Name: Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 제브라피시 초기 배아에서 종양 세포의 전기 활동을 실시간으로 시각화하는 방법을. Tol2 트랜스포존을 이용한 형질전환 기술로 발달생물학과 암 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

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이 간행물에 보고 된 연구 작업에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 R35GM124913, 퍼듀 대학 PI4D 인센티브 프로그램, 그리고 PVM 내부 경쟁에서 국립 보건원의 지원 기초 연구 자금 프로그램입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 자금 에이전트의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 우리 Tol2 구문, ASAP1 구문에 대 한 마이클 린 고이치 가와카미를 감사 하 고 레너드 Zon ubi 발기인에 대 한 Addgene를 통해 생성.

Zebrafish는 AAALAC 승인 동물 시설에 보관 되어있습니다 그리고 모든 실험 프로토콜 퍼듀 동물 관리 및 사용 위원회 (PACUC)에 의해 승인에 따라 실시 했다.
1. Tol2 Transposon 플라스 미드 구조 준비
참고: Tol2, 메 다카 물고기에서 발견 되었다 transposon zebrafish 연구 커뮤니티8,9사용 널리 있다. 그것은 되었습니다 성공적으로 게이트웨이 사이트 재결합 기반 복제 시스템에 채택 및 Tol2 키트10로 알려진. Tol2 키트는 또한 transgenesis의 효율성을 증가 하는 동안 사용자 지정된 식 구문을 만드는의 더 편리한 방법에 대 한 수 있습니다. 따라서,이 시스템을 활용 하 고 검증된 유비퀴틴 발기인 ASAP111를 사용 하 여 유비 쿼터 스 ASAP1 식 제 브라 라인 만들기 쉬운 결정 이었다.
<ol><li>중간 항목 ASAP1 구조를 만들기: pDONR221 ASAP1<ol>
<li>Addgene에서 pcDNA3.1/순수 하지 않아-CAG-ASAP1 (플라스 미드 #52519), 유전으로 인코딩된 전압 센서 ASAP1 구조를 취득 합니다. ASAP1 코딩 영역 증폭 PCR 뇌관 (그림 1)의 5' 끝에 attB 시퀀스 형벌 사용자 지정된 뇌관 (attB1-ASAP1F와 attB2-ASAP1R)를 사용 하 여 설정 합니다. Phusion DNA 중 합 효소의 높은 효율을 위해 선택 되었다 그리고 PCR 조건12이전 게시 된 프로토콜 따라 최적화 된 했다.</li>
		<li>태 젤 200 µ L 팁, 일반 피 펫을 사용 하 여 1%로 50 µ L PCR 제품을 로드 하 고 약 30 분 동안 가로 젤 탱크에 160 V에서 전기 영동을 수행.</li>
		<li>UV transilluminator에서 젤 확인 (353 nm), UV transilluminator 아래 블레이드/메스를 사용 하 여 이전에 게시13,14, 원하는 밴드 소비 세 그리고 깨끗 한 1.5 mL microcentrifuge로 DNA 포함 하 젤 샘플을 넣어 튜브입니다.</li>
		<li>ASAP1 PCR 제품 젤 정화를 수행 합니다. 제조업체의 지시에 따라 상업 DNA 젤 정화 키트를 사용 하 여 삭제 젤에서 DNA를 복구 하 고 물 20 µ L로 DNA을 elute. 샘플으로 1 µ L를가지고 고는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 측정. 빈 컨트롤15로 물을 사용 하 여 소프트웨어 지침 흐름.</li>
		<li>받아 100 ng의 PCR 제품을 정화 하 고 150 믹스 테의 10 µ L 플라스 미드 pDONR221의 ng 버퍼 (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. 반응으로 혈압 Clonase II의 2 µ L을 추가 하 고 품 어 하룻밤 실 온에서 반응.</li>
		<li>둘째 날에는 반응으로 가수분해 K의 1 µ L을 추가 하 고 품 어 30 분 동안 37 ° C에서 반응.</li>
		<li>변환을 수행 합니다. 반응 전송 및 Top10 유능한 대장균 세포 및 품 어 30 분 동안 얼음에 셀의 50 µ L 함께 섞는다. 다음 전송 1 분에 42 ° C 물 목욕으로 반응 관은 즉시 튜브를 제거 하 고 2 분 동안 얼음에 품 어. 다음, 튜브 37 ° C 통에 넣고 1 시간을 위해 그것을 품 어.</li>
		<li>튜브를 꺼내와 대 파운드 플레이트에 셀 접시. 다음, 접시 하룻밤 (16-18 h) 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>단일과 잘 분리 된 식민지를 선택 하 고 14 mL 셀 문화 튜브 파운드 매체의 3 mL에 접종. 하룻밤 250 rpm (분당 회전)의 회전 속도 함께 통에 37 ° C에서 문화 그들.</li>
		<li>Miniprep의 명령 수동17다음 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
		<li>3-4 플라스 미드를 시퀀스 생어 시퀀싱 식별 긍정적인 pDONR221-ASAP1 M13F 및 M13R 시퀀싱 뇌관을 사용 하 여 복제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microinjection에 대 한 Tol2 구조를 만들기: pDestTol2-유비-ASAP1<ol>
<li>시퀀싱 확인 pDONR221 ASAP1 복제 및 측정의 DNA 농도 분 광 광도 계 다음 빈 제어15물을 사용 하 여 소프트웨어 명령을 사용 하 여 선택 합니다.</li>
		<li>PDONR221-ASAP1의 100 µ g을 100 µ g Tol2 키트 5-엔드 플라스 미드의 혼합 (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µ g (Tol2 키트 #302) p3E-polyA의 및 pDestTol2pA2의 150 µ g (Tol2 키트 #394). 8 µ L 총 볼륨 조정 튜브 1.5 mL microcentrifuge TE 버퍼 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)를 사용 하 고 2-5 s 간단한 소용돌이 의해 잘 혼합. 그런 다음 LR Clonase 2 플러스, 2 µ L을 추가 하 고 품 어 하룻밤 실 온에서 반응.</li>
