Name: Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Öğrenin fare kemik iliğinden miyeloid progenitör hücrelerini MACS ve FACS teknikleriyle izole etme yöntemini. Bu protokol hematoloji ve immünoloji araştırmalarında altı farklı hücre alt kümesinin ayrıştırılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu iletişim kuralı bir Amerikan Immunologists Derneği (için AY ve HSG) İmmünoloji dostluk kariyer ve bilim adamı Ödülü'bir para yönetim kurulu, Vali Rejeneratif Tıp Enstitüsü Cedars-Sinai Tıp Merkezi (HSG), kullanılarak geliştirilen Hematoloji (AY için) American Society. Akış Sitometresi çekirdek Cedars-Sinai Tıp Merkezi FACS sıralama ile yardım için teşekkür.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Cedars-Sinai Tıp Merkezi tarafından kabul edildi.
1. yalıtım fare kemik iliği ve bir tek hücre süspansiyon hazırlanması
<ol><li>Kurumsal yönergelere uygun olarak fare ötenazi.</li>
	<li>Sırtında euthanized fareyi getirin ve % 70 etanol (alkol) ile sprey. Keskin, sivri uçlu makas ve cilt legs--dan kaldırmak ve kas ve kemik maruz doğru beden yukarı çekin bir küçük (3-5 mm) kesik ayak bileği düzey kullanarak her hind bacak içinde olun.</li>
	<li>(Kuadriseps, hamstrings, vb) kas kemik yönünü takip makasla çıkararak kemiklerden kaldırın. Kemikleri zarar vermemeye dikkat et.</li>
	<li>Uyluk dan kalça eklem yerinden çıkar ve bağ doku ve kas kemik kesmemeye dikkat bacaklar, ayırmak için kes gitsin.</li>
	<li>Ayak ayak bilekleri yırtılmalarıteşhis dan çıkartacak tarafından kaldırmak, kemikleri steril PBS veya ortam bir tüp içinde yerleştirin ve onları buz doku kültürü odasına taşımak. Not: Bazı diğer uygulamalar (makrofajlar toplam kemik iliği hücrelerden TüretmeninÖrneğin, ) için kemikleri buz üzerinde bir süre için terk etmek mümkündür, ancak progenitör yalıtım için bir downregülasyon önlemek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde devam etmek önemlidir önemli yüzey işaretleyicileri (özellikle CD115).</li>
	<li>Bir Biyogüvenlik kabini, kalan herhangi bir yumuşak doku kağıt mendil ile sürtünme tarafından kemiklerden kaldırın. Not: steril bir örnek FACS sıralama sonra hücre kültür ve in vivo deneyleri için gerekliyse protokol bir Biyogüvenlik kabini gerçekleştirilmesi gerekiyor. Steril hücreler gerekli değildir eğer, tüm süreç laboratuvarı tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Kısaca %70 kemiklerde bırakın onları ve o zaman steril PBS onları yıkamak için dezenfekte alkol.</li>
	<li>Kalça diz ile kesme tarafından yırtılmalarıteşhis ve fibulas ayrı ve fibulas atın.</li>
	<li>Kemikler kapalı uçları keskin makasla kesme.</li>
	<li>Kemikleri beyaz görününceye kadar kemik iliği soğuk steril PBS ile aşağıdaki gibi hasat:<ol>
<li>Her kemik forseps ile kavrama ve bir ucunda kemik mili içine soğuk steril PBS içeren bir 10 mL şırınga bağlı 26 G iğne yerleştirin.</li>
		<li>Kemik 50 mL santrifüj tüpü yukarıda tutun ve 2-5 mL PBS üzerinden kemik kemik iliğini temizlemek.</li>
		<li>Tüm 4 bones fare (2 uyluk ve 2 yırtılmalarıteşhis) başına gelen kemik iliğini.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı bir hücre süspansiyon oluşturmak için kemik iliği disaggregate için bir 1 mL pipet pipet.</li>
	<li>Bir parça kemik parçaları ortadan kaldırmak ve toplamları, böylece bir tek hücre süspansiyon üreten hücre 30 mikron naylon mesh ile kemik iliği süspansiyon filtre.</li>
	<li>Santrifüj tek hücre süspansiyon 280 x g de 5 dk ve resuspend hücre Pelet steril boyama arabelleği (PBS + %0.5 FBS + 2 mM EDTA), 5 mL (Örneğin, uyluk ve yırtılmalarıteşhis 2 farelerin havuza alınmış hücreler için 10 mL) fare başına arabellek boyama kullanarak.</li>
