지로 채웁니다. 이제 단일 세포 단계 배아의 효소 장식 과정을 진행하십시오.1세포기 배아를 0.5 mg/mL Pronase 용액에서 1~5분 동안 배양하십시오. 탈피 과정을 면밀히 관찰하십시오.난막이 눈에 띄게 수축하기 시작하자마자 배아를 시스템 워터에 담급니다. 이렇게 하여 모든 난막을 따라 흘려보내면, 배아들은 비커 곡선 바닥 부분에 그대로 남게 됩니다. 배아가 다시 한번 수면에 닿지 않게 하는 것이 매우 중요하며, 대부분의 배아는 난막이 제거된 상태입니다. 외곽에 일부 제거되지 않은 난막들이 소용돌이치며 떠다니고 있습니다.만약 배아가 여전히 난막(corion)에 둘러싸여 있다면, 이와 같이 피펫팅하는 동작을 통해 배아를 밖으로 꺼내어 배아가 수면 표면에 닿지 않도록 방출할 수 있

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Zebrafish 세포 이식은 조직 특정 chimeras를 생성하는 유전 발생학의 조합이 가능합니다. 이 비디오는 gastrula 우리 연구실은 forebrain의 접합면의 형성 중에 astroglial 인구와 구체적인지도 단서의 역할을 조사하기 위해 허용해야 세포 transplantations를 개최 보여줍니다.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

하드 chorion 부드러운 배아, medaka의 배아의 조작으로 인해 더 zebrafish에 비해 참여합니다. 이 비디오는 chimeras의 생산을위한 이미징 및 세포 이식에 대한 아가로 오스의 장착 dechorionation 포함한 medaka의 배아를 조작하는 방법에 대한 단계별 절차를 나타냅니다. 이러한 절차는 척추 게놈 기능의 유전자 해부 위해 상호 보완적인 기능을 최대한 활용하기 위해 실험실에서 medaka와 zebrafish를 사용하는 필수적입니다.

Chimeras의 생성에 대한 Medaka의 태아 및 세포 이식의 Dechorionation

이 프로토콜은 서로 다른 유전적 배경을 가진 기생충 제브라피시 배아를 생성하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 제브라피시 배아의 탁월한 이미징 기능과 결합하면 이 방법은 관심 후보 유전자에 대한 세포 자율 기능과 비세포 자율 기능을 조사할 수 있는 독특하고 강력한 수단을 제공합니다.

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

세포의 해출 및 이식과 같은 배아 조작은 초기 발달을 연구하기 위한 중요한 도구입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 이러한 조작을 수행하기 위해 간단하고 효과적인 이식 장치를 설명합니다.

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

여기에서 우리는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이의 모든 단계에서 제브라피시 배아와 유충에서 높은 공간적 및 시간적 해상도로 세포를 이식하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

배우세요 Danio rerio의 배아 이식을 통한 키메라 제브라피쉬 생성 기법. 발생 단계에서 유전자 기능의 세포적 기초를 평가하고 세포 자율적 및 비자율적 기능을 구분하는 방법을 익혀보세요.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

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