		<li>두 번째 날, 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 반응에 가수분해 K의 1 µ L을 추가 하 고 품 어 30 분 동안 37 ° C에서 반응.</li>
		<li>변환을 수행 하 고 (단계 1.1.7-11) 위에서 설명한 대로 긍정적인 클론을 식별 합니다.</li>
		<li>시퀀싱의 DNA 농도 측정 pDestTol2-유비-ASAP1 복제 (그림 1B)15분 광 광도 계 사용 하 여 확인 합니다. 일반적으로 농도 200ng / µ L입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tol2 Transposase mRNA와 주입 솔루션 준비
<ol><li>행진 대장균 글리세롤 주식에 있는 파운드 판 (100 µ g/mL 암 피 실린) pCS2FA transposase 플라스 미드 (Tol2 키트 #396)의 멸 균된 접종 루프를 사용 하 여. 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. 다음 날, 단일 식민지를 선택 하 고 멸 균된 10 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 그것의 파운드 (100 µ g/mL 암 피 실린) 3 mL에 접종. 하룻밤 250 rpm의 회전 속도 함께 통에 37 ° C에서 문화.</li>
	<li>그것의 사용 설명서에 따라 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 대장균 문화에 miniprep를 수행 합니다. 1 분 14000 rpm에서 원심 분리기로 TE 버퍼의 30-50 µ L에 플라스 미드 DNA elute 그리고 DNA 농도 분 광 광도 측정.</li>
	<li>내가 가진 플라스 미드의 1-2 µ g endonuclease 선형화 하 고 정화 청소 키트 후 하지의 사용 설명서를 다음 DNA와 DNA 소화. 14000 rpm에서 1 분간 centrifuging 여 물 5 µ L로 DNA를 elute. 에 대 한 예상된 농도 200-300 ng / µ L.</li>
	<li>녹음 방송 생체 외에서 수행 하지 나 상업 SP6 전송 키트를 사용 하 여 DNA 템플렛으로 pCS2FA transposase를 선형화.</li>
	<li>반응이 완료 되 면 Tol2 transposase mRNA 상업적인 RNA 청소를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 장비를 정화. 마지막으로, 20 µ L RNAase 무료 물으로 mRNA elute 고는 분 광 광도 계에 RNA 농도 측정 한다. 에 대 한 예상된 농도 1-3 µ g / µ L. 견본-80 ° C 냉동 실에 저장할 수 있습니다 필요한 경우.</li>
	<li>20 ng / µ L pDestTol2-유비를 혼합 하 여 microinjection 솔루션 준비-ASAP1 및 Tol2 transposase mRNA (100 ng / µ L) pipetting으로 microcentrifuge 관에서. 반복 해빙과 튜브 당 거, aliquot 6 µ L로 인 한 핵 산 저하를 방지 하려면 나중에 사용-80 ° C 냉동 고에 보관.</li>
</ol>3입니다. microinjection
<ol><li>주입 하기 전에 오후 4-6 번 식 탱크 2 남성 및 2 명의 여성을 설정 합니다. 이 물고기는 오후에 먹여야 하지 해야 합니다. 이 단계 물고기 낭비의 양을 줄일 하 고 다음날 아침 또한 번 식 응답을 유도 하는 동시에 밖으로 그들을 청소 하는 시간을 절약할 것 이다.</li>
	<li>다음 아침, 제거 준비 주입 솔루션 (pDestTol2-유비-ASAP1 구문 및 Tol2 mRNA)-80 ° C 냉동 고에서 얼음에 놓습니다.</li>
	<li>물고기 사육 탱크에에서 디바이 더를 당겨 하 고 물고기 친구를 허용 합니다. 일반적으로, 생선 알을 꺼내 구분선 후 20-30 분 이내. 그렇지 않은 경우 1-2 시간 이상 기다립니다. 일부 물고기 계란을 전혀 놓지 않을 수 있습니다. 이 경우에, 물고기 배아 컬렉션에 대 한이 실험을 반복 합니다.</li>
	<li>기다리는 동안, 거기에 바늘 팁 겸 자, 또는 섬세 한 작업와이 퍼에 침입 하 여 3d 가장자리를 만드는 각도에 깨진 준비 있는지 확인 합니다.<ol>
<li>다음 매개 변수를 사용 하 여 micropipette 끌어당기는 사람에 유리 모 세관에서 바늘을 당겨: 545;가 열 풀 60; 속도 80; 시간 250; 압력 500입니다. 각도 약 45 °에는 집게를 잡고 집게 (직경 추정에 대 한 눈 조각 통치자)와 절 개 범위 아래와 바늘을 휴식. 원하는 바늘 직경 microinjector 설정에 따라 변수가 될 수 있습니다 하지만 작은 직경은 태아 사망률 감소에 대 한 선호.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단 물고기는 계란, 10 cm 직경 페 트리 접시에에서 그들을 수집 하 고 절 개 범위에 그들을. 모든 비정상적인 배아를 제거 하 고 폐기물을 물고기.</li>
	<li>피펫으로 준비 3 %agarose 주입으로 수정 된 배아 금형. 장소에 배아를 유지할 수 있도록 초과 물을 제거 합니다.</li>
	<li>일단 모든 행 가능한 배아 가득 정렬 있도록 모든 단일 셀 약 45 ° 각도 수평으로 바늘을 향해 같은 방향으로 얼굴. 이것을 쉽게 주입 훨씬 나중.</li>
	<li>장갑을 끼고, 동안 20 µ L 로드 피펫으로 사용 팁과 얼음에 튜브에서 준비 된 구문 5 µ L를 제거.</li>
	<li>신중 하 게 그것은 팁에 가까운 시를 얻을로 꼭지를 시작 하는 위치에 있는 모든 방법이 깨진된 모 세관 튜브의 백 엔드에 팁을 삽입 합니다. 경우 여전히 공기 방울, 바늘, 팁을 아프게 하지를 흔들.</li>
	<li>Microinjection 바늘 홀더 연속으로 바늘을 삽입 하 고 바늘 자리에 유지 될 때까지 신중 하 게 강화. 약 45 ° 각도 조정 합니다.</li>
	<li>일단 바늘 준비 하 고 연결, 현미경 및 가스 압력 탱크를 켭니다. 상업 CO2 탱크는이 목적을 위해 일반적으로 좋다. 지주 및 방출 압력에 의해 분사 볼륨 조정: 대략 0.5 psi 지주 및 방출에 대 한 30 psi. 솔루션 때 페달을 누르면 밖으로 나오는 것을 확인 해야 합니다.</li>