	<li>10 μL örnek aliquot al, 10 μL ile karıştırarak Trypan mavi ve yük 10 μL elde edilen Trypan mavi etiketli örnek bir hemasitometre için. Hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Not: hücreleri çok güvenilir sayım için konsantre iseniz, Trypan mavi eklemeden önce örnek oranında seyreltin.</li>
</ol>2. yaratıcı zenginleştirme manyetik aktif hücre (Mac) sıralama
<ol><li>Tüm tek hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi (veya çok sayıda hücreler olarak istenen verim elde etmek için gerekli) 280 x g 4° C ve resuspend hücre Pelet 40 yılında 5 min için de 107 hücre başına arabellek (PBS + %0.5 FBS + 2 mM EDTA) boyama μL. Not: Ayrıca soy tükenmesi Seti üreticisi arabelleğinden MAC'ler kullanmak mümkündür (bkz. Tablo reçetesi) boyama arabellek alternatif olarak.</li>
	<li>Soy tükenmesi soy tükenmesi kit ile sağlanan yönergelere göre gerçekleştirin. Malzemeler tablogördüm kit için aşağıdaki yönergeler içindir. Farklı bir kit kullandıysanız, üreticinin yönergeleri izleyin ve 2.3 tutamaçlarından.<ol>
<li>10 μL biotin-antikor kokteyl başına 107 hücreleri eklemek, pipetting tarafından mix ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
		<li>30 μL eklemek arabellek/MAC'ler boyama tampon başına 107 hücre ve karıştırın.</li>
		<li>20 μL Anti-biotin lastikteki 107 hücre başına ekleyin. İyice karıştırın ve bir ek 15 dk 4 ° C'de için kuluçkaya Not: girdap onları hücrelere eklemeden önce lastikteki onlar tamamen dağınık emin olmak için.</li>
		<li>280 x g 5 dk ve resuspend 500 μL boyama arabellek/MAC'ler hücre Pelet arabellek için ilâ 108 hücre, hücre santrifüj kapasitesi, 1 mL 107 hücre başına arabellek/MAC'ler arabellek boyama ekleyin. 10'dan fazla8 hücreler için arabellek/MAC'ler arabellek buna göre boyama sesini çap.</li>
		<li>Otomatik manyetik ayırıcı üretici yönergelerine göre hazırlayın.</li>
		<li>Etiketli hücreleri ayırıcı içeren tüpü yerleştirin ve negatif seçim programı seçin.</li>
		<li>Dede-zenginleştirilmiş lineage negatif (LIN-) hücreleri içeren olumsuz kesir toplamak. Manyetik olarak etiketli soy-pozitif hücreleri içeren olumlu kesir atmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lin- hücreleri 280 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet fare (Örneğin, 4 Eğer kemik iliği 2 fareler havuzlu mL) başına arabellek/MAC'ler arabellek boyama 2 ml resuspend. Not: eritrositler tükenmiş çünkü Pelet şimdi yerine kırmızı beyaz olmalıdır.</li>
	<li>10 μL Lin- hücreleri aliquot al, 10 μL ile karıştırarak Trypan mavi ve yük 10 μL elde edilen Trypan mavi etiketli örnek bir hemasitometre için. Hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Not: hücreleri çok güvenilir sayım için konsantre iseniz, Trypan mavi eklemeden önce örnek oranında seyreltin.</li>
</ol>3. miyeloid progenitör kimlik ve yalıtım floresans aktif hücre (FACS) sıralama
<ol><li>Etiket 9 microcentrifuge (1,5 veya 2 mL) tüpler için: 1) hücreleri, 2-8 günahı) hücreleri tek FcγR (CD16/32), karşı antikor fluorophore Birleşik ile lekeli c-Kit, CD34, Flt3 Sca-1 (CD135), Ly6C ve CD115 için voltaj seçimi ve renk tazminat ve 9) örnek hücreleri progenitör kimlik ve sıralama için tüm 7 antikorlar ile lekeli.</li>
	<li>Her kontrol tüpleri (Tüpler 1-8), 100.000 hücreleri ve tüm kalan hücreleri (veya daha az arzu edilirse) örnek tüp (tüp 9) dağıtın. Not: numune hacmi 1.5-2 mL büyükse, örnek hücreleri 15 mL tüp içine dağıtmak, onları santrifüj kapasitesi ve Pelet (adım 3.3 aşağıda) resuspend ve o zaman microcentrifuge Tube sonraki boyama adımlar için hücreleri transferi gerekli olabilir.</li>
