Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 배발생, 유충 이동 및 종양 발생 중에 세포의 전기적 변화를 관찰할 수 있는 형질전환 제브라피시 계통을 만드는 것입니다. 이 방법은 발생 생물학, 생리학 및 암세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 배발생 및 종양 세포에서 세포 전기 신호의 근본적인 역할은 무엇입니까? 이 기술의 가장 큰 장점은 생체 내에서 실시간으로 세포 전기 신호를 추적할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 Tol2 transposase mRNA와 주사 용액을 준비한 후, 주사 전 오후에 최소 2마리의 수컷과 2마리의 암컷으로 4-6개의 사육 탱크를 설정했습니다. 물고기의 배설물을 줄이고 번식 반응을 유도하려면 오후에 물고기에게 먹이를 주지 마십시오. 다음날 아침, 섭씨 80도의 음극 냉동고에서 준비된 주입 용액을 꺼내 얼음 위에 놓습니다.

물고기 사육 탱크의 칸막이를 당기고 물고기가 짝짓기를 할 수 있도록 합니다. 일반적으로 물고기는 20-30분 이내에 알을 낳습니다. 기다리는 동안 다음 매개 변수를 가진 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 모세관 유리에서 바늘을 당깁니다.

실험실용 물티슈를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨리고 비스듬한 가장자리를 만듭니다. 배아 사망률을 줄이기 위해 더 작은 직경이 선호됩니다. 물고기가 알을 낳으면 직경 10cm의 페트리 접시에 모읍니다.

해부 현미경 바로 아래에서 모든 비정상적인 배아와 물고기 배설물을 제거합니다. 그런 다음 수정된 배아를 준비된 3% 아가로스 사출 금형에 피펫으로 넣습니다. 배아가 제자리에 고정되도록 여분의 물을 제거하십시오.

모든 줄이 생존 가능한 배아로 채워지면 단일 세포가 모두 바늘에 대해 수평으로 45도 각도를 향하도록 배열합니다. 이렇게 하면 나중에 주입이 훨씬 쉬워집니다. 다음으로, 장갑을 낀 상태에서 20마이크로리터 로딩 피펫 팁을 사용하여 얼음 위의 튜브에서 준비된 구조물 5마이크로리터를 제거합니다.

피펫 팁을 부러진 모세관 뒤쪽 끝에 조심스럽게 삽입하여 테이퍼가 시작되는 곳까지 시약을 팁에 최대한 가깝게 만들고 모세관으로 배출합니다. 그래도 기포가 남아 있으면 끝이 부러지지 않도록 바늘을 흔듭니다. 바늘을 마이크로 주사 바늘 홀더에 똑바로 삽입하고 바늘이 제자리에 고정될 때까지 조심스럽게 조입니다.

그런 다음 각도를 약 45도로 조정합니다. 바늘이 준비되고 부착되면 현미경과 가스 압력 탱크를 켭니다. 유지에는 약 0.5PSI, 배출에는 30PSI를 사용하여 주입량을 조정합니다.

페달을 밟을 때 바늘에서 용액이 나오는지 확인하십시오. 미네랄 오일 한 방울이 있는 스테이지 마이크로미터를 사용하여 용액의 부피와 흐름을 직경이 약 10마이크로미터로 조정합니다. 배압으로 인해 소량의 용액이 바늘에서 떨어질 수 있는지 확인하십시오.

배압이 충분하지 않으면 모세관 작용으로 인해 액체가 바늘에 들어가 mRNA를 파괴합니다. 바늘이 보정되면 겔 노치의 가장자리를 사용하여 수정된 배아의 단일 세포에 바늘을 삽입하여 배아를 제자리에 유지하고 배아를 움직이지 않고 바늘이 압력을 가할 수 있도록 하는 지지대를 제공합니다. 바늘 끝이 단일 셀에 들어가면 페달을 밟아 원하는 양의 용액을 방출합니다.

형질전환 제브라피시를 생성하기 위해 난황이 아닌 세포에 용액을 주입하는 것이 중요합니다. 모든 배아에 대해 이 과정을 반복합니다. 완료되면 폐기 3.4ml 전사 피펫과 물고기 시스템 물을 사용하여 주입된 배아를 아가로스 노치에서 헹궈 라벨이 부착된 접시로 옮깁니다.