	<li>~ 150 µ m 직경에서 솔루션의 흐름과 볼륨 조정 미네랄 오일의 방울으로 무대 마이크로미터를 사용 하 여 (약 2 nL). 백 프레셔 바늘의 똑 작은 금액을 드릴 것입니다 확인 하십시오. 충분히 다시 압력 없는 경우 모 세관 작용 액체 바늘을 입력 하는 mRNA를 파괴 하면 됩니다.</li>
	<li>일단 바늘 보정, 수정 된 배아의 단일 셀에는 구조 주입 시작. 참고:이 연습, 인 내, 그리고 기교, 피어스 하드 되 세포 막 때문에 많은 양의 걸립니다. 그것은 셀, 아니라 노 른 자, 유전자 변형 zebrafish를 생성 하기 위한 솔루션을 주입 하는 것이 중요입니다. 이 morpholino 주입에 다릅니다. 그것은 어느 쪽 바늘 입력 셀 구성 셀에가 하는 만큼 중요 하지 않습니다. 노 른 자는 셀에 주입 하는 경우는 transgenesis 성공의 매우 낮은 속도 할 것 이다. 단일 셀 단계 주입은 또한 중요 하다, 또는 체세포 키메라 물고기를 만들 것입니다. 이 세균 세포에 들어가는 transgene의 가능성을 줄일 것 이다.</li>
	<li>젤 노치의 가장자리를 사용 하 여 제공 하는 장소에서 태아를 유지 및 태아를 이동 하지 않고 압력을 적용 하 니 백업. 일단 바늘의 팁 단일 셀에 원하는 양의 솔루션 출시 페달을 누릅니다. 배아의 모든에 대해이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>완료 되 면, 물고기 시스템 물과 일회용 3.4 mL 전송 피 펫 agarose 노치에서 그들을 rinsing 하 여 레이블이 지정 된 그릇에 주입 된 배아를 전송. 그들이 개발 하는 28.5 ° C 인큐베이터에 배아를 저장 합니다. 죽은 물고기 배아를 제거 하는 하루 동안 다시 확인 하 고 0.1% 메 틸 렌 블루 물고기 물에서 물을 바꿉니다.</li>
	<li>주입 후 약 6-8 시간 걸릴 10 개인 주입 배아 물고기 고18인가요 메서드 사용 하 여 그들에서 게놈 DNA를 준비 합니다.</li>
	<li>다음 아침, 비 노 른 자 조직에 GFP를 보여주는 배아 밖으로 정렬 하려면 형광 광원으로 해 부 현미경을 사용 합니다. 이러한 물고기 배아 삽입 된 구문을 포함 해야 합니다.</li>
	<li>Tol2 소비 분석 결과 확인 앞에서 설명한19transposon 활동을 수행 합니다. 삭제 플라스 미드를 감지할 수 있습니다, 유지는 삽입 된 배아를 물고기와 그들을 인상. 아니 삭제 플라스 미드는 검출 될 수 있다, Tol2 소비 분석 결과의 긍정적인 결과 얻을 때까지 Tol2 mRNA 합성 및 microinjection 프로세스를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 유전자 변형 ASAP1 물고기, 안내 설정 (ubi: ASAP1)
<ol><li>앞에서 설명한 zebrafish 책20에서 성인 기에 주입 된 물고기를 (F0 세대)를 올립니다. 이 일반적으로 약 4 개월 걸립니다.</li>
	<li>단일 성인 F0 물고기 고 성별 wildtype 물고기 반대 한 번으로 교차. 나중에 번 식 후 물고기 배아를 수집 합니다. 물고기에서 28.5 ° C 배양 기에서 수집한 물고기 배아 0.1% 메 틸 렌 블루 물 유지.</li>
	<li>제 3의 날에 GFP 필터 형광 해 부 현미경 아래 물고기 배아를 확인 합니다. 있을 경우, 초록 물고기 배아 밖으로 정렬 하 고 F1 세대 유전자 변형 물고기, Tg 성인이 그들을 인상 (ubi: ASAP1). 참고: 이후 부모의 F0 물고기의 대부분은 세균 선 유전자 키메라 Mendelian 비율 예상 하지는.</li>
	<li>크로스 wildtype 물고기와 단일 F1 성인 물고기 고 물고기 배아를 수집 합니다. 초록 물고기 배아 밖으로 정렬 하 고 F2 세대 생선으로 성인 기에 발생. 참고: 녹색과 비 그린 물고기 배아 가까이 있어야 한다 1:1 단일 transgene 인지.</li>
	<li>악성 말 초 신경 칼 집 종양 (MPNST) 같은 종양에서 전기 잠재적인 변화를 보려면 F2 세대 Tg 크로스 (ubi: ASAP1) rpl35hi258/wt 물고기와 물고기. 보이는 종양 6-8 달 오래 된 성인21,22에서 찾을 수 시작을 알려졌다.</li>
</ol>5입니다. 영상
<ol><li>Zebrafish 태아 이미지, 여러 F2 세대 설립자 물고기 고 개별 쌍에서 wildtype 물고기와 그들을 교차 하는 것 하. 준비 가이드23zebrafish에 따르면 다른 원하는 발달 단계에서 물고기 배아를 수집 합니다.</li>
	<li>물고기 배아의 초기 단계에 대 한 껍질 하 고 신중 하 게 집게의 쌍을 사용 하 여 10 cm 직경 물고기 시스템 물으로 페 트리 접시에에서 절 개 범위에서 배아의 chorions를 제거 합니다.</li>
	<li>3.4 mL 처분할 수 있는 이동 피 펫을 사용 하 여 3% 스와 concaved 유리 슬라이드에 몇 가지 물고기 배아를 전송 합니다. 배아는 형광 절 개 범위 아래 바늘을 사용 하 여 셀룰러 GFP 활동을 볼 수 원하는 위치를 조정 합니다.</li>
	<li>물고기의 이동 단계 배아 (12 somite 단계 보다 더 오래 된), 0.05% tricaine mesylate 물고기 배아 슬라이드에 그들을 전송 하기 전에 anesthetize를 사용 합니다. 간단히, 그들은 수영, 손실 신체 균형을 멈출 때까지 물고기 배아 물고기 물에서 0.05% tricaine mesylate에 등장 했다. 또한, 슬라이드에는 스와 0.05% tricaine mesylate 방울을 추가 합니다.</li>
	<li>미만 12 somite 무대 물고기 배아에 대 한 호환 카메라와 소프트웨어 피 형광 화합물 현미경을 사용 하 여 이미징. 12 somite 무대 물고기 배아 보다 오래 된에 대 한 형광 해 부 현미경을 사용 합니다.</li>
	<li>종양 세포 전압 이미지, 먼저 MPNST 종양 물고기를 식별. 그런 다음 anesthetize 0.05% tricaine mesylate와 물고기. 전체 산에 대 한 이미징, 10 cm 직경 페 트리 접시에 생선을 넣어. 종양 세포 전기 활동을 보려면 물고기 종양 수 수 해 부 밖으로 전체 마운트 영상 후.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