	<li>1500 x g 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve denetim tüp granül 100 μL resuspend tampon (PBS + %0.5 FBS + 2 mM EDTA) ve 100 μL örnek tüp Pelet boyama 5 x 106 başına arabellek boyama hücreleri (Örneğin, 1 x 107 hücreler için 200 μL).</li>
	<li>2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 FcγR tek leke tüp ve örnek tüp ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya girdap Not: Rekabet nedeniyle non-spesifik antikor Fc-aracılı bağlama önlemek için diğer antikorlar eklemeden önce FcγR (CD16/32) antikor örnek hücrelerle leke önemlidir. Hücreleri bir FcγR reaktif engelleme kuluçkaya değil.</li>
	<li>Karşılık gelen tek leke tüpler (1 her antikor) ve örnek tüp (tüm 6 antikorlar) diğer antikorlar eklemek: 10 μg/mL c-Kit-Pasifik mavi, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3 APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 ve 4 μg/mL CD115-PE. Girdap yavaşça ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>900 μL boyama arabelleğe kontrol tüpleri ve 1 mL örnek tüpü 107 hücrelere başına boyama arabellek ekleyin. Senaryo Özeti 5 min için 1.500 x g santrifüj kapasitesi ve tampon boyama içinde hücre Pelet resuspend: denetim tüp başına 200 μL ve 500 μL örnek tüp 25 x 106 hücre başına. Resuspended hücreleri 5 mL FACS tüpler için transfer. Not: numune hacmi 1.5-2 mL büyükse, bir 15 mL tüp Santrifüjü için hücreleri aktarmak gerekli olabilir.</li>
	<li>Üreticinin yönergelerine göre akış sitometresi (Analyzer'ı veya Sıralayıcı) hazırlayın.</li>
	<li>Günahı ve tek gerilimleri ve renk tazminatlar ayarlamak için akış sitometresi ile kontrol hücreleri lekeli çalıştırın.</li>
	<li>Örnek hücreleri çalıştırmak, dede alt kümeleri aşağıda özetlenen ve Şekil2 Özet olarak kapı ve istenirse, ilgili progenitör alt kümeleri yalıtmak için sıralama FACS gerçekleştirmek. Not: Her progenitör kapısı en az 1000 olayları almak için yaklaşık 200.000 hücreleri elde etmek genellikle gereklidir.<ol>
<li>FSC-A (x) ve SSC-A (y ekseni), görüntüleme tüm hücrelerin bir nokta çizim oluşturma ve enkaz ve ölü hücreleri dışlamak için kapı = > "canlı" hücreleri.</li>
		<li>Bir nokta çizim "canlı" hücre FSC-H (x ekseni) ve FSC-W (y ekseni), görüntüleme, oluşturma ve birini dışlamak için kapı = > Canlı/singlet (FSC) kapısı.</li>
		<li>Canlı/singlet bir nokta Arsa (FSC) hücreleri SSC-H (x ekseni) ve SSC-W (y ekseni), görüntüleme, oluşturma ve birini dışlamak için kapı = > Canlı/singlet (FSC) / singlet (SSC) kapısı.</li>
		<li>Canlı/singlet (FSC), bir nokta çizim oluşturma / singlet (SSC) hücreleri, ani kalp durması-1 (x ekseni) ve c-Kit (y ekseni), görüntüleme ve ani kalp durması c-Seti+ -- 1 hücreleri seçmek için kapı = > LKS- hücreleri.</li>
		<li>CD34 görüntüleme LKS- hücrelerinin bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve FcγR (y ekseni) ve kapı CD34 seçmek için+ FcγRlo hücreleri = > "CMPs" ve CD34+ FcγRMerhaba hücreleri = > "GMPs". Not: Mümkün olduğunca kapı "CMPs" ve "GMPs" tam olarak önemlidir. O bir yalancı yoğunluğu arsa veya bir dağılım komplo doğru geçişi için kullanmak yararlıdır.</li>
		<li>"CMPs" CD115 görüntüleme, bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve Flt3 (y ekseni) ve kapı seçmek için: Flt3+ CD115lo hücreleri = > Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3+ CD115lo hücreleri, Flt3- CD115lo hücreleri = > Cumhuriyetçi millet partisi -- Flt3 hücreleri, Flt3+ CD115Merhaba hücreleri = > MDP'ler.
