Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi

Kompleman tükenmesi, bağışıklık hücresi popülasyonlarını saflaştırmak için hızlı, etkili ve ucuz bir yöntemdir. Kompleman tükenmesi, belirli bir hücre tipini hedef alan bir hücre popülasyonuna monoklonal IGM veya IgG antikorları eklendiğinde başlar. Bu örnekte, tükenme için T hücrelerini hedefleyeceğiz.

Kompleman sistemi daha sonra eklenir ve T hücresi ölümü ile sonuçlanan bir proteolitik kaskad başlatılır. Hücre popülasyonu daha sonra ölü hücreleri ve kalıntıları ortadan kaldırmak için santrifüjle yıkanır ve filtrelenir. Bu kompleman tükenme yöntemi tipik olarak hedeflenen hücre popülasyonunun% 95 ila% 100'ünün ortadan kaldırılmasıyla sonuçlanır.

Merhaba, ben Bonnie Dittle. Milwaukee'de bulunan Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü Kan Merkezi'nde araştırmacıyım. Bugün size tekniği göstereceğim tamamlayıcı tükenme, belirli hücre popülasyonlarının tükenmesi için hızlı ve ucuz bir yöntem.

Bu tekniği laboratuvarımda, daha sonra hücre aktivasyonu ve protein ekspresyon analizini içerenler de dahil olmak üzere bir dizi biyo-tahlil için kullandığımız bağışıklık hücresi popülasyonlarını yüksek oranda zenginleştirmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Deneye başlamadan önce, 0.5 veya bir mililitre tavşan tamamlayıcısı hazırlayın ve eksi 20 veya eksi 80 derecelik bir dondurucuda saklayın.

Tamamlayıcıyı bir ila 10 ve bir ila 20 arasında optimum bir seyreltme kadar titre ettiğinizden emin olun. Rutin olarak kullandığımız kompleman için mükemmel bir ticari kaynak Pereze biyolojiklerindendir, bu prosedür için fare ve rap monoklonal antikorları genellikle kompleman aktivasyonunda etkilidir, ancak tüm antikorlar uygun olmayacaktır. IgM antikorları genellikle kompleman kaynaklı hücre lizizi için en etkili olanlardır.

IgG antikorları ikinci en verimli olanıdır ve tipik olarak kullanılır, çünkü çoğu monoklonal antikor, ampirik olarak belirlenen mililitre başına 10 ila yedinci hücre hücre yoğunluğunda optimal kullanım için her bir antikoru IgG titretir. Çoğu antikor, mililitre başına 0.1 ila 10 mikrogram aralığında kullanılır. Splenik T hücrelerinin tükenmesi için, TH'ye özgü bir monoklonal antikor kullanıyoruz.

Kompleman tükenmesini başlatmak için, hücreleri% 5 ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu içeren hücre kültürü ortamındaki hücreleri, başlangıç hücre popülasyonu mililitre başına iki kez 10 ila yedinci hücre olacak şekilde seyreltin. Örneğin, beş kez 10 ila yedinci hücreler 2.5 mililitre ortamda seyreltilmelidir. Bu hücre hacmi, son hacmin yarısıdır ve dolayısıyla tükenme sırasında kullanılan hücre konsantrasyonunun iki katıdır, bu da mililitre başına 10 ila yedi hücre olacaktır.

Şu anda, deneyin sonunda tükenmenin ölçülebilmesi için altı hücreye 10 kata kadar tasarruf edin. Ek olarak, gerekli miktarda tamamlayıcıyı oda sıcaklığında çözdürün. Beş kez 10 ila yedi hücre için perez biyolojik tavşan tamamlayıcısı kullanıldığında bir ila 15 arasında bir seyreltmenin uygun olduğunu bulduk, 1.5 mililitre donmuş Eloqua yeterlidir.

Şimdi hücre süspansiyonuna uygun miktarda antikor ekleyin ve karıştırın. Tamamlayıcıyı sterilize etmek için, düşük proteinli bağlayıcı bir şırınga ucu filtresi kullanın. Şırıngayı bir ila iki mililitre orta ile doldurun.

Yedi hücreye beş kez 10 kez tamamlayıcı eklemeden önce, bir ila 15 seyreltme için 340 mililitre tamamlayıcıya ihtiyacımız olacak. Daha sonra komplemanı doğrudan hücreleri ve antikoru içeren tüpe süzün. Şimdi tüpteki son hacmi, hücreler mililitre başına 10 ila yedinci hücre konsantrasyonunda olacak şekilde ayarlayın.

Daha sonra, hücrelerin bir saat boyunca bir su banyosunda 37 santigrat derecede inkübe etmesine izin verin. Hücreleri her 15 dakikada bir hafifçe ters çevirerek karıştırmayı unutmayın. İnkübasyondan sonra, hücreleri canlılığı etkilemeyecek bir hızda santrifüj edin.

Sonra kaputa geri dönün, süpernatanı atın. Daha sonra, hücreleri iki kez 10 mililitre ortamla yıkayın. Hücre kalıntılarının nasıl toplandığına ve bir kısmının polistiren tüplerin kenarlarına yapıştığına dikkat edin.

Son yıkamadan sonra, hücreleri 70 mikron steril bir naylon hücre süzgecinden süzün. Son olarak, hücre saflığını kontrol edin. Tükenme akışından önce ve sonra ilgilenilen hücre popülasyonunu karşılaştırarak.

Sitometri ve immünohistokimya, deney öncesi hücre saflığını belirlemek için tercih edilen yöntemlerdir. Komplemanı aktive etmede oldukça etkili olan bir monoklonal antikor kullanıldığında, kompleman tükenmesinin ilk turu hücreleri %95'ten fazla tüketecektirÖrnek olarak, bir fare ple sit hücresi preparatındaki alfa beta T hücrelerinin yüzdesini ölçmek için akış sitometrisi kullanarak, anti beş bir ile kompleman tükenmesini takiben% 32.2 alfa beta T hücresi içerdiklerini bulduk, tüm T hücreleri tarafından eksprese edilir, ancak diğer lökositler tarafından eksprese edilmez. TCR beta popülasyonu %95 oranında azaltılarak %1.56'lık bir nihai konsantrasyona düşürüldü.

Kompleman tükenmesinde antijene özgü antikorlar kullanarak belirli hücre popülasyonlarını tüketmenin hızlı ve etkili bir yöntemini gösterdim. Bu prosedürü yaparken, başlamadan önce her bir antikoru etkinlik açısından test etmeyi ve tamamlayıcınızı bir pilot deneyde titre etmeyi unutmayın. Bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.