있지만 세포와 조직 수준의 전기 활동 배아 개발 및 인간 질병 동안 오래 전에 발견 되었다, vivo에서 동적 전기 변화 및 그들의 생물학 역할 여전히 남아 크게 알 수 없는. 주요 과제 중 하나는 시각화 하 고 계량 전기 변화입니다. 단일 셀을 추적 하기 위한 휴식 통해 패치 클램프 기술 이다 하지만 그들은 많은 세포의 구성 되어 있기 때문에 척추 동물 배아의 응용 제한 됩니다. 현재 화학 전압 염료는도 그들의 감도, 특이성, 및 독성 이상적 없습니다. GEVIs의 발명품에 최근 노력 vivo에서 세포 전기 활동을 시각화 하는 새로운 경로 제공 하 고 실시간으로. 여기, 우리가 zebrafish 전기 기자 선, Tg를 만드는 과정을 보여주었다 (ubi:ASAP1).
이 기자 물고기 라인을 사용 하 여, 우리 zebrafish 태아에 있는 세포 전기 활동을 모니터링할 수 있습니다을 보여줍니다. 높은 전기 전압 변화는 초기 미 발달 ...

전기 이온 채널과1세포 막 있는 펌프에 의해 중재 생 전기 신호를 말합니다. 세포 막과 결합 된 전기 잠재력과 현재 변화, 이온 교환 프로세스 고르기 신경 및 근육 세포의 신호에 대 한 필수적입니다. 또한, 전기 및 이온 기온 변화도 다른 중요 한 생물 학적 기능 에너지 저장, 생 합성, 대사 산물 수송 등의 다양 한이 있다. 생체 전기 신호도 몸 축, 세포 주기, 세포 감 별 법1등 미 발달 패턴 형성의 레 귤 레이 터로 발견 되었다. 따라서, 그것은 이러한 유형의 신호의 미 규제에 기인 하 많은 인간의 선 천 성 질병을 이해 중요 합니다. 패치 클램프 널리 사용 되었습니다 단일 셀 기록, 배아 발달 비보중 여러 셀의 동시 모니터링에 이상적에서 멀리 아직도 이다. 또한, 전압 민감한 작은 분자는 또한 그들의 특이성, 감도, 및 독성 vivo에서 애플리케이션에 적합 하지.
창조의 다양 한 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs) 제공이이 문제를 극복 하기 위해 새로운 메커니즘이 인코딩되고 그들은 원래 신경 모니터링 위한 했다 비록 배아 개발 공부를 쉽게 응용 프로그램에 대 한 허용 2,3세포. 현재 사용할 수 있는 GEVIs 중 하나는 가속 센서의 활동 전위 1 (ASAP1)4입니다. 그것은 전압 과민 한 인산 가수분해 효소와 원형으로 배치 된 녹색 형광 단백질의 전압 감지 도메인의 extracellular 루프의 구성 됩니다. 따라서, ASAP1 세포 전기 잠재적인 변화의 시각화 수 (분극: 밝은 녹색; 도발은: 진한 녹색). ASAP1 속도 론 온 오프 2 ms, 있으며 subthreshold 잠재적인 변경4를 추적할 수 있습니다. 따라서,이 유전 도구 라이브 셀에 실시간 생체 모니터링에 효능의 새로운 수준에 대 한 수 있습니다. 배아 발달에 많은 인간 질병, 암, 등 전기의 역할의 더 이해 것입니다 창 고 기본 메커니즘에 새로운 빛이는 질병 치료 및 예방에 매우 중요.
Zebrafish 강력한 동물 모델 개발 생물학과 암5,6을 포함 하 여 인간의 질병을 입증 되었습니다. 인간, 70 %orthologous 유전자를 공유 하는 그들은 그리고 그들은 유사한 척 추가 있는 생물학7. Zebrafish는 비교적 쉽게 치료, 계란, 온순한 유전학, 쉬운 transgenesis, 그리고 투명 한 외부 배아 발달, 그들에 게 비보에 이미징5,6우수한 시스템의 큰 클러치 크기를 제공 합니다. 이미 존재 하는 돌연변이 물고기 선의 큰 소스와 완전히 시퀀스 게놈, zebrafish는 과학적 발견의 상대적으로 무제한 범위를 제공 합니다.
Vivo에서 실시간 전기 세포의 활동을 조사, 우리 활용 zebrafish 모델 시스템 및 ASAP1. 이 문서에서 우리는 형광 전압 바이오 센서 ASAP1 Tol2 transposon transgenesis를 사용 하 여 zebrafish 게놈으로 통합 하는 방법을 설명 하 고 배아 개발, 물고기 애벌레 움직임, 그리고 라이브 종양에서 세포 전기 활동을 시각화 .