</li>
		<li>"GMPs" Ly6C görüntüleme, bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve FcγR (y ekseni) ve kapı Ly6C seçmek için-hücreleri = > "GMP-Ly6C- hücreleri" ve Ly6C+ hücreleri = > "GMP-Ly6C+ hücreleri".</li>
		<li>"GMP-Ly6C- hücre CD115 görüntüleme", bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve Flt3 (y ekseni) ve kapı seçmek için: Flt3- CD115lo hücreleri = > GMPs.
</li>
		<li>"GMP-Ly6C+ hücre CD115 görüntüleme", bir nokta çizim oluşturma (x ekseni) ve Flt3 (y ekseni) ve kapı seçmek için: Flt3- CD115lo hücreleri = > GPs, Flt3- CD115Merhaba hücreleri = > MPs + cMoPs.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li>
<li>Yáñez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li>
<li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Yáñez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Fare miyeloid progenitör kimlik1 için strateji çoğunluğuna Weissman immunologists için altın standart ve hematologlar yaklaşık 20 yıl olmuştur, ama şimdi "Cumhuriyetçi millet partisi" ve "GMP" kapıları çok heterojen ve daha kesin belirgin Perdeleme stratejileri ihtiyaç vardır. Burada tarif var Protokolü oligopotent ve soy için kabul edilen alt kümeleri belirli miyeloid CSF'den daha kesin miktar ve eşleme myelopoiesis yollar, hem de incelenmesi için C57BL/6J farelerde izin verir moleküler mekanizma...

Monosit, nötrofil ve dendritik hücreler (DC) esas olarak kemik iliği hematopoetik ataları myelopoiesis adı verilen bir işlem tarafından ortaya miyeloid hücrelerdir. Ortak miyeloid ataları (CMPs) myeloid hücrelerin yanı sıra megakaryocytes ve eritrositler ama değil lenfoid hücre üretmek potansiyeline sahip. CMPs türetilmiştir, granülosit-monosit ataları (GMPs), granülosit ve monosit üretmek, ama megakaryocyte ve eritrosit potansiyel kaybettik. Monosit ve klasik ve plazmasitoid DCs (KGK/PDC'ler) da ortak ataları CMPs. kademeli kısıtlama lineage potansiyel sonuçta sonuçları lineage kaydedilmiş tarafından üretilen monosit-DC ataları (MDP'ler) olarak bilinen kaynaklanan için düşündüm ataları: granülosit ataları, monosit ataları ve dendritik hücre ataları (Şekil 1).
Weissman ve meslektaşları bildirdi CMPs Lin- c-Kit ile+ ani kalp durması-1- (LKS-) CD34 bulunur+ FcγRlo kısmını fare kemik iliği GMPs LKS- CD34 yer alır iken,+ FcγR Merhaba Kesir1. Ancak, bu "Cumhuriyetçi millet partisi" ve "GMP" kesirler çok heterojen bulunmaktadır. Örneğin, "GMP" kesir Ayrıca lineage için kabul edilen granülosit ataları ve monosit ataları1,2içerir. MDP'ler ayrı ayrı CX3CR1 olmak rapor+ Flt3+ CD115+ da CD34 ve FcγR3,4ifade ataları. MDP'ler ortaya çıkmasına neden olan c-Kit (CD117) düzeyi düşük hızlı bildirilmiştir cDC/pDC-üreten ortak DC ataları için (CDP) ve LKS- Kesir5dahil değil.
Monosit bir tek yol (CMP-GMP-MDP-monosit) yolu ile ortaya daha önce kabul edildi. (Monosit ataları, MPs adlı) GMPs tarafından üretilen bu model, monosit olarak kaydedilmiş ataları ile tutarlı2 ve MDP'ler (ortak monosit ataları, cMoPs adlı)6 gibi görünüyor aynı hücre temelinde paylaşılan yüzey marker ifade . Ancak, biz son zamanlarda monosit bağımsız olarak GMPs ve MDP'ler tarafından üretilmektedir gösterdi ve MPs ve cMoPs tek hücreli RNA sıralama7tarafından ayırt başardık.
