Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Bu yöntem, nötrofiller, monositler ve dendritik hücreler dahil olmak üzere miyeloid hücrelerin üretimini ve işlevini inceleyen hematologlar ve immünologlar için yararlı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, miyeloid progenitör alt kümelerinin önceki stratejilere göre daha kesin bir şekilde tanımlanmasını sağlamasıdır. Manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama veya MACS ile progenitörler için kemik iliği hücrelerini zenginleştirmek için, hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve peleti, yedi kemik iliği hücresine bir kez 10 kez 40 mikrolitre MACS boyama tamponunda yeniden süspanse edin.

Farklılaşmış soy pozitif hücreleri tüketmek için, yedi hücreye bir kez 10'da bir kez 10 mikrolitre biyotin antikor kokteyli ekleyin ve dört santigrat derecede 10 dakikalık bir inkübasyon için pipetleyerek karıştırın. İnkübasyonun sonunda, karıştırma ile yedi hücreye bir kez 10'da 30 mikrolitre boyama tamponu ekleyin, ardından yedi hücreye bir kez 10'da 20 mikrolitre anti-biyotin mikroboncuk ekleyin. Dört santigrat derecede 15 dakika sonra, hücreleri bir kere 10 ila yedi hücreye bir mililitre boyama tamponu ile yıkayın ve peleti 500 mikrolitre taze boyama tamponunda bir kez 10 ila sekiz hücreye kadar yeniden süspanse edin.

Ardından, otomatik manyetik ayırıcıyı üreticinin talimatlarına göre ayarlayın ve etiketli hücrelerden oluşan tüpü ayırıcıya yerleştirin. Progenitörle zenginleştirilmiş soy negatif hücrelerini içeren negatif fraksiyonu toplamak için negatif seçim programına başlayın. Soy negatif hücrelerini santrifüjleme ile peletleyin ve şimdi beyaz olan peleti, sayma için fare başına iki mililitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin.

Miyeloid progenitör hücreleri FACS ile izole etmek için, voltaj seçimi ve renk telafisi için sekiz kontrol mikrosantrifüj tüpünün her birine beşinci soy negatif hücrelerine bir kez 10 ekleyin ve hücre örneğinin geri kalanını dokuzuncu bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin progenitör tanımlama ve sıralama için ilgilenilen yedi yüzey işaretleyici antikorun tümü ile boyama. Hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve kontrol peletlerini 100 mikrolitre FACS boyama tamponunda ve deneysel numune peletini altı hücreye beş kez 10 kez 10 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, Fc gama reseptörü tek boyama tüpüne ve numune tüpüne anti-CD16 / CD32 antikoru ekleyin.

Nazikçe girdap yapın ve numuneleri dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, diğer antikorları uygun karşılık gelen tek leke tüplerine ve numune tüpüne ekleyin ve hafifçe girdaplamadan sonra, numuneleri dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, santrifüjleme için numune tüpüne kontrol tüplerine 900 mikrolitre boyama tamponu ve yedi hücreye bir kere 10 kere bir mililitre boyama tamponu ekleyin.

Kontrol peletlerini tüp başına 200 mikrolitre taze boyama tamponunda ve deneysel peleti 500 mikrolitrede 2.5 çarpı 10 ila yedi hücreye yeniden süspanse edin ve etiketli hücreleri karşılık gelen beş mililitre FACS tüplerine aktarın. Ardından akış sitometresini standart protokollere göre ayarlayın ve voltajları ve renk telafilerini ayarlamak için lekesiz ve tek lekeli kontrolleri kullanın. Miyeloid progenitör hücreleri tanımlamak ve izole etmek için, deneysel hücre örneğini sitometreye yükleyin ve döküntüleri ve ölü hücreleri dışlamak için geçitli bir ön saçılma alanına karşı yan saçılma alanı grafiği oluşturun.

Çiftleri dışlamak için canlı hücrelerin ve geçidin ileri dağılım genişliğine karşı bir ön dağılım yüksekliği grafiği oluşturun. Bu işlemi, çiftleri hariç tutmak için yan saçılma yüksekliğine karşı yan saçılma genişliği, ileri dağılım tekillerinin ve kapısının grafiği ile tekrarlayın. c-Kit pozitif Sca-1 negatif progenitörlerini seçmek için bir Sca-1'e karşı c-Kit grafiği ve kapısı oluşturun.

Ardından, karışık ortak miyeloid progenitör ve karışık granülosit monosit progenitör popülasyonlarını seçmek için bir CD-34'e karşı FC gama reseptörü grafiği ve kapısı oluşturun. Karışık ortak miyeloid progenitör ve karışık granülosit monosit progenitör popülasyonlarını mümkün olduğunca kesin bir şekilde kapatmak önemlidir. Daha doğru geçit için sahte bir renk yoğunluğu grafiği veya bir kontur grafiği kullanmak yardımcı olabilir.

miyeloid progenitör Flt3 pozitif CD115 düşük hücrelerini, ortak miyeloid progenitör Flt3 negatif CD115 düşük hücrelerini ve Flt3 pozitif CD115 yüksek monosit dendritik hücre progenitörlerini seçmek için bir CD3 ve Flt3 grafiği oluşturmak için karışık ortak miyeloid progenitör kapısındaki hücreleri kullanın. Ly6C'ye karşı FC Gama reseptörü grafiği oluşturmak için karışık granülosit monosit progenitör kapısındaki hücreleri ve Ly6C negatif hücreleri ve Ly6C pozitif hücreleri seçmek için kapıyı kullanın. Ardından, her kapılı karışık granülosit monosit progenitör hücre alt popülasyonu için bir CD115'e karşı Flt3 grafiği oluşturun ve Ly6C negatif Flt3 negatif CD115 düşük granülosit monosit progenitörlerini, Ly6C pozitif Flt3 negatif CD115 düşük granülosit progenitörlerini ve Ly6C pozitif Flt3 negatif CD115 yüksek monosit progenitörlerini geçit edin.

Maksimum soy tükenmesi, farklılaşmış hücrelerin tükenmesinde ve c-Kit pozitif progenitör hücreler için zenginleştirmede etkilidir. Soy negatif fraksiyonu hala bazı c-Kit negatif hücreler içerir, ancak bu hücreler sonraki akış sitometrisi geçit adımlarında elimine edilecektir. FACS sıralamasından sonra progenitör verimleri, kullanılan sıralayıcı ayarlarına bağlı olarak değişebilir, ancak her bir fraksiyon için %95'ten daha büyük bir sıralama sonrası saflık ile her fareden fraksiyon başına bir ila dört kez 10 ila dördüncü hücre elde etmek mümkün olmalıdır.

Popülasyonların temiz bir şekilde ayrılması için iyi boyama kritik öneme sahiptir. Optimal ayrımı sağlamak için antikorları titre etmeniz veya farklı floroforlar seçmeniz gerekebilir. Bu protokol, numuneler arasındaki kemik iliği bileşimindeki farklılıkları değerlendirmek, moleküler analiz için progenitörleri izole etmek veya miyeloid hücreler üretme yeteneklerini değerlendirmek için progenitör hücreleri tanımlamak için kullanılabilir.