<table><tbody><tr><td>14mL 세포 배양 튜브</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td>대장균 배양</td></tr><tr><td>아가로스 전기영동 탱크</td><td>Thermo Scientific</td><td>Owl B2</td><td>DNA 전기영동</td></tr><tr><td>아가로스 RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>주입 젤</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F 프라이머</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA</td><td>서브클로닝을 위한 ASAP1 코딩 영역 증폭</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R 프라이머</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td><td>서브클로닝을 위한 ASAP1 코딩 영역 증폭</td></tr><tr><td>명시야 해부 스코프</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>데코리오네이션, 미세주입,</td></tr><tr><td>마운트 컬러 카메라</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>Fish embryo 이미지 기록</td></tr><tr><td>오목 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>이미징 프로세스 중 물고기 배아 유지용</td></tr><tr><td>일회용 전달 피펫 3.4 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>물고기 배아 및 물 전달</td></tr><tr><td>엔도뉴클레아제 효소, Not I</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td>플라스미드 DNA</td></tr><tr><td>에피푸오레성 화합물 스코프</td> 선형화용 <td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>Fish 배아 이미징</td></tr><tr><td>Epifuorescent stereo dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>Fish embryo imaging</td></tr><tr><td>형광 광원</td><td>Lumen dynamics</td><td>X-cite seris 120</td><td>형광 현미경용 광원</td></tr><tr><td>겸자 #5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Dechorionation and needle breaking</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzyme mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>Gateway BP 재조합 클로닝</td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Plus 효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Gateway LR 재조합 클로닝</td></tr><tr><td>겔 DNA 회수 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td>DNA 겔 정제</td></tr><tr><td>로딩 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>모세혈 바늘에 주입액 로딩용</td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스(1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>물고기 배아 장착</td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>페트리 접시의 곰팡이 발생 억제</td></tr><tr><td>미세 사출 금형</td><td>적응 과학 도구</td><td>TU-1</td><td>주입 중 물고기 배아를 보관하기 위한 아가르제 금형 트레이를 준비하기 위해</td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>WPI</td><td>공압 피코 펌프 PV820</td><td>마이크로사출 인젝터</td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터</td><td>WPI</td><td>마이크로인젝터 MM3301R</td><td>마이크로인젝션 작동</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td>모세관 바늘 준비용</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>주입량 교정용</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1340</td><td>mRNA 체외 전사</td></tr><tr><td>단색 카메라</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>물고기 배아 이미지 기록</td></tr><tr><td>플라스미드 Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>소량의 플라스미드 DNA</td></tr><tr><td>준비 플라스틱 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>이미징 프로세스 중 물고기 또는 물고기 배아 보관용</td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>mRNA 세척 후 체외 전사</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>DNA 및 RNA 농도 측정용</td></tr><tr><td>스테이지 마이크로미터</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>미세주입 부피 보정</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>유전자 복제를 위한 DNA 증폭</td></tr><tr><td>얇은 벽 유리 모세관</td><td></td><td>WPI TW100F-4</td><td>원숭이 바늘</td></tr><tr><td>Tol2-exL1 프라이머</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td><td>Tol2 소비세 분석</td></tr><tr><td>Tol2-exR 프라이머</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td><td>Tol2 소비세 분석</td></tr><tr><td>TOP10 화학적으로 유능한 대장균</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404006</td><td>유전자 클로닝</td></tr> <tr><td>중 형질전환에 사용트리카인 메실레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5040</td><td>물고기 또는 물고기 배아 마취용</td></tr><tr><td>UV 트랜스 일루미네이터 302nm</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>DNA 시각화</td></tr><tr><td>수조</td><td>Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>유전자 클로닝의 형질전환 과정용</td></tr></tbody></table>

zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

전기, 내 생 전기적 신호 이온 채널에 의해 중재 및 세포 막에 있는 펌프 고르기 신경 및 근육 세포의 프로세스와 같은 다른 많은 생물 학적 과정, 신호에 중요 한 역할 배아 개발 패턴입니다. 그러나, vivo에서 전기 활동 모니터링 척추 embryogenesis에 대 한 필요가 있다. 인코딩된 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs)의 진보는이 전에 대 한 솔루션을 제공할 수 만들었습니다. 여기, 우리 유전자 변형 전압 표시기 zebrafish 설립된 전압 표시기, ASAP1를 사용 하 여 만드는 방법에 설명 (가속 센서의 활동 전위 1), 예를 들어. Tol2 키트와 유비 쿼터 스 zebrafish 발기인, ubi, 이 연구에서 선정 됐다. 우리는 또한 게이트웨이 사이트 복제, Tol2 transposon 기반 zebrafish transgenesis, 그리고 일반 epifluorescent 현미경을 사용 하 여 초기 단계 물고기 배아와 물고기 종양에 대 한 이미징 프로세스의 프로세스를 설명 합니다. 이 물고기 라인을 사용 하 여, 우리는 제 브라 embryogenesis, 그리고 물고기 애벌레 운동 하는 동안 세포 전기 전압 변화는 발견. 또한, 몇 가지 zebrafish 악성 말 초 신경 칼 집 종양, 셀은 일반적으로 편광 종양 주변 정상 조직에 비해 관찰 되었다.