Weissman "Cumhuriyetçi millet partisi" ve "GMP" perdeleme strateji C57BL/6J fare kemik iliği farklı oligopotent ve myeloid progenitör lineage için kabul edilen alt kümeleri içeren 6 subfractions tanımlamak için değiştirilen. Biz ilk Ly6C ve CD115 boyama oligopotent GMPs, hem de granülosit ataları (GPs) ve monosit ataları (MPs ve ayırmak Şu anda açamayacaklar cMoPs) yalıtım izin verir rapor "GMP" Kesir2 (LKS - CD34+ FcγRMerhaba kapısı; Şekil 1). Daha sonra MDP'ler ağırlıklı olarak "CMP" kesir bulundu gösterdi (LKS- CD34+ FcγRlo kapısı), ayrıca Flt3 içeren+ CD115lo ve Flt3- alt kümeleri7 (resim 1 ). CMP Flt3+ CD115lo kesir GMPs ve MDP'ler evlatlık transfer verimleri. Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3- alt CMP-Flt3+ CD115lo hücreler ve GMPs arasındaki ara ürün olarak görünmesini ataları içerir. MDP'ler farklı olarak, hem Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3+ CD115lo ve Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3- kesirler de megakaryocyte ve eritrosit potansiyel bulunmamaktadır.
Ancak, ister gerçekten oligopotent (nötrofil, sahipÖrneğin, tek tek hücreleri içinde CMP Flt3+ CD115lo kesir vardır ataları "CMP" kesirler içeren şu anda belirsiz olduğuna dikkat etmek önemlidir monosit, DC, megakaryocyte ve eritrosit potansiyel), veya alternatif olarak, CSF'den daha sınırlı lineage potansiyeli olan karışımı kapsayabilir. Deneyleri (methylcellulose kültürleri) oluşturan colony CMP-Flt3+ CD115lo ve Cumhuriyetçi millet partisi-Flt3- kesirler1 hücreler granülosit (nötrofil), eritrosit, monosit ve megakaryocyte potansiyel (et hücreleri) "CMP", içinde olduğu ortaya çıktı ,7, ama DC potansiyeli değerlendirmesi izin vermez. Buna ek olarak, deneyleri oluşturan colony "GMP" Kesir1,2oligopotent GMPs (nötrofil ve monosit potansiyel ile ataları) varlığını gösterdi ve bu son tek hücre tarafından desteklenmektedir transcriptomic analiz8. Bu oligopotent GMPs da diğer granülosit (eozinofil, bazofil ve mast hücreleri) üretmek olup olmadığını şu anda, ancak, bilinmemektedir.
Bu çalışmalar, biz şimdi göstermek dayalı nasıl 7 işaretleri (c-Kit, ani kalp durması-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C ve CD115) yüzey tanımlanmasını ve yalıtılmasını oligopotent ve soy için kabul edilen miyeloid ataları 6 Bu alt kümeleri kullanılabilir. Burada açıklanan protokol vitro kültürü deneyleri (kültür) methylcellulose ya da sıvı, uygulanabilir vivo içinde evlat edinen transfer deneylerde fare ve moleküler analiz (toplu ve tek hücreli RNA sıralama, Western blot, vb).
İletişim kuralı 3 etap oluşur: 1) hazırlanması bir tek hücre süspansiyon kemik iliği hücreleri, 2) zenginleştirme hematopoetik ataları (manyetik aktif hücre sıralama) ve 3) tanıma ve istenirse progenitör alt kümeleri akımını, yalıtım sitometresi (bir çözümleyici veya bir sıralayıcısı uygun şekilde kullanarak). İlk adım kalça kemik iliği hücre izolasyon ve ötenazi farelerin yırtılmalarıteşhis ve diğer yukarıda açıklanan protokoller9' a benzer. Daha sonra örnek farklılaşmış hücreler tüketmek için bir kokteyl hücre yüzey işaretleyicileri, eritrositler, nötrofiller, monosit, lenfositler, vb karşı antikorların kullanarak kök ve progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir. Bu, ancak önerilir hafiye-in yaratıcı alt kümelerini en iyi duruma getirme ve progenitör kimlik için gerekli antikor ve akış sitometresi için gereken süre miktarını azaltmak için zorunlu değildir. Soy tükenmesi iletişim kuralı aşağıdaki Magnetic-Activated hücre sıralama (Mac) bir fare Lineage hücre tükenmesi Kit kullanarak açıklar (CD5, CD45R karşı biotinylated antikor içeren (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 ve Ter-119, artı Anti-biotin lastikteki) ve otomatik bir manyetik ayırıcı. Son adım tanımlamasıdır (ve sıralama, istenirse) akış sitometresi tarafından progenitör alt kümeleri olan. Aşağıda açıklanan antikor paneli (Ayrıca bkz: Tablo 1) bir akış sitometresi (Analyzer'ı veya Sıralayıcı) 4 lazerler ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Şekil 1: nötrofil, monosit