배아를 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 보관하여 배아가 발달할 수 있도록 합니다. 하루 종일 다시 확인하여 죽은 물고기 배아를 제거하고 물고기 물에서 물을 0.1% 메틸렌 블루로 교체하십시오. 주입 후 약 6-8시간 후에 주입된 어류 배아 10개와 핫샷 방법을 사용하여 게놈 DNA를 준비합니다.

다음 날 아침, 형광등이 있는 해부 현미경을 사용하여 난황이 아닌 조직에서 GFP를 보이는 배아를 분류합니다. 이러한 배아는 주입된 구조체를 포함해야 합니다. Tol2 excise assay를 수행하여 앞에서 설명한 대로 transposon 활성을 확인합니다.

절제된 혈장이 검출될 수 있는 경우는, 주입된 어류 배아를 보관하고 배양한다. 그렇지 않으면 Tol2 소비세 분석에서 긍정적인 결과를 얻을 때까지 Tol2 mRNA 합성 및 마이크로 주입 프로세스를 반복합니다. 제브라피시 배아를 이미지화하기 위해, 야생형 물고기와 개별 쌍으로 다중 F2 세대 창시자 물고기를 교차시킵니다.

제브라피시 스테이징 가이드에 따라 원하는 다양한 발달 단계에서 물고기 배아를 수집합니다. 어류 시스템 물에 있는 초기 단계의 어류 배아의 경우 해부 범위 아래에서 한 쌍의 집게를 사용하여 융모막을 조심스럽게 껍질을 벗기고 제거합니다. 폐기 이송 피펫을 사용하여 몇 개의 배아를 3% 메틸셀룰로오스가 함유된 오목한 유리 슬라이드로 옮깁니다.

그런 다음 해부 내시경 아래의 바늘을 사용하여 배아를 원하는 위치로 조정하여 세포 GFP 활동을 확인합니다. 12 somite 미만 단계에 있는 배아의 경우, 호환 가능한 카메라 및 이미징 소프트웨어와 함께 epifluorescence compound microscope를 사용하십시오. 12 somite 단계를 지난 배아의 경우 형광 해부 현미경을 사용합니다.

종양 세포 전압을 이미지화하려면 먼저 악성 말초 신경초 종양 또는 MPNST가 있는 물고기를 식별합니다. 물고기를 직경 10cm의 페트리 접시에 넣고 전체 마운트 이미징을 수행합니다. 마지막으로 이미징 후 종양 세포의 전기적 활동을 보기 전에 종양을 해부합니다.

성공적인 주입에서는 주입된 배아의 50% 이상이 체세포에서 어느 정도의 GFP를 나타내고 대부분은 Tol2 transposon excise assay에서 긍정적인 결과를 보여줍니다. 여기에서 제브라피시 초기 배아 발달 동안 세포주기 전반에 걸쳐 막 전위 변화를 조사했습니다. 이 타임랩스 비디오에서 볼 수 있듯이, 세포는 분열 고랑이 형성되기 전에 과분극되었습니다.

더욱이, 서로 다른 조직들은 1일에서 3일 된 물고기 배아에서 다양한 막 전위를 보여주었다. 예를 들어, 솜씨(somite)와 노토코드(notocord)는 일반적으로 인접한 조직과 장기에 비해 과분극되어 있었다. 이 생후 이틀 된 물고기 배아에서는 움직이는 동안 신경근의 전기 활동이 나타나며 전기 신호 전달에 해당하는 색 밀도 변화가 나타납니다.

암세포의 생체전기적 특성을 자발적인 MPNST에 취약한 RPL35 돌연변이가 있는 ASAP1 리포터 어류의 교배종에서 조사했습니다. 주변 조직과 비교했을 때, 종양 세포는 더 편광되어 있었습니다. 이 마이크로 주입 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 이상적인 결과를 얻으려면 제브라피시 배아가 단일 세포 단계에 있어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 발전으로 발생 생물학 및 세포 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시 및 기타 모델 유기체의 생체 내 전기 신호 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마이크로 주입으로 형질전환 제브라피시 라인을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.