성공적인 주입, 주입 50% 물고기 배아는 체세포에 녹색 형광의 어느 정도 표시 됩니다 그리고 그들의 대부분은 Tol2 transposon 소비 분석 결과 (그림 2)에 의해 긍정적인 것 보다 더 많은. 후 2-4 세대-wildtype 물고기 (까지 형광 물고기 도달 예상된 Mendelian 비율 50%)와 교차, 유전자 변형 물고기 배아 개발 하는 동안 세포 막 잠재력을 추적 하기 위해 이미징 실험을 위해 사용 되었다. 첫째, 막 잠재적인 변경 zebrafish 초기 배아 발달 단계 동안 세포 주기 동안 시험 되었다. 세포 분열 밭 고 랑 형성 (-3C,그림 3A와 보조 비디오 1) 전에 hyperpolarized 관찰 되었다. 또한, 다른 조직 했다 막 잠재력의 다양 한 1 ~ 3 일에 오래 된 물고기...

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

이 절차의 전반적인 목표는 배발생, 유충 이동 및 종양 발생 중에 세포의 전기적 변화를 관찰할 수 있는 형질전환 제브라피시 계통을 만드는 것입니다. 이 방법은 발생 생물학, 생리학 및 암세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 배발생 및 종양 세포에서 세포 전기 신호의 근본적인 역할은 무엇입니까? 이 기술의 가장 큰 장점은 생체 내에서 실시간으로 세포 전기 신호를 추적할 수 있다는 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 Tol2 transposase mRNA와 주사 용액을 준비한 후, 주사 전 오후에 최소 2마리의 수컷과 2마리의 암컷으로 4-6개의 사육 탱크를 설정했습니다. 물고기의 배설물을 줄이고 번식 반응을 유도하려면 오후에 물고기에게 먹이를 주지 마십시오. 다음날 아침, 섭씨 80도의 음극 냉동고에서 준비된 주입 용액을 꺼내 얼음 위에 놓습니다.물고기 사육 탱크의 칸막이를 당기고 물고기가 짝짓기를 할 수 있도록 합니다. 일반적으로 물고기는 20-30분 이내에 알을 낳습니다. 기다리는 동안 다음 매개 변수를 가진 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 모세관 유리에서 바늘을 당깁니다.실험실용 물티슈를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨리고 비스듬한 가장자리를 만듭니다. 배아 사망률을 줄이기 위해 더 작은 직경이 선호됩니다. 물고기가 알을 낳으면 직경 10cm의 페트리 접시에 모읍니다.해부 현미경 바로 아래에서 모든 비정상적인 배아와 물고기 배설물을 제거합니다. 그런 다음 수정된 배아를 준비된 3% 아가로스 사출 금형에 피펫으로 넣습니다. 배아가 제자리에 고정되도록 여분의 물을 제거하십시오.모든 줄이 생존 가능한 배아로 채워지면 단일 세포가 모두 바늘에 대해 수평으로 45도 각도를 향하도록 배열합니다. 이렇게 하면 나중에 주입이 훨씬 쉬워집니다. 다음으로, 장갑을 낀 상태에서 20마이크로리터 로딩 피펫 팁을 사용하여 얼음 위의 튜브에서 준비된 구조물 5마이크로리터를 제거합니다.피펫 팁을 부러진 모세관 뒤쪽 끝에 조심스럽게 삽입하여 테이퍼가 시작되는 곳까지 시약을 팁에 최대한 가깝게 만들고 모세관으로 배출합니다. 그래도 기포가 남아 있으면 끝이 부러지지 않도록 바늘을 흔듭니다. 바늘을 마이크로 주사 바늘 홀더에 똑바로 삽입하고 바늘이 제자리에 고정될 때까지 조심스럽게 조입니다.그런 다음 각도를 약 45도로 조정합니다. 바늘이 준비되고 부착되면 현미경과 가스 압력 탱크를 켭니다. 유지에는 약 0.5PSI, 배출에는 30PSI를 사용하여 주입량을 조정합니다.페달을 밟을 때 바늘에서 용액이 나오는지 확인하십시오. 미네랄 오일 한 방울이 있는 스테이지 마이크로미터를 사용하여 용액의 부피와 흐름을 직경이 약 10마이크로미터로 조정합니다. 배압으로 인해 소량의 용액이 바늘에서 떨어질 수 있는지 확인하십시오.배압이 충분하지 않으면 모세관 작용으로 인해 액체가 바늘에 들어가 mRNA를 파괴합니다. 바늘이 보정되면 겔 노치의 가장자리를 사용하여 수정된 배아의 단일 세포에 바늘을 삽입하여 배아를 제자리에 유지하고 배아를 움직이지 않고 바늘이 압력을 가할 수 있도록 하는 지지대를 제공합니다. 바늘 끝이 단일 셀에 들어가면 페달을 밟아 원하는 양의 용액을 방출합니다.형질전환 제브라피시를 생성하기 위해 난황이 아닌 세포에 용액을 주입하는 것이 중요합니다. 모든 배아에 대해 이 과정을 반복합니다. 완료되면 폐기 3.4ml 전사 피펫과 물고기 시스템 물을 사용하여 주입된 배아를 아가로스 노치에서 헹궈 라벨이 부착된 접시로 옮깁니다.배아를 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 보관하여 배아가 발달할 수 있도록 합니다. 하루 종일 다시 확인하여 죽은 물고기 배아를 제거하고 물고기 물에서 물을 0.1% 메틸렌 블루로 교체하십시오. 주입 후 약 6-8시간 후에 주입된 어류 배아 10개와 핫샷 방법을 사용하여 게놈 DNA를 준비합니다.다음 날 아침, 형광등이 있는 해부 현미경을 사용하여 난황이 아닌 조직에서 GFP를 보이는 배아를 분류합니다. 이러한 배아는 주입된 구조체를 포함해야 합니다. Tol2 excise assay를 수행하여 앞에서 설명한 대로 transposon 활성을 확인합니다.