ve DC ataları ve ayırt etme yolları. Myelopoiesis7 ' nin son zamanlarda gözden geçirilmiş modeli "CMPs" (mavi) ve "GMPs" (yeşil)1 overlaid Weissman gates ile gösterilmektedir. Bu rakam Yáñez vd 20177' den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Fare: Vahşi tip C57BL / 6J (CD45.2)</td> <td>Jackson Laboratuvarları Kedi</td><td># JAX: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Soy Hücresi Tükenme Kiti, fare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Kedi # 130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD34 (klon RAM34) FITC</td><td>BD Biosciences Kedi</td><td># 553733</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD16 / CD32 (Fc & gama; R; klon 93) APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Kedi # 101327</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare Ly6A/E (Sca-1; klon 108113) PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Kedi # 108114</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD117 (c-Kit; klon 2B8) Pasifik Mavisi</td><td>BioLegend</td><td>Kedi # 105820</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare Ly6C (klon HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>Kedi #128012</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD115 (klon AFS98) PE</td><td>Biyo Efsanesi</td><td>Kedi # 135506</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD135 (Flt3; klon A2F10.1) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>Kedi # 560718</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Mutlak Sayma Boncukları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat # C36950</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>"tükenmiş" programı kullanın</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 lazer, 15 renk</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III hücre sıralayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 lazer, 13 renk</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>https://www.flowjo.com</td><td>.fcs dosyalarının daha fazla analizi için</td></tr></tbody></table>

kimlik ve yalıtım oligopotent ve lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Nötrofiller, monosit ve dendritik hücreler (DC) verim miyeloid ataları tespit ve hematolojik ve immünolojik analizleri farelerin kemik iliği dan izole. Örneğin, uygulama miyeloid progenitör nüfus hücresel ve moleküler özelliklerinin lösemik dönüştürme altında yatan mekanizmaları ortaya veya patojen maruz bağışıklık sistemin nasıl yanıt vereceğini gösterir. Daha önce açıklanan akış sitometresi stratejileri miyeloid progenitör tanımlama için birçok alanda önemli gelişmeler etkinleştirdim, ancak onlar tespit kesirler çok heterojen bulunmaktadır. En sık kullanılan gating stratejileri için istenen nüfus zenginleştirilmiş, ama aynı zamanda "bulaşıcı" ataları çok sayıda içeren kemik iliği kesirler tanımlayın. Bizim son yıllarda yapılan çalışmalarda bu heterojenlik çoğunu çözmüş ve ruhsatı burada mevcut protokol oligopotent 6 altgrupları yalıtım ve soy için kabul edilen miyeloid ataları 2 daha önce kemik iliği kesirler açıklanan. 3 kademeli protokolünü açıklar: 1) yalıtım kemik iliği hücreleri, hematopoetik ataları tarafından manyetik aktif hücre (soy tükenmesi MAC'ler tarafından) sıralama ve 3) akış sitometresi (dahil tarafından miyeloid progenitör alt kümeleri tanımlaması için zenginleştirme 2) floresans aktif hücre), sıralama FACS, isterseniz. Bu yaklaşım progenitör miktar ve yalıtım uygulamaları içinde in vitro ve in vivo çeşitli için izin verir ve zaten yolları ve nötrofil ve monosit DC farklılaşma mekanizmalarının içine roman fikir vermiştir.

Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, kalça ve yırtılmalarıteşhis (2 bacaklar) bir C57BL/6J fare (6-8 hafta yaşlı, erkek veya kadın) (kırmızı kan hücreleri veya ~ 50 milyon çekirdekli hücre de dahil olmak üzere) ~ 100 milyon hücre elde etmek mümkündür. 1-2 milyon Lin- hücreleri fare Lin+ hücreleri MAC'ler tükenmesi tarafından ayrılmış olabilir.
Her biri 6 miyeloid progenitör alt kümeleri Lin % ~ ...