절제된 혈장이 검출될 수 있는 경우는, 주입된 어류 배아를 보관하고 배양한다. 그렇지 않으면 Tol2 소비세 분석에서 긍정적인 결과를 얻을 때까지 Tol2 mRNA 합성 및 마이크로 주입 프로세스를 반복합니다. 제브라피시 배아를 이미지화하기 위해, 야생형 물고기와 개별 쌍으로 다중 F2 세대 창시자 물고기를 교차시킵니다.제브라피시 스테이징 가이드에 따라 원하는 다양한 발달 단계에서 물고기 배아를 수집합니다. 어류 시스템 물에 있는 초기 단계의 어류 배아의 경우 해부 범위 아래에서 한 쌍의 집게를 사용하여 융모막을 조심스럽게 껍질을 벗기고 제거합니다. 폐기 이송 피펫을 사용하여 몇 개의 배아를 3% 메틸셀룰로오스가 함유된 오목한 유리 슬라이드로 옮깁니다.그런 다음 해부 내시경 아래의 바늘을 사용하여 배아를 원하는 위치로 조정하여 세포 GFP 활동을 확인합니다. 12 somite 미만 단계에 있는 배아의 경우, 호환 가능한 카메라 및 이미징 소프트웨어와 함께 epifluorescence compound microscope를 사용하십시오. 12 somite 단계를 지난 배아의 경우 형광 해부 현미경을 사용합니다.종양 세포 전압을 이미지화하려면 먼저 악성 말초 신경초 종양 또는 MPNST가 있는 물고기를 식별합니다. 물고기를 직경 10cm의 페트리 접시에 넣고 전체 마운트 이미징을 수행합니다. 마지막으로 이미징 후 종양 세포의 전기적 활동을 보기 전에 종양을 해부합니다.성공적인 주입에서는 주입된 배아의 50% 이상이 체세포에서 어느 정도의 GFP를 나타내고 대부분은 Tol2 transposon excise assay에서 긍정적인 결과를 보여줍니다. 여기에서 제브라피시 초기 배아 발달 동안 세포주기 전반에 걸쳐 막 전위 변화를 조사했습니다. 이 타임랩스 비디오에서 볼 수 있듯이, 세포는 분열 고랑이 형성되기 전에 과분극되었습니다.더욱이, 서로 다른 조직들은 1일에서 3일 된 물고기 배아에서 다양한 막 전위를 보여주었다. 예를 들어, 솜씨(somite)와 노토코드(notocord)는 일반적으로 인접한 조직과 장기에 비해 과분극되어 있었다. 이 생후 이틀 된 물고기 배아에서는 움직이는 동안 신경근의 전기 활동이 나타나며 전기 신호 전달에 해당하는 색 밀도 변화가 나타납니다.암세포의 생체전기적 특성을 자발적인 MPNST에 취약한 RPL35 돌연변이가 있는 ASAP1 리포터 어류의 교배종에서 조사했습니다. 주변 조직과 비교했을 때, 종양 세포는 더 편광되어 있었습니다. 이 마이크로 주입 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 이상적인 결과를 얻으려면 제브라피시 배아가 단일 세포 단계에 있어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 발전으로 발생 생물학 및 세포 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시 및 기타 모델 유기체의 생체 내 전기 신호 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마이크로 주입으로 형질전환 제브라피시 라인을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

출처: Williams, A. L., et al. 실시간 발달을 시각화하기 위한 다광자 타임랩스 이미징: 제브라피시 배아에서 이동하는 신경 능선 세포의 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 제브라피시 배아의 신경능선 세포의 이동을 고해상도로 실시간으로 시각화하기 위한 다광자 타임 랩스 이미징 프로토콜을 보여줍니다.

다광자 타임랩스 이미징을 사용한 제브라피시 배아의 신경능선세포 이동 시각화

애벌레의 zebrafish forebrain에서 세포 필드 잠재력을 기록하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 강력한를...

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

여기에 설명된 프로토콜은 관심 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 유전자 인코딩 전압 지시기(GEVI)와 함께 생체 내 시스템에서 제브라피시 배아를 사용하여 가장 비침습적인 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구할 수 있도록 합니다.

살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

여기에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 GCaMP 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 뇌 영역에서 신경 활동을 조사하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점 형광 이미징

배우세요 제브라피시 초기 배아에서 종양 세포의 전기 활동을 실시간으로 시각화하는 방법을. Tol2 트랜스포존을 이용한 형질전환 기술로 발달생물학과 암 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

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