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Bu yöntem, nötrofiller, monositler ve dendritik hücreler dahil olmak üzere miyeloid hücrelerin üretimini ve işlevini inceleyen hematologlar ve immünologlar için yararlı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, miyeloid progenitör alt kümelerinin önceki stratejilere göre daha kesin bir şekilde tanımlanmasını sağlamasıdır. Manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama veya MACS ile progenitörler için kemik iliği hücrelerini zenginleştirmek için, hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve peleti, yedi kemik iliği hücresine bir kez 10 kez 40 mikrolitre MACS boyama tamponunda yeniden süspanse edin.Farklılaşmış soy pozitif hücreleri tüketmek için, yedi hücreye bir kez 10'da bir kez 10 mikrolitre biyotin antikor kokteyli ekleyin ve dört santigrat derecede 10 dakikalık bir inkübasyon için pipetleyerek karıştırın. İnkübasyonun sonunda, karıştırma ile yedi hücreye bir kez 10'da 30 mikrolitre boyama tamponu ekleyin, ardından yedi hücreye bir kez 10'da 20 mikrolitre anti-biyotin mikroboncuk ekleyin. Dört santigrat derecede 15 dakika sonra, hücreleri bir kere 10 ila yedi hücreye bir mililitre boyama tamponu ile yıkayın ve peleti 500 mikrolitre taze boyama tamponunda bir kez 10 ila sekiz hücreye kadar yeniden süspanse edin.Ardından, otomatik manyetik ayırıcıyı üreticinin talimatlarına göre ayarlayın ve etiketli hücrelerden oluşan tüpü ayırıcıya yerleştirin. Progenitörle zenginleştirilmiş soy negatif hücrelerini içeren negatif fraksiyonu toplamak için negatif seçim programına başlayın. Soy negatif hücrelerini santrifüjleme ile peletleyin ve şimdi beyaz olan peleti, sayma için fare başına iki mililitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin.Miyeloid progenitör hücreleri FACS ile izole etmek için, voltaj seçimi ve renk telafisi için sekiz kontrol mikrosantrifüj tüpünün her birine beşinci soy negatif hücrelerine bir kez 10 ekleyin ve hücre örneğinin geri kalanını dokuzuncu bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin progenitör tanımlama ve sıralama için ilgilenilen yedi yüzey işaretleyici antikorun tümü ile boyama. Hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve kontrol peletlerini 100 mikrolitre FACS boyama tamponunda ve deneysel numune peletini altı hücreye beş kez 10 kez 10 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, Fc gama reseptörü tek boyama tüpüne ve numune tüpüne anti-CD16 / CD32 antikoru ekleyin.Nazikçe girdap yapın ve numuneleri dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, diğer antikorları uygun karşılık gelen tek leke tüplerine ve numune tüpüne ekleyin ve hafifçe girdaplamadan sonra, numuneleri dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, santrifüjleme için numune tüpüne kontrol tüplerine 900 mikrolitre boyama tamponu ve yedi hücreye bir kere 10 kere bir mililitre boyama tamponu ekleyin.Kontrol peletlerini tüp başına 200 mikrolitre taze boyama tamponunda ve deneysel peleti 500 mikrolitrede 2.5 çarpı 10 ila yedi hücreye yeniden süspanse edin ve etiketli hücreleri karşılık gelen beş mililitre FACS tüplerine aktarın. Ardından akış sitometresini standart protokollere göre ayarlayın ve voltajları ve renk telafilerini ayarlamak için lekesiz ve tek lekeli kontrolleri kullanın. Miyeloid progenitör hücreleri tanımlamak ve izole etmek için, deneysel hücre örneğini sitometreye yükleyin ve döküntüleri ve ölü hücreleri dışlamak için geçitli bir ön saçılma alanına karşı yan saçılma alanı grafiği oluşturun.Çiftleri dışlamak için canlı hücrelerin ve geçidin ileri dağılım genişliğine karşı bir ön dağılım yüksekliği grafiği oluşturun. Bu işlemi, çiftleri hariç tutmak için yan saçılma yüksekliğine karşı yan saçılma genişliği, ileri dağılım tekillerinin ve kapısının grafiği ile tekrarlayın. c-Kit pozitif Sca-1 negatif progenitörlerini seçmek için bir Sca-1'e karşı c-Kit grafiği ve kapısı oluşturun.Ardından, karışık ortak miyeloid progenitör ve karışık granülosit monosit progenitör popülasyonlarını seçmek için bir CD-34'e karşı FC gama reseptörü grafiği ve kapısı oluşturun. Karışık ortak miyeloid progenitör ve karışık granülosit monosit progenitör popülasyonlarını mümkün olduğunca kesin bir şekilde kapatmak önemlidir. Daha doğru geçit için sahte bir renk yoğunluğu grafiği veya bir kontur grafiği kullanmak yardımcı olabilir.Ortak miyeloid progenitör Flt3 pozitif CD115 düşük hücrelerini, ortak miyeloid progenitör Flt3 negatif CD115 düşük hücrelerini ve Flt3 pozitif CD115 yüksek monosit dendritik hücre progenitörlerini seçmek için bir CD3 ve Flt3 grafiği oluşturmak için karışık ortak miyeloid progenitör kapısındaki hücreleri kullanın. Ly6C'ye karşı FC Gama reseptörü grafiği oluşturmak için karışık granülosit monosit progenitör kapısındaki hücreleri ve Ly6C negatif hücreleri ve Ly6C pozitif hücreleri seçmek için kapıyı kullanın. Ardından, her kapılı karışık granülosit monosit progenitör hücre alt popülasyonu için bir CD115'e karşı Flt3 grafiği oluşturun ve Ly6C negatif Flt3 negatif CD115 düşük granülosit monosit progenitörlerini, Ly6C pozitif Flt3 negatif CD115 düşük granülosit progenitörlerini ve Ly6C pozitif Flt3 negatif CD115 yüksek monosit progenitörlerini geçit edin.Maksimum soy tükenmesi, farklılaşmış hücrelerin tükenmesinde ve c-Kit pozitif progenitör hücreler için zenginleştirmede etkilidir. Soy negatif fraksiyonu hala bazı c-Kit negatif hücreler içerir, ancak bu hücreler sonraki akış sitometrisi geçit adımlarında elimine edilecektir. FACS sıralamasından sonra progenitör verimleri, kullanılan sıralayıcı ayarlarına bağlı olarak değişebilir, ancak her bir fraksiyon için %95'ten daha büyük bir sıralama sonrası saflık ile her fareden fraksiyon başına bir ila dört kez 10 ila dördüncü hücre elde etmek mümkün olmalıdır.Popülasyonların temiz bir şekilde ayrılması için iyi boyama kritik öneme sahiptir. Optimal ayrımı sağlamak için antikorları titre etmeniz veya farklı floroforlar seçmeniz gerekebilir. Bu protokol, numuneler arasındaki kemik iliği bileşimindeki farklılıkları değerlendirmek, moleküler analiz için progenitörleri izole etmek veya miyeloid hücreler üretme yeteneklerini değerlendirmek için progenitör hücreleri tanımlamak için kullanılabilir.

identification-isolation-oligopotent-lineage-committed-myeloid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Burada, Mezodermal Progenitör Hücreleri (MPC'ler) insan kemik iliğinden (hBM) izole etmek için optimize edilmiş, yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü açıklıyoruz. MPC'ler akım sitometrisi ve nestin ekspresyonu ile karakterize edildi. Anjiyojenik potansiyellerini korurken katlanarak büyüyen MSC benzeri hücre kültürlerine yol açma yeteneğini gösterdiler.

İnsan Kemik İliği gelen Yalıtımlı Mesangiogenic Ata Hücreleri (MPCs)

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Burada fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R hücre kültürünü kültür, viral enfeksiyonlar gerçekleştirme ve yayılmasını önleme ve farklılaşma deneyleri için detaylı protokol sunulmuştur. Bu hücre kültürünü myeloid hücre gelişimini ve myeloid hücre büyümesi ve Nötrofilik farklılaşma ilgi genlerin rol çalışmak için uygundur.

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Burada, erken patlama oluşturan birim eritroid (BFU-e) ve koloni oluşturan birim eritroid (CFU-e) progenitörlerinin doğrudan taze fare kemik iliği ve dalağından prospektif izolasyonu için yeni bir akış sitometrik yöntemi tanımladık. Tek hücreli transkriptomik verilere dayanarak geliştirilen bu protokol, dokunun tüm eritroid progenitörlerini yüksek saflıkta izole eden ilk protokoldür.

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.

Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi

Öğrenin fare kemik iliğinden miyeloid progenitör hücrelerini MACS ve FACS teknikleriyle izole etme yöntemini. Bu protokol hematoloji ve immünoloji araştırmalarında altı farklı hücre alt kümesinin ayrıştırılmasını sağlar.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Daha fazla video keşfet